6種阿達(dá)帕林脂質(zhì)體的制備及透皮性能比較研究

任書杉，付琳，李東澤，王超，趙雅欣，張向宇

（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

痤瘡是一種青少年?；计つw病，臨床表現(xiàn)為非炎性皮損及丘疹、膿皰等炎性皮損[1]。阿達(dá)帕林（adapalene,ADA）是如今臨床上應(yīng)用最廣泛的局部抗痤瘡藥物，是人工合成的第三代維A 酸類藥物，可以調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞分化，促進(jìn)角質(zhì)溶解[2]，同時(shí)具有抗炎和抗脂溢性的作用，但存在刺激性和光敏性的缺點(diǎn)，且存在“維甲酸反應(yīng)”的副作用。因此需要采用新的藥物遞送系統(tǒng)，增強(qiáng)藥物活性成分的承載能力并減少其副作用，如將ADA 包載于脂質(zhì)體中，可以消除藥物的快速高劑量釋放，實(shí)現(xiàn)持續(xù)和可控的藥物釋放模式，并減少不良反應(yīng)[3]。

功能化納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的優(yōu)勢主要表現(xiàn)為增強(qiáng)藥物吸收、改變藥物分布使其富集于靶標(biāo)處、降低藥物的消除以延長作用時(shí)間等特點(diǎn)[4]。本課題通過查閱文獻(xiàn)篩選了以下6種常見的脂質(zhì)體進(jìn)行皮膚滲透量和皮內(nèi)滯留量的對比。

相比于普通脂質(zhì)體（liposome），溫敏性脂質(zhì)體（temperature sensitive liposomes, TSL）加入了具有不同相變溫度的磷脂，能在特定溫度下從凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕B(tài)，定點(diǎn)釋放藥物[5]。孫君穎等[6]制備的溫敏脂質(zhì)體在39~42 ℃下可以快速釋放抗氧化劑，達(dá)到保護(hù)食品的目的。本課題組前期試驗(yàn)篩選了二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）與卵磷脂（SPC）的比例，得到符合制備目標(biāo)相變溫度的溫敏脂質(zhì)體為本試驗(yàn)的研究奠定基礎(chǔ)。

柔性脂質(zhì)體（flexible liposomes, FL）是在脂質(zhì)體中加入軟化劑使具有較強(qiáng)的柔順性和變形性，使藥物更易透過皮膚[7]；加入表面活性劑、L-薄荷醇、氯化十六烷基吡啶等輔料制成彈性納米脂質(zhì)體（elastic nano-liposomes, ENL）和可變形脂質(zhì)體（deformable liposomes, DL），可以通過增加藥物分配和擴(kuò)散來促進(jìn)透皮吸收。Hou 等[8]研究制備了功能性彈性脂質(zhì)體，并應(yīng)用于皮膚給藥，發(fā)現(xiàn)在DL 中加入的表面活性劑為囊泡結(jié)構(gòu)提供彈性和靈活性，從而能夠擠壓角質(zhì)層細(xì)胞，更容易滲透到皮膚深層。

本研究采用薄膜水化法制備上述6種不同的阿達(dá)帕林脂質(zhì)體，通過體外透皮實(shí)驗(yàn)比較不同脂質(zhì)體的皮膚透過量和皮內(nèi)滯留量，篩選透皮效果更好的阿達(dá)帕林脂質(zhì)體制劑，為增加藥物滲透、延長藥物作用時(shí)間等研究奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

R213 B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；HP/Agilent 1200 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；UV2550 紫外可見分光光度儀（日本島津儀器公司）；FEI Tecnai G2 F20 場發(fā)射透射電子顯微鏡[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；KQ-200 KDB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；YB-P6智能透皮試驗(yàn)儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；JY92-2D超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；Zetasizer Nano ZSE 激光粒度分布儀（英國馬爾文公司）；SHA-BA水浴振蕩器（常州市中貝儀器有限公司）；TGL-16GB 臺式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 材料

阿達(dá)帕林對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號A1200006，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；卵磷脂、氫化大豆磷脂、膽固醇、氯代十六烷基吡啶、L-薄荷醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；吐溫-80（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇、甲醇、三氯甲烷（天津凱通化學(xué)試劑廠）；PBS（pH6.8、pH7.4 北京索萊寶技術(shù)有限公司）。

