創(chuàng)新柑橘黃龍病檢測(cè)技術(shù)，助推柑橘產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展

楊碧垚，陳金福

（賓川縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院 云南賓川 671600）

柑橘產(chǎn)業(yè)是賓川縣具有300 多年種植歷史的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，經(jīng)多年實(shí)踐證明，是促進(jìn)賓川縣農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收具有強(qiáng)大支撐和推動(dòng)作用的優(yōu)勢(shì)、特色、骨干產(chǎn)業(yè)之一。1995 年，賓川臍橙在中國(guó)第二屆農(nóng)業(yè)博覽會(huì)上榮獲銀質(zhì)獎(jiǎng)；2007 年以來(lái)，又先后榮獲“中國(guó)柑橘之鄉(xiāng)”“全國(guó)興果富農(nóng)果業(yè)發(fā)展百?gòu)?qiáng)優(yōu)質(zhì)示范縣”“中國(guó)優(yōu)質(zhì)柑橘基地”“中國(guó)十大名橘”等榮譽(yù)。“十四五”期間，縣委縣政府提出了突出葡萄、柑橘“兩果”優(yōu)勢(shì)，打造世界一流“綠色食品品牌”“建設(shè)世界一流水果之鄉(xiāng)”的發(fā)展定位，確立了到2025 年柑橘種植面積達(dá)12 萬(wàn)畝的發(fā)展目標(biāo)，柑橘產(chǎn)業(yè)迎來(lái)了又一次重大發(fā)展機(jī)遇。目前，柑橘黃龍病仍然是制約全縣柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素，要重振賓川縣柑橘產(chǎn)業(yè)，最重要的就是解決柑橘黃龍病的危害問(wèn)題。因此，強(qiáng)化柑橘黃龍病檢驗(yàn)檢測(cè)，提升病蟲(chóng)害監(jiān)測(cè)能力，充分發(fā)揮雷達(dá)預(yù)警作用，加強(qiáng)病蟲(chóng)害防控，才能更好地促進(jìn)全縣柑橘產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

1 情況介紹

柑橘黃龍病，是由一種限于韌皮部?jī)?nèi)寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌引起的，能夠侵染包括柑橘屬、枳屬、金柑屬和九里香等多種蕓香科植物的世界柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害。病原物為一種類(lèi)革蘭氏陰性細(xì)菌，屬韌皮桿菌，菌體多數(shù)呈圓形或者橢圓形，少數(shù)呈不規(guī)則形，大小為（20～600）納米×（170～1600）納米，厚17～33 納米，平均25 納米，由3 層膜組成。

2017 年，賓川縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院與云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院合作，開(kāi)展柑橘黃龍病生物防控試驗(yàn)，并先后兩次選派技術(shù)人員到云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院學(xué)習(xí)培訓(xùn)，重點(diǎn)學(xué)習(xí)柑橘黃龍病檢測(cè)方法、檢測(cè)原理和實(shí)驗(yàn)操作能力。充分利用賓川分中心實(shí)驗(yàn)室優(yōu)勢(shì)，開(kāi)展柑橘葉片、果實(shí)、根莖、土壤等柑橘黃龍病檢測(cè)技術(shù)攻關(guān)，先后建立柑橘黃龍病病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR 和普通PCR 檢測(cè)方法，其中實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)靈敏度高于普通PCR 近100 倍。2018年，實(shí)驗(yàn)室順利通過(guò)兩種檢測(cè)方法的現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審考核，取得了柑橘黃龍病檢測(cè)資質(zhì)，為全縣柑橘黃龍病精準(zhǔn)防控提供了技術(shù)支撐，截至目前，累計(jì)完成柑橘黃龍病檢測(cè)1000 余批次。

2 實(shí)施方案

2.1 考察學(xué)習(xí)

為了解和掌握柑橘栽培管理技術(shù)、柑橘黃龍病生物防控、檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)等，邀請(qǐng)?jiān)颇限r(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院何月秋教授在州城鎮(zhèn)賓居華僑社區(qū)4 個(gè)果園開(kāi)展柑橘黃龍病生物防控試驗(yàn)。同時(shí)，賓川縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院選派3 名技術(shù)骨干到云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心等地進(jìn)行培訓(xùn)學(xué)習(xí)（如圖1 所示）。

圖1 培訓(xùn)學(xué)習(xí)

2.2 建立柑橘黃龍病檢驗(yàn)檢測(cè)體系

2.2.1 加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)按《柑橘黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法》建立了柑橘黃龍病病原菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，配備三通道熒光定量PCR 儀、梯度PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、超聲波清洗機(jī)等必要的儀器設(shè)備，達(dá)到快速定性分析與定量分析的實(shí)驗(yàn)室條件要求，為開(kāi)展柑橘黃龍病檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)（如圖2 所示）。

