硝酸鈉和氯化銨對(duì)蠕形康纖蟲(chóng)的毒性影響

石雪，呂湘琳，齊紅莉，劉家樂(lè)

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300392）

盾纖類纖毛蟲(chóng)是海水養(yǎng)殖過(guò)程中常見(jiàn)且多發(fā)的危害性纖毛蟲(chóng)原生動(dòng)物，尤其在富營(yíng)養(yǎng)化水體中常見(jiàn)，可以寄生到軟體動(dòng)物、甲殼類、魚(yú)類等寄主身上進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，引起寄主體表潰爛[1-4]，蠕形康纖蟲(chóng)（Cohnilembus verminus）隸屬盾纖目（Scuticocilliatida），康纖蟲(chóng)屬（Cohnilembus），一般自由生活或棲息在海灣扇貝外套腔[1]。鑒于盾纖類纖毛蟲(chóng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的危害，研究相關(guān)的毒理學(xué)試驗(yàn)對(duì)其病害防治有重要意義[5-9]。

近年來(lái)，現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)和人類活動(dòng)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廢水會(huì)導(dǎo)致氨氮排入水環(huán)境中，使氨氮成為水體中的重要環(huán)境因子之一[10-13]。氨氮是密集型水產(chǎn)養(yǎng)殖水域中的常見(jiàn)污染物，以非電離和電離形式存在[14-15]。未電離的氨氮可通過(guò)細(xì)胞膜，由于其具有脂溶性，對(duì)細(xì)胞有害。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)高濃度氨氮會(huì)對(duì)纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）和亞洲苦草（Vallisneria asiatica）產(chǎn)生氧化脅迫，導(dǎo)致其細(xì)胞中葉綠素含量和蛋白質(zhì)含量下降，加重細(xì)胞的DNA 損傷程度，還會(huì)抑制幼魚(yú)生長(zhǎng)，對(duì)幼魚(yú)的鰓和肝臟組織造成損傷，影響幼魚(yú)非特異性免疫以及營(yíng)養(yǎng)代謝[16-19]。因此，高濃度氨氮會(huì)對(duì)水生生物生長(zhǎng)和活動(dòng)產(chǎn)生有害影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中需嚴(yán)格控制水體中氨氮的濃度，有效防止由于水質(zhì)管理不當(dāng)引發(fā)的危害。

本試驗(yàn)以蠕形康纖蟲(chóng)為研究對(duì)象，探究了硝酸鈉及氯化銨兩種氮源藥物對(duì)蠕形康纖蟲(chóng)的毒性效應(yīng)，為蠕形康纖蟲(chóng)對(duì)氨氮的耐受性研究提供試驗(yàn)依據(jù)，以期為盾纖類纖毛蟲(chóng)的病害防治研究提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)于HCC預(yù)后，大會(huì)報(bào)告使用阿司匹林能夠降低肝癌的發(fā)生；DAAs治療與肝癌復(fù)發(fā)率降低有關(guān)；脂溶性他汀類藥物使用與較低的肝癌發(fā)生及全因死亡率下降有關(guān)。另一項(xiàng)研究基于10個(gè)參數(shù)創(chuàng)建了丙型肝炎抗病毒治療后預(yù)測(cè)肝癌發(fā)生的模型（可在網(wǎng)絡(luò)獲取www.hccrisk.com），將人群分為HCC高、中、低危三組，從而制定更好的篩選策略。解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心的紀(jì)冬等報(bào)告了另一預(yù)后模型僅使用年齡、AFP及肝臟硬度值來(lái)預(yù)測(cè)乙型肝炎肝硬化發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。詳見(jiàn)會(huì)議摘要 91、92、93 和 94。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蠕形康纖蟲(chóng)（C. Verminus）采集于天津北大港濕地，經(jīng)活體觀察和蛋白銀染色確定為蠕形康纖蟲(chóng)，后進(jìn)行單克隆純種培養(yǎng)。纖毛蟲(chóng)培養(yǎng)水體為鹽度30 的人工海水，放入米粒以富集作為纖毛蟲(chóng)食物來(lái)源的天然細(xì)菌，從而保證蠕形康纖蟲(chóng)的正常增長(zhǎng)培養(yǎng)。