1.3 動物

SD 大鼠（雄性），4~6 周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供，使用許可證號：SYXK（黑）-2021-018。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿達(dá)帕林脂質(zhì)體的制備

2.1.1 普通脂質(zhì)體（AL）的制備 采用薄膜水化法：精密稱取2 mg ADA、50 mg 卵磷脂和12.5 mg 膽固醇溶于20 mL 甲醇-三氯甲烷（體積比1∶1）混合液中，溶解后轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至液體蒸發(fā)完全，瓶底出現(xiàn)均勻的薄膜，再加入20 mL PBS溶液（pH 7.4）水化40 min。將水化后的溶液探頭超聲儀進(jìn)行超聲處理（240~320 W,15 min），經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得AL。

2.1.2 溫敏脂質(zhì)體（ATSL）的制備 取2 mg ADA、復(fù)合磷脂（DPPC∶SPC=3∶1）及12.5 mg膽固醇，按“2.1.1”項(xiàng)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，分別加入20 mL pH 6.8和pH 7.4的PBS溶液進(jìn)行水化。分別將水化后的溶液探頭超聲儀進(jìn)行超聲處理（240~320 W，15 min），經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，得到2種ATSL。

2.1.3 柔性納米脂質(zhì)體（AFL）的制備 將80 mg 大豆卵磷脂、20 mg 膽固醇、2 mg ADA 按“2.1.1”項(xiàng)下溶解、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，將得到的薄膜與20 mL含有適量丙二醇的PBS 磷酸鹽溶液（pH 7.4）水化2 h，超聲處理（240~320 W，15 min），經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到AFL[9]。

2.1.4 彈性納米脂質(zhì)體（AENL）的制備 將30 mg 磷脂、15 mg 吐溫-80 和2 mg ADA 按“2.1.1”項(xiàng)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，加入20 mL PBS 磷酸緩沖溶液（pH 7.4）進(jìn)行水化，待溶液均一穩(wěn)定后超聲處理（240~320 W，15 min），經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得AENL。

2.1.5 可變形脂質(zhì)體（ADL）的制備 用25 mL 三氯甲烷-甲醇溶解80 mg 磷脂、5 mg 膽固醇、2 mg 氯代十六烷基吡啶、2 mg 薄荷醇和2 mg ADA，充分混合。氮?dú)鈿饬飨滦D(zhuǎn)蒸發(fā)，將干燥后的脂肪膜用20 mL PBS 磷酸緩沖液（pH 7.4）水化。超聲處理（240~320 W，15 min）后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得ADL。

2.2 阿達(dá)帕林含量測定方法學(xué)的建立

2.2.1 檢測波長確定及專屬性考察 以三氯甲烷作為空白對照，配制100 μg/mL 的ADA 溶液，在200~400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖1?？紤]到溶劑干擾，選取325 nm 為檢測波長。取6 種空白脂質(zhì)體各1 mL分別溶于10 mL甲醇破乳，于同等條件下進(jìn)行紫外分析，結(jié)果見圖1?？梢姡椒▽傩粤己?。

圖1 ADA（A）和各樣品空白載體（B）的紫外掃描光譜圖Figure 1 UV scanning spectra of ADA（A）and blank carriers for each sample（B）

2.2.2 線性關(guān)系考察 取一定量ADA 對照品，用三氯甲烷配制成質(zhì)量濃度為8.0、11.0、14.0、17.0、20.0、23.0、25.0 μg/mL的對照品溶液，于325 nm波長下測定，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸擬合，得到線性方程A=0.023 2C+0.079 9，R2=0.999 8，表明ADA 質(zhì)量濃度在8.0~25.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度為8、15、25 μg/mL 的ADA 對照品溶液，重復(fù)測定6 次，記錄吸光度，計(jì)算質(zhì)量濃度8、15、25 μg/mL 的溶液吸光度RSD 值分別為2.72%、1.56%、1.59%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為25 μg/mL的ADA對照品溶液，于0、2、4、6、12、24 h取樣，重復(fù)測定6 次，記錄吸光度并計(jì)算RSD 值，結(jié)果RSD 值為0.63%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 精密吸取一定濃度的ADA對照品溶液，同時(shí)加入制備好的空白脂質(zhì)體，配成質(zhì)量濃度為8、15、25 μg/mL 的待測溶液，重復(fù)測定6 次，記錄吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示加樣回收率（n=6）分別為（100.06±0.12）%、（100.05±0.09）%、（99.98±0.71）%，符合方法學(xué)要求。