圖2 檢測(cè)相關(guān)設(shè)備

2.2.2 加強(qiáng)人才培養(yǎng)柑橘黃龍病實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)雖然不是不可企及的高尖端技術(shù)，但諸如樣本DNA 的提取、DNA 擴(kuò)增、PCR 產(chǎn)物的電泳、凝膠成像分析、熒光定量PCR 結(jié)果解析等都需要較專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作。通過(guò)“請(qǐng)進(jìn)來(lái)”和“送出去”的方式，邀請(qǐng)技術(shù)專(zhuān)家和學(xué)者到賓川縣實(shí)地培訓(xùn)，又將賓川縣檢驗(yàn)技術(shù)人才派送到大學(xué)或科研機(jī)構(gòu)進(jìn)行強(qiáng)化培養(yǎng)，快速掌握檢驗(yàn)技術(shù)。進(jìn)行多形式和多層次培訓(xùn)，為各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)順利開(kāi)展提供了人才保障（如圖3 所示）。

圖3 人才交流

2.2.3 取得資質(zhì)根據(jù)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件、主要設(shè)備和人員專(zhuān)業(yè)水平，通過(guò)了GB/T 28062—2011《柑橘黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法》省級(jí)資質(zhì)認(rèn)定考核組的考核評(píng)審，是目前全省唯一一家取得法定資質(zhì)的柑橘黃龍病檢測(cè)機(jī)構(gòu)[1]。

2.2.4 創(chuàng)建職工創(chuàng)新工作室為了進(jìn)一步提升柑橘黃龍病檢測(cè)能力，對(duì)賓川縣柑橘黃龍病防控提出指導(dǎo)性意見(jiàn)，邀請(qǐng)?jiān)颇限r(nóng)業(yè)大學(xué)何月秋教授在賓川縣設(shè)立專(zhuān)家工作站，將其研究柑橘黃龍病豐富的經(jīng)驗(yàn)及豐碩的成果應(yīng)用到一線(xiàn)，切實(shí)促進(jìn)賓川縣解決柑橘黃龍病危害嚴(yán)重的問(wèn)題，保障柑橘產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展，目前已成功創(chuàng)建職工創(chuàng)新工作室，專(zhuān)家工作站正在申報(bào)中。

2.3 加強(qiáng)柑橘苗木檢驗(yàn)

根據(jù)《賓川縣柑橘種苗管理辦法（試行）》要求，聯(lián)合縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、縣市場(chǎng)監(jiān)管局、縣林草局對(duì)賓川縣境內(nèi)繁育的柑橘種苗和調(diào)運(yùn)入賓川縣的外來(lái)柑橘苗木進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，抽樣檢測(cè)是否攜帶柑橘黃龍病菌，為加強(qiáng)柑橘種苗管理提供有力的技術(shù)支持（如圖4 所示）。

圖4 抽樣檢測(cè)

2.4 開(kāi)展植株抽樣檢測(cè)

在全縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)、合作社、農(nóng)戶(hù)柑橘種植基地進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)疑似柑橘黃龍病病株進(jìn)行抽樣檢測(cè)，確定是否攜帶柑橘黃龍病菌并及時(shí)反饋，為柑橘黃龍病精準(zhǔn)防控提供技術(shù)支持。目前山區(qū)3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)設(shè)1個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，壩區(qū)7 個(gè)鎮(zhèn)設(shè)9 個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，每個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)每個(gè)季度抽檢樣品數(shù)量不低于20 份。

3 案例思考

3.1 開(kāi)展柑橘黃龍病檢測(cè)工作是種苗管理的需要

多年來(lái)，賓川縣柑橘種苗生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)一直存在不規(guī)范的情況。傳統(tǒng)育苗方式如隨意育苗、露地育苗以及散戶(hù)育苗等占主導(dǎo)地位，這些方式規(guī)模較小，條件簡(jiǎn)陋，組織化程度低，技術(shù)含量不高，導(dǎo)致種苗質(zhì)量差，容易感染病蟲(chóng)害。此外，隨意引種調(diào)苗的現(xiàn)象也比較突出，而市場(chǎng)監(jiān)管?chē)?yán)重滯后，進(jìn)一步導(dǎo)致賓川縣種苗質(zhì)量得不到有效保障。為了解決這一問(wèn)題，需要建立柑橘黃龍病檢測(cè)機(jī)制，即引進(jìn)快速、便捷的病蟲(chóng)害檢測(cè)手段。通過(guò)使用這些先進(jìn)技術(shù)，在柑橘苗的引種和本地培育過(guò)程中進(jìn)行快速檢測(cè)，如對(duì)調(diào)入的柑橘苗和本地培育的柑橘苗進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)和篩選，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶病菌或蟲(chóng)害的苗木，并采取適當(dāng)?shù)姆乐未胧?，保障種苗的質(zhì)量和健康。同時(shí)，這種柑橘黃龍病檢測(cè)模式還能進(jìn)一步解放勞動(dòng)力，強(qiáng)化技術(shù)人員、管理人員對(duì)柑橘樹(shù)體生長(zhǎng)的把控，如更加全面地病蟲(chóng)害管理、進(jìn)行有效的灌溉和施肥管理等。此外良好的檢測(cè)技術(shù)，還能預(yù)防病害傳播，柑橘黃龍病主要通過(guò)木虱傳播，具有很強(qiáng)的傳染性。如果不及時(shí)檢查，可能會(huì)引起病害的擴(kuò)散。因此，在引種或收購(gòu)種苗時(shí)需要進(jìn)行柑橘黃龍病的檢查[2]。

