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    酶聯(lián)免疫法測(cè)定乳粉中黃曲霉毒素M1含量的不確定度評(píng)定

    2023-12-24 09:06:00曹學(xué)思楊愛君陳蓓蕾
    中國乳業(yè) 2023年11期
    關(guān)鍵詞:酶標(biāo)儀移液器乳粉

    李 婕,曹學(xué)思,楊愛君,陳 欣,陳蓓蕾

    廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司,廣東 廣州 510000

    0 引言

    黃曲霉毒素是由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticu)產(chǎn)生,具有很強(qiáng)的致癌、致畸、致突變作用的小分子代謝產(chǎn)物,它有B1、B2、G1、G2、M1和M2等6 種類型[1]。二呋喃環(huán)和香豆素是基本結(jié)構(gòu),可溶在如氯仿、乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑中[2,3]。AFM1(黃曲霉毒素M1)較多殘留在動(dòng)物的乳治、腎臟、肝臟和尿液中,以乳中最常見[4],毒性與AFB1(黃曲霉毒素B1)相似。WHO(世界衛(wèi)生組織)將它列為ⅡB類致癌物[5]。FDA(美國食品藥品監(jiān)督管理局)規(guī)定,牛乳中AFM1殘留量有0.5 μg/kg的限量要求,我國也要求牛乳中AFM1含量限值要低于0.5 μg/kg[6]。

    目前測(cè)定牛乳中黃曲霉毒素M1殘留量的方法有:色譜法、免疫化學(xué)法、光電化學(xué)法、光電發(fā)光法及ELISA檢測(cè)法等。在眾多檢驗(yàn)方法中,AFM1殘留量的ELISA檢測(cè)法較便捷,迫切需要將此方法的不確定度具體量化,有助于檢測(cè)人員關(guān)注關(guān)鍵環(huán)節(jié),使結(jié)果準(zhǔn)確性提高[7]。本文用ELISA檢測(cè)法對(duì)乳粉中AFM1殘留量進(jìn)行檢測(cè),并量化試驗(yàn)中帶入的不確定度。

    1 檢驗(yàn)原理

    黃曲霉毒素M1ELISA檢測(cè)法的檢測(cè)原理是:試劑盒應(yīng)用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附原理。試劑盒孔洞內(nèi)有AFM1特異抗體,在酶聯(lián)耦合物、樣品、標(biāo)準(zhǔn)品中的AFM1會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性與此特異抗體相結(jié)合。在規(guī)定反應(yīng)時(shí)間后,洗液沖洗掉未結(jié)合部分。再加入顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng),最后加入終止液終止該反應(yīng)過程。試驗(yàn)所得孔板通過酶標(biāo)儀測(cè)量吸光光度值。所得吸光光度值結(jié)果錄入計(jì)算機(jī)軟件,得到工作標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過該曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)樣品的AFM1濃度結(jié)果。

    2 材料與方法

    2.1 儀器和材料

    METTLER電子天平;SIGMA離心機(jī);Thermo酶標(biāo)儀;BRAND單、多道移液器;AHYG恒溫振蕩器;CRYSTAL旋渦振蕩器;Romer Labs AFM1 ELSA檢測(cè)試劑盒。

    2.2 試驗(yàn)步驟

    2.2.1 試驗(yàn)樣品預(yù)處理

    (1)稱取待測(cè)樣乳粉;

    (2)稀釋并均勻溶解待測(cè)樣乳粉;

    (3)冷藏靜置并離心待測(cè)樣;

    (4)取離心上清液與甲醇溶液按4∶1均勻混合,混合液待用。

    2.2.2 樣品檢測(cè)

    將ELISA檢測(cè)試劑提前復(fù)熱至室溫。

    (1)在檢測(cè)用孔杯中加入酶聯(lián)偶合物試劑液;

    (2)在上述孔杯內(nèi)依次均勻移入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品,并靜置反應(yīng)60 min;

    (3)60 min后,用洗劑重復(fù)洗各孔杯5 次,拍干孔杯內(nèi)洗液;

    (4)再加入底物顯色液,避光反應(yīng)20 min;

    (5)20 min后,加入酸類終止液終止反應(yīng),制成檢測(cè)微孔板;

    (6)用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔吸光光度值并記錄,代入計(jì)算機(jī)軟件得出待測(cè)樣的濃度結(jié)果;

    (7)判定結(jié)論:0 ng/kg標(biāo)準(zhǔn)品OD值需>0.5,否則說明試劑已失效。

    使用軟件計(jì)算結(jié)果時(shí),其標(biāo)準(zhǔn)品曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R)需為-0.990~-1.000。

    3 結(jié)果計(jì)算數(shù)學(xué)模型

    式中:W—待測(cè)乳粉中AFM1含量,單位μg/kg;

