超聲波輔助醇提法提取梔子中梔子黃色素

陳莎莎 曹如濤 林繼輝

摘要：提高梔子果中梔子黃色素的提取率對后期梔子黃色素的精制及應(yīng)用具有積極促進(jìn)作用。該研究旨在建立一種從梔子果實中提取梔子黃色素的有效經(jīng)濟(jì)方法。通過超聲輔助法研究梔子果實中粒度、提取時間、提取溫度、提取劑濃度及液料比對梔子黃色素提取率的影響，基于單因素實驗結(jié)果，采用五因素三水平的響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以提高梔子黃色素的提取率。結(jié)果顯示，梔子黃色素的最佳提取工藝是提取時間31 min、提取溫度62 ℃、液料比25∶1、乙醇濃度48%、粒度80目。采用響應(yīng)面法優(yōu)化后的提取工藝，梔子黃色素實際平均提取率為18.36%，與響應(yīng)預(yù)測值18.38%相差0.02%，誤差為0.19%，誤差較小，說明該工藝具有良好的可靠性。與單因素實驗相比，優(yōu)化后的提取工藝將梔子黃色素的提取率從15.15%提高到18.36%，故優(yōu)化后的工藝有利于梔子黃色素的提取，具有實際應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：梔子果；梔子黃色素；超聲波；響應(yīng)面法；優(yōu)化

中圖分類號：TS202.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）12-0180-08

Extraction of Gardenia Yellow Pigment from Gardenia

by Ultrasonic-Assisted Ethanol Extraction Method

CHEN Sha-sha， CAO Ru-tao， LIN Ji-hui

（School of Life Sciences and Chemistry， Minnan Science and Technology

College， Nan'an 362332， China）

Abstract： Improving the extraction rate of gardenia yellow pigment from gardenia fruit has a positive effect on the purification and application of gardenia yellow pigment in the later stage. This study aims to establish an effective and economic method for extracting gardenia yellow pigment from gardenia fruit. Ultrasonic-assisted method is used to study the effects of particle size， extraction time， extraction temperature， concentration of extractant? and liquid-solid ratio on the extraction rate of gardenia yellow pigment. Based on the results of single factor experiment， the response surface method of five factors and three levels is used to optimize the extraction process， so as to improve the extraction rate of gardenia yellow pigment. The results show that the optimal extraction process of gardenia yellow pigment is extraction time of 31 min， extraction temperature of 62 ℃， liquid-solid ratio of 25∶1， ethanol concentration of 48% and particle size of 80 mesh. By using the extraction process optimized by response surface method， the actual average extraction rate of gardenia yellow pigment is 18.36%， which is 0.02% different from the predicted value of 18.38%， and the error is 0.19%. The error is small， indicating that the process has good reliability. Compared with the single factor experiment， the optimized extraction process increases the extraction rate of gardenia yellow pigment from 15.15% to 18.36%. Therefore， the optimized extraction process is beneficial to the extraction of gardenia yellow pigment and has practical application value.

Key words： gardenia fruit; gardenia yellow pigment; ultrasound; response surface methodology; optimization

梔子屬藥食同源植物資源[1]。幾個世紀(jì)以來，梔子果實在亞洲國家一直被用作民間藥物。在中國，梔子果是一味傳統(tǒng)中藥，在中醫(yī)臨床中被廣泛用于黃疸、煩惱、失眠和各種與濕熱相關(guān)的臨床癥狀的治療[2]。現(xiàn)今梔子在食品和染料工業(yè)、醫(yī)藥中都有廣泛的應(yīng)用[3-4]：在食品和染料方面，可用提取的梔子黃色素來合成梔子紅色素、梔子藍(lán)色素等；在醫(yī)藥方面，梔子果實既可直接用于生產(chǎn)中成藥或調(diào)配中藥，也可通過提取其活性成分作為藥物中間體或?qū)嶒炘噭┑取?/p>