2.3 阿達(dá)帕林脂質(zhì)體形態(tài)考察

透射電鏡下觀察6種阿達(dá)帕林脂質(zhì)體的大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖2?？梢?，AL、ATSL、AFL、AENL多為均一球形或類球形，分布較均勻，無聚集，ADL電鏡下大小略有差異。

圖2 6種脂質(zhì)體樣品的TEM形態(tài)圖Figure 2 T EM morphology of six types of liposome samples

2.4 阿達(dá)帕林脂質(zhì)體粒徑分布及電位測定

利用激光粒度分析儀測定平均粒徑、粒徑分布和電位值，平行3 次。取6 種阿達(dá)帕林脂質(zhì)體1.0 mL，用蒸餾水稀釋成5.0 mL，測定粒徑，測得平均粒徑、電位見表1，粒徑分布、電位值見圖3?？梢?，ATSL、AFL、AENL 和ADL 粒徑較小，粒徑分布范圍較窄，AL 和采用pH 7.4 PBS 制備的ATSL 均勻性不佳，6種脂質(zhì)體具有表面負(fù)電荷，粒子間不易發(fā)生聚集使體系相對穩(wěn)定。

表1 6種阿達(dá)帕林脂質(zhì)體的粒徑及PDITable 1 Particle size and PDI of six types of adapalene liposomes(n=3,)

表1 6種阿達(dá)帕林脂質(zhì)體的粒徑及PDITable 1 Particle size and PDI of six types of adapalene liposomes(n=3,)

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圖3 6種脂質(zhì)體樣品的粒徑分布及電位分布Figure 3 P article size distribution and zeta potential distribution of six types of liposome samples

2.5 阿達(dá)帕林脂質(zhì)體包封率的測定

取6 種阿達(dá)帕林脂質(zhì)體溶液各1 mL，分別加入甲醇破乳，超聲10 min后過0.45 μm 濾膜，即得總供試品溶液；再分別取6 種阿達(dá)帕林脂質(zhì)體溶液1 mL于離心管中，15 000 r/min，4 ℃低溫離心30 min，取上清液過0.45 μm 濾膜，即得游離供試品溶液。分別將上述樣品進(jìn)行紫外檢測，每組檢測重復(fù)3遍，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得含量分別記作W總以及W游，按照公式“”計(jì)算不同種類的阿達(dá)帕林脂質(zhì)體的包封率，結(jié)果見表2?？梢姡? 種脂質(zhì)體的包封率均較好。

表2 6種脂質(zhì)體樣品的包封率Table 2 Encapsulation rate of six types of liposome samples (n=3,)

表2 6種脂質(zhì)體樣品的包封率Table 2 Encapsulation rate of six types of liposome samples (n=3,)

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2.6 HPLC法測定ADA的質(zhì)量濃度

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸-乙腈（體積比10∶90）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：325 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.6.2 專屬性考察 分別取10 μL 阿達(dá)帕林脂質(zhì)體溶液、阿達(dá)帕林對照對照液、皮膚浸出液和空白脂質(zhì)體溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖4?？梢?，阿達(dá)帕林脂質(zhì)體溶液色譜峰明顯且無拖尾，皮膚浸出液、空白脂質(zhì)體溶液沒有明顯的色譜峰，表明方法專屬性良好。

圖4 皮膚浸出液（A）、空白脂質(zhì)體（B）、ADA原料藥（C）和阿達(dá)帕林脂質(zhì)體（D）的高效液相色譜圖Figure 4 HPLC chromatograms of skin extract(A),blank liposome(B),ADA (C)and adapalene liposome(D)

2.6.3 線性關(guān)系考察 取ADA 溶解于0.2%PEG-400 PBS 溶液配制成質(zhì)量濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0、30.0 μg/mL 的對照品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸擬合，得到線性方程A=48 499C+4.369 3，R2=0.999 8，表明ADA質(zhì)量濃度在2.0~30.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6.4 精密度試驗(yàn) 取ADA 溶解于0.2%PEG-400 PBS 溶液配制成質(zhì)量濃度為4、10 μg/mL 的ADA 對照品溶液。按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 日，每次測定6 次，記錄峰面積。計(jì)算日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表3?？梢?，RSD 值均<3%，表明試驗(yàn)精密度良好。