    C—待測(cè)乳粉樣液中AFM1濃度,單位μg/L;

    m—待測(cè)乳粉的稱量重量,單位kg;

    f—待測(cè)乳粉樣液的稀釋倍數(shù),f=10.8。

    3.1 試驗(yàn)結(jié)果

    本試驗(yàn)用同一萬分之一的電子天平,平行稱取同一質(zhì)控樣乳粉(質(zhì)控樣特性值:0.608 μg/kg,特性值區(qū)間0.385~0.830 μg/kg)6 份。根據(jù)上述試驗(yàn)樣品預(yù)處理方法進(jìn)行樣品預(yù)處理,根據(jù)樣品檢測(cè)步驟進(jìn)行樣品檢測(cè)。所得檢驗(yàn)微孔板,經(jīng)同一酶標(biāo)儀平行測(cè)定。在計(jì)算機(jī)運(yùn)算軟件中代入各吸光度值,得到如下試驗(yàn)結(jié)果(表1)。測(cè)定結(jié)果平均值為:0.480 μg/kg。

    表1 試驗(yàn)結(jié)果匯總表(n=6)

    3.2 試驗(yàn)中不確定度的來源分析

    本次試驗(yàn)中,造成結(jié)果不確定度的因素主要有:

    (1)重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度,此為A類不確定度。

    (2)試驗(yàn)中使用各規(guī)格移液器,因溫度和移液器自身誤差這2 個(gè)因素代入的不確定度,此為B類不確定度。

    (3)ELISA試劑盒的試劑穩(wěn)定性及其質(zhì)量造成試劑空白帶入的不確定度,此為B類不確定度。

    (4)酶標(biāo)儀工作性能,如靈敏性、穩(wěn)定性等帶入的不確定度,此為B類不確定度。

    (5)天平稱量試驗(yàn)乳粉時(shí)帶入的不確定度,此為B類不確定度。

    (6)標(biāo)準(zhǔn)曲線帶入的不確定度,此為B類不確定度。

    圖1 試驗(yàn)中不確定度的來源分析

    3.3 各項(xiàng)不確定度的量化分析計(jì)算

    3.3.1 試驗(yàn)重復(fù)性測(cè)定帶入的不確定度

    由表1可知,本次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差:

    3.3.2 移液器容量誤差帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    (1) 200 μL移液器的容量誤差帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度本次試驗(yàn)的工作環(huán)境是室溫20±5 ℃,2.1×10-4/℃是水在20 ℃的膨脹系數(shù)。取矩形分布,則本次試驗(yàn)中使用200 μL移液器移取100 μL待測(cè)乳粉,由于溫度效應(yīng),引起溶劑體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    1.119 ×10-3/℃是甲醇在20 ℃的膨脹系數(shù),本試驗(yàn)工作環(huán)境是室溫為20±5 ℃,取矩形分布,則本次試驗(yàn)中使用200 μL移液器移取100 μL甲醇溶液,溫度效應(yīng)引起溶液體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    查詢編號(hào)LE 202200065的移液器計(jì)量證書:可調(diào)移液器20~200 μL容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度U=0.5%,k=2。本次試驗(yàn)因使用200 μL移液器產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:(取矩形分布)

    使用200 μL移液器移取水溶液樣品時(shí)由(u溫)和(u容)兩項(xiàng)因素帶進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    使用200 μL移液器移取甲醇溶液時(shí)由(u溫2)和(u容)帶進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    本試驗(yàn)有3步涉及應(yīng)用200 μL移液器進(jìn)行溶液移取。其中水溶液的移取為2 步:100 μL乳樣的u(溫2)、u(容)在該過程互為獨(dú)立。加樣過程中本次試驗(yàn)因200 μL移液器由這幾個(gè)因素帶進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    200 μL移液器在本次試驗(yàn)帶進(jìn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

    (2)1 mL移液器的容量誤差帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    本次試驗(yàn)的工作環(huán)境是室溫20±5 ℃,2.1×10-4/℃是水在20℃的膨脹系數(shù)。取矩形分布,本次試驗(yàn)中使用1 mL移液器移取400 μL待測(cè)乳樣,溫度效應(yīng)引起溶劑體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    查詢編號(hào)LE 202200066的移液器計(jì)量證書中:可調(diào)移液器0.1~1 mL容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度U=0.3%,k=2,本次試驗(yàn)因使用1 mL移液器產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:(取矩形分布)

    本試驗(yàn)總共1 步涉及應(yīng)用1 mL單道移液器進(jìn)行溶液移取,u(溫)、u(容)在該過程互為獨(dú)立,加樣過程中本次試驗(yàn)因1 mL移液器由這兩個(gè)因素帶進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定。那么,1 mL移液器在本次試驗(yàn)過程中的使用,由其帶進(jìn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    (3) 10 mL移液器容量誤差帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    本次試驗(yàn)的工作環(huán)境是室溫20±5 ℃,2.1×10-4/℃是水在20 ℃的膨脹系數(shù)。取矩形分布,本次試驗(yàn)中使用10 mL移液器移取二級(jí)水,溫度效應(yīng)引起溶劑體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    查詢編號(hào)LE 202216773的移液器計(jì)量證書:可調(diào)移液器1~10 mL容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度U=0.2%,k=2,本次試驗(yàn)因使用10 mL移液器產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:(取矩形分布)