梔子黃色素被認(rèn)為是一種具有極高藥理價值的天然色素[5]，它的主要組成物質(zhì)為α-藏花素和藏花酸，在藥物研究中被廣泛使用[6]，在人體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為維生素A[7]。研究表明，梔子黃色素具有抗氧化和抑制癌癥等作用[8-11]。由于梔子廣泛分布于溫帶地區(qū)，故相比于其他國家，我國在原料獲取方面優(yōu)勢明顯，若將其開發(fā)成產(chǎn)品，不但解決了部分地區(qū)梔子果滯銷的問題，拓寬了農(nóng)民的銷售渠道，而且提升了梔子果的附加值。

用溶劑直接提取活性物質(zhì)是一種簡單的方法，但該方法通常存在提取溫度高、萃取時間長等缺點(diǎn)，不僅活性易受損，影響提取率，而且能耗大[12-14]。為了改善這種情況，通常在傳統(tǒng)溶劑提取的基礎(chǔ)上，輔以微波、超高壓或超聲波等技術(shù)。考慮到超高壓設(shè)備造價高、成本高，而微波輔助提取容易造成內(nèi)外溫度不均，所以從經(jīng)濟(jì)可行及適用于推廣生產(chǎn)的角度出發(fā)，選擇超聲輔助醇提法提取梔子果中梔子黃色素，先選取了5個因素來考察其對提取率的影響，然后通過響應(yīng)面法確定最優(yōu)提取工藝，旨在建立一種從梔子果實中提取梔子黃色素的有效簡便方法，為梔子黃色素在食品、醫(yī)藥、化學(xué)等行業(yè)中的進(jìn)一步研究與開發(fā)利用提供來源與動力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江西南昌產(chǎn)梔子果實：購于亳州市沁圓春生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、石油醚：西隴化工股份有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EL104分析天平 梅特勒-托利多公司；DGX-9053鼓風(fēng)干燥箱 上海南榮實驗室設(shè)備有限公司；SHB-Ⅲ真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HB10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；KQ-400E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DE-100 g萬能高速粉碎機(jī) 浙江紅景天工貿(mào)有限公司；TGL-15B高速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF-6021真空干燥機(jī) 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；UV-8000紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

取一定量干燥粉碎的梔子果粉末于索氏提取器的套管中，以石油醚作為萃取劑，正?；亓鬏腿〕蚚15]，再將除完油的梔子粉末烘至恒重，然后篩分為20，40，60，80，100目5種粒徑備用。

1.3.2 梔子黃色素的提取

準(zhǔn)確稱取60目的梔子果粉末0.5 g于圓底燒瓶中，按液料比20∶1（mL/g）加入60%乙醇溶液，溫度50 ℃，超聲波提取20 min[16-18]，然后抽濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，最后將濃縮液置于60 ℃的真空干燥箱中干燥，即得梔子黃色素粉末。

1.3.3 梔子黃色素提取率的計算[19]

梔子黃色素提取率=M2/M1×100%。（1）

式中：M1為提取加入的梔子果粉末質(zhì)量（g）；M2為制得的梔子黃色素粉末質(zhì)量（g）。

1.3.4 梔子黃色素的檢測

取梔子黃色素粉末樣品0.100 g，定容至100 mL，用紫外可見光譜儀記錄樣品在200～800 nm范圍內(nèi)的吸收曲線[19]。因為梔子黃色素的水溶液在238，440，325 nm處有3個特征吸收峰，所以根據(jù)所得掃描曲線判斷提取出的粉末是否含有所需提取的物質(zhì)。

1.3.5 梔子黃色素提取的單因素實驗設(shè)計

考慮到影響梔子黃色素提取率的因素較多，本實驗選取了其中5個因素用來考察其對提取率的影響，即粒度、提取時間、提取溫度、提取劑濃度（乙醇水溶液）及液料比，并對這5個影響因素分別進(jìn)行單因素實驗，確定影響因素和水平。