慢性毒性試驗(yàn)在六孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，蠕形康纖蟲(chóng)的接種密度為3 ind/mL，每24 h 觀察并記錄蠕形康纖蟲(chóng)的種群密度，當(dāng)纖毛蟲(chóng)數(shù)目達(dá)到衰退期時(shí)結(jié)束試驗(yàn)。慢性毒性試驗(yàn)濃度依據(jù)急性試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，硝酸鈉為0.000、0.425、0.850、1.700和3.400 mg/L，氯化銨為0.000、45.350、90.700、181.400 和362.700 mg/L。每個(gè)處理組重復(fù)3 次。由于氯化銨易揮發(fā)，故氯化銨慢性試驗(yàn)過(guò)程中每24 h 用吸管口細(xì)度小于蟲(chóng)子體積的吸管，從六孔板每孔吸出一半測(cè)試液，并重新配置氯化銨溶液和海水加至原測(cè)試液量，以保證氯化銨的有效性。

1.2 試驗(yàn)方法

劉佳頭發(fā)的味道香香的，飄到我嘴里，真好聞啊，那天晚上，我就追著我媽去買洗發(fā)水，我把小店里所有的洗發(fā)水瓶子都打開(kāi)聞了一遍，還是沒(méi)找到那個(gè)味道，我媽不耐煩地隨便買了一瓶，我不肯，賴在地上打滾，她眼睛一瞪巴掌就甩了過(guò)來(lái)——我媽說(shuō)，自從生了我，她才知道自己還蠻有甩巴掌天分的，你看五個(gè)手指印一個(gè)不少地印在臉上，整齊得像朵花。

根據(jù)周永欣等[20]測(cè)定水生生物毒性試驗(yàn)的方法，計(jì)算每種纖毛蟲(chóng)的半數(shù)致死濃度。所有測(cè)定均在六孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，蠕形康纖蟲(chóng)的接種密度為10 ind/mL，每隔24 h 計(jì)數(shù)。藥物濃度根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，硝酸鈉為26、27、28、29 mg/L、氯化銨為2 600、2 800、3 000、3 200 mg/L，為排除其他因素對(duì)試驗(yàn)的影響，添加不含硝酸鈉和氯化銨的處理組作為對(duì)照組，每個(gè)處理組重復(fù)3 次。

1.2.2 慢性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)所用硝酸鈉購(gòu)自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司（20151108），氯化銨購(gòu)自天津大學(xué)科威公司（20140511）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原生動(dòng)物纖毛蟲(chóng)種群生長(zhǎng)率[21]計(jì)算公式為：

式中：Nt為時(shí)間t時(shí)的種群密度，N0為初始種群密度，t為試驗(yàn)時(shí)間。

纖毛蟲(chóng)是通過(guò)二分裂的方式進(jìn)行種群生長(zhǎng)的[22]，因此世代時(shí)間與種群生長(zhǎng)率（r）之間的關(guān)系為：

不同濃度硝酸鈉作用下蠕形康纖蟲(chóng)種群生長(zhǎng)曲線變化如圖2 所示。高濃度組硝酸鈉作用下蠕形康纖蟲(chóng)的種群增長(zhǎng)曲線符合Logistic 種群生長(zhǎng)曲線，存在停滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期四個(gè)時(shí)期。對(duì)照組無(wú)明顯停滯期，進(jìn)入9 d 指數(shù)增長(zhǎng)期，第10 天達(dá)到種群密度峰值，之后種群密度逐漸開(kāi)始衰退。0.425 mg/L 組硝酸鈉作用下的蠕形康纖蟲(chóng)在經(jīng)歷9 d 的指數(shù)增長(zhǎng)期后達(dá)到峰值，但不存在明顯的穩(wěn)定期。1.700 mg/L 組作用下的蠕形康纖蟲(chóng)達(dá)到峰值的時(shí)間最早（8 d），隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，4 d 后種群密度開(kāi)始衰退。3.400 mg/L 組作用下的蠕形康纖蟲(chóng)在第9 天達(dá)到種群密度峰值，隨后進(jìn)入衰退期。

式中：r為原生動(dòng)物纖毛蟲(chóng)的種群生長(zhǎng)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸鈉和氯化銨對(duì)蠕形康纖蟲(chóng)急性毒性試驗(yàn)