表3 日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)考察結(jié)果Table 3 Results of Intraday and interday precision(n=6,)

表3 日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)考察結(jié)果Table 3 Results of Intraday and interday precision(n=6,)

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2.6.5 回收率試驗(yàn) 取ADA 溶解于0.2%PEG-400 PBS 溶液，配成質(zhì)量濃度為6.0、12.0、24.0 μg/mL的待測溶液，加入制備好的空白脂質(zhì)體，HPLC 分析平行測定6 次，計(jì)算濃度。結(jié)果測得6.0、12.0、24.0 μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度溶液的平均回收率分別為99.85%、99.96%、99.80%，RSD 值分別為0.57%、0.92%、0.68%，符合方法學(xué)要求。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取ADA 溶解于0.2%PEG-400 PBS 溶液，配制成質(zhì)量濃度為15 μg/mL 的ADA 對照品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 時(shí)取樣進(jìn)行HPLC分析，平行測定6 次。計(jì)算RSD 值為0.27%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 體外經(jīng)皮滲透及滯留試驗(yàn)

2.7.1 離體大鼠皮膚的制備 將大鼠安樂死，在不損傷皮膚的情況下剃去大鼠腹部毛發(fā)，剪下腹部皮膚，去除皮下脂肪、黏液組織和毛細(xì)血管叢，用PBS溶液反復(fù)清洗，備用[10]。

2.7.2 體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn) 采用Franz 擴(kuò)散池進(jìn)行滲透試驗(yàn)。將鼠皮固定于接收池和供給池之間，角質(zhì)層朝向供給池，用彈簧夾固定，使真皮層與接收液緊密接觸，排出氣泡，平衡30 min 后給藥。試驗(yàn)時(shí)，在接收池內(nèi)加入15 mL 含有0.2%PEG-400 的PBS緩沖溶液，池中加入待透皮的脂質(zhì)體，有效擴(kuò)散面積為1.766 cm2，（37.0±0.2）℃恒溫水浴，并以200 r/min 磁力恒速攪拌[11]。分別于2、4、6、8、10、12、24 h 時(shí)精密吸取2 mL 接收液樣品，隨即補(bǔ)回相應(yīng)量的空白接收液并排除氣泡。吸取的樣品液按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測定阿達(dá)帕林的含量，平行測定3 次，按以下公式計(jì)算單位面積累積滲透量（Qn）：

式中：Qn為第n個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的單位面積累積滲透量；V0為接收介質(zhì)總體積；Cn為第n個(gè)點(diǎn)的藥物濃度；Ci為第i（i=n-1）個(gè)點(diǎn)中藥物濃度；Vi為第i次取樣液體積；A為Franz擴(kuò)散池有效擴(kuò)散面積[12]。

根據(jù)不同類型脂質(zhì)體在各時(shí)間點(diǎn)的取樣分析結(jié)果，繪制不同阿達(dá)帕林脂質(zhì)體的累積滲透量（Qn）-時(shí)間（t）曲線。以Qn對時(shí)間t進(jìn)行線性回歸，所得回歸直線的斜率即為穩(wěn)態(tài)滲透速率Js[13]，結(jié)果見圖5。

圖5 6種脂質(zhì)體樣品的體外滲透曲線圖Figure 5 I n vitro drug permeation profiles for six types of liposome samples（n=3）

可見，0~24 h 內(nèi)，6 種脂質(zhì)體與ADA 的滲透趨勢基本一致，不同脂質(zhì)體的Qn均高于ADA 原料藥，不同程度上提高了ADA 的皮膚透過率，其中AENL、ADL、AL 滲透性能相似，比原料藥的累積滲透量略高，ATSL的相變溫度在（36±1）℃。

對12 h 體外滲透情況進(jìn)行擬合，不同劑型的滲透參數(shù)Js和12 hQn結(jié)果見表4，12 h 各脂質(zhì)體組的Qn分別為0.708 8、0.600 9、0.404 8、0.334 1、0.347 1、0.290 1 mg/cm2，均優(yōu)于ADA 對照溶液，且ATSL（pH6.8 PBS）的最高。