按照1.3.2中色素提取方法，將脫脂后的梔子果粉碎過篩，準(zhǔn)確稱量粒度20，40，60，80，100目的0.5 g梔子果粉末，在提取時間（10，20，30，40，50，60，70 min）、提取溫度（30，40，50，60，70 ℃）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）、乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）的條件下，依次進(jìn)行單因素實驗[20]。提取率按公式（1）進(jìn)行計算。

1.3.6 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù)各單因素實驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計[21]，見表1。

1.3.7 色價和OD值的檢測[22-23]

梔子黃色素的評價標(biāo)準(zhǔn)主要有色價和OD值。根據(jù)國標(biāo)GB 7912－2010，梔子黃色素粉末、膏體以及液體的色價E1%1 cm（440±5）nm≥10。而梔子黃色素綠變的可能性可以通過OD值來衡量，當(dāng)OD值大于0.5時會使面制品發(fā)生綠變。國際市場出口的質(zhì)量要求在0.2左右甚至更低。色價和OD值的計算公式如下：

E1%1 cm（440±5）nm=A/M。（2）

式中：E1%1 cm（440±5）nm為樣品濃度為1%時，用1 cm比色皿在（440±5）nm范圍內(nèi)最大吸收波長處測得的色價；A為在440 nm處溶液的吸光度值；M為100 mL溶液中溶解的樣品質(zhì)量（g）。

OD值=A238 nm/A440 nm。（3）

式中：OD值為被測溶液在238 nm（京尼平苷的吸光度值）與 440 nm（梔子黃色素的吸光度值）的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子黃色素的檢測

經(jīng)查文獻(xiàn)[19，24]可知，梔子黃色素粗提液在紫外可見光譜下有3個吸收峰，位于440，238，325 nm處，分別對應(yīng)梔子黃色素、京尼平苷和綠原酸。

由圖1可知，本實驗提取的梔子黃色素的水溶液在200～600 nm范圍內(nèi)有3個吸收峰，分別在238，325，440 nm處，這與所查的文獻(xiàn)中的譜圖相符，基本可以確定該提取物中的主要化合物類型，且該實驗方法可以將梔子果中的梔子黃色素提取出來。

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

由圖2中a可知，當(dāng)提取時間在0～30 min時，梔子黃色素的提取率逐漸升高；30 min時提取率達(dá)最大，為15.15%；當(dāng)提取時間超過30 min時，提取率逐漸降低，原因可能是提取時間過長導(dǎo)致色素降解，如氧化或熱解而轉(zhuǎn)化成其他化合物[25-26]。由圖2中b～d可知，提取率隨著提取溫度、液料比和乙醇濃度的變化也出現(xiàn)了類似的趨勢。當(dāng)提取溫度為60 ℃時，提取率達(dá)到最大，為14.86%，可能是合適的溫度有利于溶液的傳質(zhì)，但溫度過高會導(dǎo)致色素降解[25-26]。當(dāng)液料比為25∶1時，提取率達(dá)到最大值，為14.93%。在液料比超過25∶1后，梔子果中梔子黃色素的提取率呈先降低后升高又降低的趨勢，這可能是在液料比為25∶1時，乙醇水溶液對梔子果中的梔子黃色素已經(jīng)呈現(xiàn)飽和狀態(tài)，液料比提高并不會使梔子黃色素的提取率增加。當(dāng)乙醇濃度為50%時，提取率達(dá)到最大，隨著乙醇濃度的增加，提取率降低，這可能是由于梔子黃色素含有親水基團(tuán)，提高乙醇濃度并不能提高提取率，且大多數(shù)與梔子黃色素相關(guān)的化合物可能具有高極性[27] ，所以低乙醇濃度可以提高提取物的產(chǎn)量。由圖2中e可知，梔子粉末越細(xì)，梔子黃色素的提取率越高，但粉碎越細(xì)所需的粉碎時間及能耗也增加，因此實驗選擇最佳粒度為80目。