3.2 開(kāi)展柑橘黃龍病檢測(cè)工作是柑橘黃龍病科學(xué)防控的需要

柑橘黃龍病是一種由亞洲韌皮桿菌引起的病害，對(duì)柑橘類(lèi)作物造成嚴(yán)重危害。為了科學(xué)防控這種病害，對(duì)柑橘黃龍病進(jìn)行檢測(cè)是必不可少的。首先，對(duì)柑橘黃龍病檢測(cè)可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)病害。此病害早期癥狀難以察覺(jué)，通過(guò)檢測(cè)可以準(zhǔn)確診斷，避免延誤防治時(shí)機(jī)。及早發(fā)現(xiàn)并采取相應(yīng)的防治措施，可以最大程度地減少疫情擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)柑橘類(lèi)作物的健康生長(zhǎng)；其次，柑橘黃龍病檢測(cè)有助于科學(xué)評(píng)估病害的危害程度。通過(guò)檢測(cè)，可以了解病害的發(fā)展?fàn)顩r以及對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)的影響程度，從而為精確制定防治措施提供依據(jù)。準(zhǔn)確評(píng)估病害的危害程度，可以更科學(xué)地分配資源，提高防治效果；最后，開(kāi)展柑橘黃龍病檢測(cè)也有助于病害的監(jiān)測(cè)和預(yù)警。通過(guò)定期進(jìn)行檢測(cè)，可以實(shí)時(shí)掌握疫情發(fā)展態(tài)勢(shì)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病害的變化趨勢(shì)。綜上，筆者通過(guò)開(kāi)展柑橘葉片、果實(shí)、根莖、土壤等黃龍病檢測(cè)技術(shù)攻關(guān)的大量試驗(yàn)論證，總結(jié)探索出柑橘根部和土壤黃龍病病原菌的檢測(cè)方法，研究發(fā)現(xiàn)：土壤中無(wú)柑橘黃龍病病原菌存在，為柑橘黃龍病防控提供了技術(shù)支撐[3]。

3.3 開(kāi)展柑橘黃龍病檢測(cè)工作是保障產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的需要

首先，賓川縣建設(shè)了柑橘無(wú)病良種苗木繁育基地，提供安全的脫毒苗。然而，要確?；嘏嘤龅拿缒救渴前踩?，并非易事。因此，在這種情況下，對(duì)苗木進(jìn)行質(zhì)量抽檢顯得尤為重要。通過(guò)抽檢，可以確保苗木的品質(zhì)和健康狀況達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。其次，針對(duì)田間的柑橘植株，目前只能依靠觀(guān)察癥狀來(lái)判斷是否為健康植株。然而，在柑橘黃龍病的隱癥期，病菌并不容易被察覺(jué)，這就使得判斷植株是否感染柑橘黃龍病菌變得非常困難。因此，開(kāi)展柑橘黃龍病的檢測(cè)工作迫在眉睫。通過(guò)使用現(xiàn)代化的檢測(cè)技術(shù)，例如PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）等，可以及早發(fā)現(xiàn)并鑒定柑橘植株中是否存在黃龍病菌。這不僅有助于及時(shí)采取防控措施，還可以減少柑橘產(chǎn)業(yè)受到的損失。

4 結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)科技創(chuàng)新，建成柑橘黃龍病檢測(cè)分子生物實(shí)驗(yàn)室，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《柑橘黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法》（GB/T 28062—2011），采用RTFPCR 技術(shù)檢測(cè)柑橘黃龍病，達(dá)到準(zhǔn)確定性與定量的檢測(cè)要求，快速判定柑橘苗木、植株和產(chǎn)品是否感染或攜帶柑橘黃龍病菌，從而為柑橘黃龍病防控或執(zhí)法檢查提供技術(shù)支持，為柑橘產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展保駕護(hù)航，切實(shí)保障人民群眾“舌尖上的安全”。