表4 6種脂質(zhì)體樣品的數(shù)學(xué)模型擬合方程與相關(guān)參數(shù)Table 4 M athematical model fitting equation and correlation coefficient of six types of liposome samples

2.7.3 體外皮膚滯留試驗(yàn) 24 h后從Franz擴(kuò)散池上取下皮膚，酒精棉球擦拭皮膚表面數(shù)次。充分剪碎后分別用3 mL 無水乙醇提取3 次，合并取上清液，10 000 r/min 高速離心10 min，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定ADA 含量[14]。按以下公式計(jì)算單位面積皮內(nèi)滯留量（Qm）：

式中：Cm為提取液濃度；V為提取液體積；A為經(jīng)皮滲透面積。每組皮膚滯留實(shí)驗(yàn)各進(jìn)行3 次，結(jié)果見圖6。

圖6 6種脂質(zhì)體樣品的單位面積皮內(nèi)滯留量（Qm）Figure 6 Intradermal retention per unit area（Qm）of six types of liposome samples（n=3）

結(jié)果表明，24 h 累積滲透量與單位面積皮內(nèi)滯留量的大小順序?yàn)锳TSL>AFL>AENL>ADL>AL>ADA。24 h 內(nèi)ATSL 是ADA 溶液的5.11 倍和3.0倍，是其他阿達(dá)帕林脂質(zhì)體的1.7~5 倍。從累積釋放率結(jié)果來看，24 h 時(shí)ATSL 的滲透率最高，且水相pH值偏酸性的磷酸緩沖液滲透效果更好。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，痤瘡在青少年中的發(fā)病率高達(dá)85%[15]，臨床上治療方法的研究熱點(diǎn)有阿達(dá)帕林凝膠結(jié)合光療、熱療、抗生素或者其他抗炎藥物協(xié)同治療，暫時(shí)還沒有關(guān)于阿達(dá)帕林脂質(zhì)體應(yīng)用于臨床治療的報(bào)道。

本研究制備了具有不同性質(zhì)的6種阿達(dá)帕林脂質(zhì)體，對其滲透性和皮內(nèi)滯留效果進(jìn)行研究并與ADA 原料藥進(jìn)行比較，結(jié)果表明制備的脂質(zhì)體均在不同程度上提高了ADA的經(jīng)皮滲透效果，從各組脂質(zhì)體滲透曲線圖可知，前12 h 隨著時(shí)間增加，原料藥和各脂質(zhì)體組的經(jīng)皮滲透量隨著時(shí)間的增加而增加，12 h 后，隨著藥物在皮內(nèi)滯留，穩(wěn)態(tài)滲透速率降低[16]，后續(xù)需針對細(xì)胞層面的滲透和滯留進(jìn)一步進(jìn)行考察。從本文的脂質(zhì)體粒徑、包封率及累積滲透率結(jié)果看，AENL 作為脂質(zhì)載體對于ADA 的滲透效果增強(qiáng)并不明顯，分析原因可能是藥物并未被完全包裹，游離藥物過多，后續(xù)需要進(jìn)一步探究。

本研究制備的ATSL，24 hQn、Qm均優(yōu)于其他脂質(zhì)體，主要原因是ATSL 中的磷脂層結(jié)構(gòu)與皮膚細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相似，從而提高了藥物遞送能力以及滯留能力，ATSL 中的藥物滲透速率依賴于皮膚組織的局部溫度，達(dá)到相變溫度（37 ℃）后進(jìn)一步增加了藥物滲透；另外，ATSL 的累積釋放率也高于其他脂質(zhì)體，原因在于ADA為酸性藥物，在弱酸性環(huán)境下解離少，容易透過細(xì)胞膜，加快吸收。但是，在溫敏脂質(zhì)體的制備過程中，旋蒸溫度及時(shí)間，超聲功率及時(shí)間都會影響脂質(zhì)體的包封率進(jìn)而影響脂質(zhì)體的透皮效果，這也對藥物儲存及運(yùn)輸提出新的挑戰(zhàn)，因此還需進(jìn)一步優(yōu)化處方。

綜上所述，ATSL 有效提高了阿達(dá)帕林經(jīng)皮滲透量以及皮內(nèi)滯留量，為ADA新型給藥載體的研究提供了基礎(chǔ)，具有更深入研究的價(jià)值。

（利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司資助，不存在任何利益沖突。）