綜上，由單因素實驗結(jié)果確定最佳的提取時間、提取溫度、液料比、乙醇濃度和粒度分別為30 min、60 ℃、25∶1、50%和80目。

2.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.4 殘差和方差分析

通過軟件Design-Expert 13對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析擬合，可以獲得殘差診斷圖、回歸模型的方差分析表以及模型的等高線和響應(yīng)面圖。

2.4.1 殘差與運(yùn)行順序圖和殘差正態(tài)概率圖

本實驗殘差與運(yùn)行順序圖和殘差正態(tài)概率圖見圖3。

由圖3中a可知，實驗設(shè)置的46個點(diǎn)，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后，這些樣本的殘差都處于－2～2的范圍內(nèi)。通過觀察46個實驗點(diǎn)的分布情況，可以發(fā)現(xiàn)這些樣本的分布接近于正態(tài)分布，因此可以得出線性模型符合預(yù)期，說明模型設(shè)計正確[28-29]。通過正態(tài)殘差圖可以評估模型的可靠性，模型殘差與隨機(jī)誤差相互偏離的程度越明顯，則模型的可靠性越低。由圖3中b可知，殘差數(shù)據(jù)點(diǎn)的分布具有正態(tài)分布特征，它們沿著一條直線的兩邊均勻地分布，表明殘差符合正態(tài)分布的規(guī)律，因此，該模型具有很強(qiáng)的可靠性[30]。

2.4.2 響應(yīng)面回歸方程建立及方差分析

對表2中實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，可得梔子黃色素提取率對提取時間（A）、提取溫度（B）、乙醇濃度（C）、粒度（D）、液料比（E）的二次多項式回歸模型方程：梔子黃色素提取率=18.31－0.090 6A－0.100 6B－0.030 6C+0.356 9D+0.293 8E－0.097 5AB－0.680 0AC+0.187 5AD+0.502 5AE－0.785 0BC+1.33BD+0.005 0BE－0.142 5CD－0.390 0CE－0.592 5DE－1.04A2－1.21B2－0.854 0C2－0.879 0D2－0.836 5E2。

一般來說，P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。由表3可知，建立的二次回歸模型的P<0.01，且F值為134.17，由此說明模型具有極顯著性；失擬項的P=0.054 6（P>0.05），失擬項不顯著，說明該回歸方程對實驗的擬合情況較好[29]；同時該模型的校正決定系數(shù)RAdj2=0.983 4，說明該模型能較好地擬合真實曲面，且線性回歸系數(shù)R2=0.990 8，說明該模型的擬合度良好，實驗誤差較小[31]。由模型的回歸效果顯著、失擬項不顯著以及相關(guān)系數(shù)說明本次實驗使用的提取工藝是可靠的，使用響應(yīng)面法計算出的提取工藝最優(yōu)參數(shù)是可使用的。由表3中 F值的大小以及回歸方程一次項系數(shù)可知，5個實驗因素對梔子黃色素提取率的影響大小是D（粒度）＞E（液料比）＞B（提取溫度）＞A（提取時間）＞C（乙醇濃度）。

2.4.3 響應(yīng)面立體圖分析

通過響應(yīng)面法可以有效地找到自變量的最佳參數(shù)，從而實現(xiàn)響應(yīng)值最大化。通過觀察響應(yīng)面圖可以清晰地了解每個參數(shù)的最大值所代表的因素水平，并且可以通過分析投影圖中等高線的疏密程度和橢圓形狀來推斷兩個因素之間的相互作用，還可以通過觀察圖形邊緣曲線的陡峭程度來推斷它們對梔子黃色素提取率的影響[32]。各因素交互關(guān)系對梔子黃色素提取率影響的響應(yīng)面圖見圖4。

由圖4可知，所有曲面都為凸型面，即各因素在相對應(yīng)的實驗范圍內(nèi)都有相應(yīng)極值。兩個因素之間交互作用極顯著的有乙醇濃度與提取時間、粒度與提取時間、液料比與提取時間、乙醇濃度與提取溫度、提取溫度與粒度、液料比與乙醇濃度、液料比與粒度；交互作用顯著的有粒度與乙醇濃度；交互作用不顯著的有提取溫度與提取時間、液料比與提取溫度。各因素的交互作用結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