    本試驗(yàn)總共1 步涉及應(yīng)用10 mL單道移液器進(jìn)行二級(jí)水移取,u(溫)、u(容)在該過程互為獨(dú)立,加樣過程本次試驗(yàn)因10 mL移液器由這兩個(gè)因素帶進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    10 mL移液器在此次試驗(yàn)帶進(jìn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    3.3.3 試劑空白引入的不確定度

    黃曲霉毒素M1ELISA檢測(cè)試劑是正規(guī)廠家按照國標(biāo)要求生產(chǎn)的檢驗(yàn)用試劑,因而由試劑空白造成的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(空)在本文中忽略不計(jì)。

    3.3.4 由酶標(biāo)儀性能帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    本次試驗(yàn)使用同一酶標(biāo)儀對(duì)試驗(yàn)微孔板進(jìn)行樣品測(cè)試,因此,不計(jì)因靈敏度造成的不確定度。查詢書編號(hào)NG 202301468的酶標(biāo)儀計(jì)量證書:酶標(biāo)儀的吸光度示值誤差的擴(kuò)展不確定度U=0.012,k=2,本次試驗(yàn)因使用該酶標(biāo)儀所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:(根據(jù)矩形分布)

    3.3.5 樣品稱量帶進(jìn)的不確定度

    試驗(yàn)使用同一臺(tái)萬分之一電子天平,分別稱取6 個(gè)平行的1 g待測(cè)乳粉樣品,因而不計(jì)靈敏度造成的不確定度。查詢證書編號(hào)LJ 202310184的電子天平計(jì)量證書:天平最大秤量示值誤差的測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度U=0.08 mg(70 g),k=2。本次試驗(yàn)因使用該電子天平稱量待測(cè)樣乳粉帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:(根據(jù)矩形分布)

    本次樣品稱量帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    3.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線帶入的不確定度

    根據(jù)上述ELISA黃曲霉毒素M1試劑盒試驗(yàn)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)操作,將檢驗(yàn)操作所得同一孔杯板用同一酶標(biāo)儀進(jìn)行兩次上機(jī)測(cè)量,讀取兩組試劑盒已知濃度標(biāo)樣的對(duì)應(yīng)吸光度A值。并用該組吸光光度值生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表2。

    表2 工作曲線測(cè)定結(jié)果表

    錄入電腦的數(shù)據(jù)處理工作文檔進(jìn)行計(jì)算,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)值Log(Conc.)為X軸,Logit(A/A0)值為Y軸。得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=2.468 1-1.185 9X,R=-0.998 3。通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線可得,待測(cè)樣品奶粉還原稀釋液濃度對(duì)數(shù)平均值:LogX樣=1.663 9,X樣=46.12 ng/L 。得工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差為:

    式中:Yi—表2中Logit(A/A0)各數(shù)值;

    Xi—表2中Log(Conc.)各值;

    a—表2中截距值2.468 1;

    b—表2中斜率值-1.185 9;

    n=12

    計(jì)算本次試驗(yàn)因標(biāo)準(zhǔn)曲線帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    式中:S(曲):工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)差;

    b:表2中斜率,b=-1.185 9;

    k:樣品的測(cè)量次數(shù)——2,;

    n:標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量總次數(shù)——12;

    g0:LogX樣值——1.663 9;

    g:表2中Log(Conc.)的平均值;

    gi:表2中Log(Conc.)各值。

    可得:

    可得:本次試驗(yàn)中工作(表3)曲線帶進(jìn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

    表3 各項(xiàng)不確定度匯總

    4 各項(xiàng)不確定度結(jié)果對(duì)比分析

    各項(xiàng)不確定度見表3。對(duì)本次乳粉中黃曲霉毒素M1殘留量ELISA法測(cè)定結(jié)果的不確定度影響較大的是由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

    4.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

    將上述各項(xiàng)不確定度量化計(jì)算結(jié)果合并,本次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    其中0.480 μg/kg是上述本次試驗(yàn)實(shí)測(cè)樣品AFM1含量平均值。

    4.2 擴(kuò)展不確定度

    測(cè)定結(jié)果符合正態(tài)分布,按照置信水平95%,包含因子k=2,本次試驗(yàn)乳粉樣品中黃曲霉毒素M1測(cè)定的擴(kuò)展不確定度:

    5 結(jié)論

    本文試驗(yàn)采用ELISA法測(cè)定乳粉樣品中黃曲霉M1含量結(jié)果應(yīng)表示為0.480±0.023 μg/kg,k=2。其中對(duì)不確定度影響較大的因素是由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度。將來檢驗(yàn)工作中,可酌情增加加標(biāo)樣或質(zhì)控樣測(cè)試次數(shù),以減少其不確定度對(duì)測(cè)定結(jié)果帶來影響。

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