利用軟件計算回歸模型，預(yù)測出梔子黃色素的最優(yōu)提取方案：提取時間為30.76 min，提取溫度為62.12 ℃，液料比為25.6∶1，乙醇濃度為48.00%，粒度為86.90目，模型預(yù)測的梔子黃色素的提取率為18.38%。

2.5 最佳工藝條件的確定及驗證

為了檢驗優(yōu)化后的提取工藝的可靠性和精確性，需進(jìn)行實驗驗證。由模型預(yù)測的梔子黃色素的最佳提取工藝條件組合為提取時間30.76 min、提取溫度62.12 ℃、液料比25.6∶1、乙醇濃度48.00%、粒度86.90目?？紤]到實際操作的可行性，需對該工藝進(jìn)行調(diào)整修正。

調(diào)整修正后的梔子黃色素的提取條件為提取時間31 min、提取溫度62 ℃、液料比25∶1、乙醇濃度48%、粒度80目。按照調(diào)整修正后的優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行驗證，實驗得到的提取率分別為18.33%、18.37%、18.38%，平均值為18.36%，與理論值18.38%相符，同模型預(yù)測值的相對誤差僅為0.19%。與單因素實驗相比，優(yōu)化后的提取工藝將梔子黃色素的提取率從15.15%提高到18.36%。經(jīng)過響應(yīng)面法的優(yōu)化，建立了一個能夠有效提取梔子黃色素最佳工藝條件的回歸模型，且模型可靠。

2.6 梔子黃色素評價結(jié)果

通過實驗1.3.7，得到本實驗制得的梔子黃色素色價為77，OD值為1.21。提取出來的梔子黃色素色價達(dá)到國家使用要求，但OD值較高，需要通過進(jìn)一步分離和純化來降低其綠變的可能性。

3 結(jié)論

本實驗利用響應(yīng)面法優(yōu)化了梔子黃色素的提取工藝，通過實驗與分析可得到如下結(jié)論：

采用超聲輔助醇提取法從梔子果中提取梔子黃色素，在單因素試驗基礎(chǔ)上得出梔子黃色素提取率的二階模型：

梔子黃色素的提取率=18.31－0.090 6A－0.100 6B－0.030 6C+0.356 9D+0.293 8E－0.097 5AB－0.680 0AC+0.187 5AD+0.502 5AE－0.785 0BC+1.33BD+0.005 0BE－0.142 5CD－0.390 0CE－0.592 5DE－1.04A2－1.21B2－0.854 0C2－0.879 0D2－0.836 5E2。通過該模型，可以為梔子黃色素提取工藝中各個因素的選擇和大小設(shè)定提供理論依據(jù)。

最佳提取工藝條件為提取時間31 min、提取溫度62 ℃、液料比25∶1、乙醇濃度48%、粒度80目。實驗證明低溫及低乙醇濃度有利于梔子黃色素的提取，可大大降低生產(chǎn)成本。并在此工藝條件下進(jìn)行3次實驗，梔子黃色素提取率為18.36%，與預(yù)測值18.38%相差0.02%，誤差為0.19%，誤差較小，說明優(yōu)化后的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。與單因素實驗相比，優(yōu)化后的提取工藝將梔子黃色素的提取率從15.15%提高到18.36%，故優(yōu)化后的工藝有利于梔子黃色素的提取，具有實際應(yīng)用價值。

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DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2023.12.030

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收稿日期：2023-06-14

基金項目：福建省教育廳中青年教師教育科研項目（JAT200972）；泉州市高等職業(yè)教育技能名師工作室（QZGZS-2019-02）

作者簡介：陳莎莎（1988－），女，實驗師，研究方向：天然活性物質(zhì)的提取及分析與檢測。