馬爾堡病毒疫苗研究進(jìn)展

樊 毅,李 萍,呂永智,張傳師

馬爾堡病毒(Marburg virus, MARV))可感染人及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(nonhuman primates, NHP),造成嚴(yán)重的馬爾堡出血熱(Marburg hemorrhagic fever, MHF)。該病毒在1967年隨感染的猴子由烏干達(dá)傳播至歐洲,并首次發(fā)現(xiàn)于德國(guó)馬爾堡、法蘭克福和前南斯拉夫的貝爾格萊德[1]。據(jù)文獻(xiàn)記載,馬爾堡病毒在非洲等地先后暴發(fā)了16次,共造成400多人死亡,病死率高達(dá)88%[2]。研究發(fā)現(xiàn),一些與人類有接觸的蝙蝠,如北非果蝠(Rousettus aegyptiacus)是該病毒的天然宿主,病毒可由果蝠傳染給人類,并在人類間傳播。2014年同屬絲狀病毒科的埃博拉病毒在西非大流行,成為全球公共衛(wèi)生緊急事件,使得人們高度關(guān)注絲狀病毒。據(jù)估計(jì),馬爾堡病毒威脅著撒哈拉以南非洲約1.05億人的健康,其流行覆蓋范圍比埃博拉病毒更廣[3]。因此,世界衛(wèi)生組織在2018年將馬爾堡病毒確定為需要緊急研發(fā)疫苗的重點(diǎn)病原體。開展相關(guān)的研究對(duì)于疫病的防控在軍事和社會(huì)方面具有重大意義[4-5]。近期,全球多地陸續(xù)出現(xiàn)人感染馬爾堡病毒病例,且?guī)變?nèi)亞、加納、赤道幾內(nèi)亞和坦桑尼亞均為首次出現(xiàn)人感染馬爾堡病毒疫情,表明病毒有擴(kuò)散趨勢(shì),為全球疫情防控再次敲響了警鐘。雖然馬爾堡病毒的病死率極高,但其較低的暴發(fā)率及感染病例限制了其疫苗的發(fā)展。因此,目前尚無針對(duì)馬爾堡病毒的預(yù)防疫苗和特效治療藥物可供選擇。本文對(duì)馬爾堡病毒及其疫苗研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,以期加深大眾對(duì)馬爾堡病毒的認(rèn)識(shí),為科學(xué)防控及疫苗的研發(fā)提供有價(jià)值的信息。

1 馬爾堡病毒

1.1 病原學(xué) 馬爾堡病毒屬絲狀病毒科,馬爾堡病毒屬,電鏡下呈長(zhǎng)絲狀、卷曲狀、棒狀或者環(huán)狀(圖1A)。病毒長(zhǎng)700～1 400 nm,直徑在75～80 nm,是一種有包膜且不分段的單股負(fù)鏈RNA病毒。馬爾堡病毒基因組長(zhǎng)約19 kb,共編碼7種蛋白,包括NP、VP35、VP40、GP、VP30、VP42及L蛋白(圖1B)。根據(jù)病毒基因序列可將已知馬爾堡病毒分為5種不同的譜系,其中4種可引起人類感染,即馬爾堡病毒(MARV)、瑞士馬爾堡病毒(Ravn virus, RAVV)、象牙海岸馬爾堡病毒(Ivory Coast virus, CIEBOV)和桑吉尼馬爾堡病毒(Sudan virus, SUDV),核酸序列差異僅7%,所以又將這5種不同譜系的馬爾堡病毒分為感染人與非感染人兩種譜系[6-7]。馬爾堡病毒的糖蛋白GP位于病毒顆粒表面,是唯一介導(dǎo)病毒黏附和入侵宿主細(xì)胞的病毒蛋白,因此,大量研究以GP蛋白為靶點(diǎn)開展馬爾堡病毒疫苗的設(shè)計(jì)[8-10]。

圖1 馬爾堡病毒的結(jié)構(gòu)及基因組)

1.2 流行病學(xué) 馬爾堡病毒首次發(fā)現(xiàn)于1967年的德國(guó)馬爾堡、法蘭克福和前南斯拉夫的貝爾格萊德3個(gè)城市,經(jīng)過溯源發(fā)現(xiàn)病毒是從烏干達(dá)進(jìn)口的實(shí)驗(yàn)用非洲綠猴傳染給人類[11]。早期疫病主要呈散發(fā)的方式在非洲地區(qū)流行,未能引起足夠的重視,隨后在2005年安哥拉以及2012年烏干達(dá)先后暴發(fā)大規(guī)模馬爾堡病毒疫情,病死率高達(dá)90%,這也顯示了該病毒有引發(fā)大規(guī)模流行的潛力[12]。2021年8月幾內(nèi)亞西南部發(fā)現(xiàn)馬爾堡病毒病例,該男子在發(fā)病8 d后死亡,這是西非已知的第1例馬爾堡病毒病病例。隨后在2022年9月加納也發(fā)現(xiàn)數(shù)例馬爾堡病毒感染病例。近來,2023年2月赤道幾內(nèi)亞8個(gè)省份中的4個(gè)省份(Centro Sur、Kié-Ntem、Litoral和 Wele-Nzas)的5個(gè)地區(qū)(Bata、Ebebiyin、Evinayong、NsokNsomo和Nsork)暴發(fā)了馬爾堡病毒感染病例,已知確診病例17例,其中12例感染者死亡。2023年3月坦桑尼亞確診了首例馬爾堡病毒病例,截至目前,已有8例確診病例,其中已出現(xiàn)5例死亡,密切接觸者多達(dá)160余人。目前,馬爾堡病毒的流行呈擴(kuò)散趨勢(shì),世界衛(wèi)生組織正對(duì)其進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)[13](見表1)。

表1 馬爾堡病毒流行情況

表2 馬爾堡病毒病疫苗研究進(jìn)展

研究顯示,馬爾堡病毒最初可能由蝙蝠或非靈長(zhǎng)類動(dòng)物傳染給人類,可通過直接接觸感染動(dòng)物的血液、分泌物或體液感染進(jìn)而發(fā)病[15-17]。2009年,科學(xué)家們成功從烏干達(dá)礦場(chǎng)捕獲的健康埃及果蝠中分離出馬爾堡病毒,表明果蝠是馬爾堡病毒的病毒庫和天然宿主[18]。此外,非洲綠猴和豬對(duì)絲狀病毒具有易感性,它們作為宿主同時(shí)發(fā)揮著病毒放大器作用。馬爾堡病毒在人與人之間可通過感染者的分泌物、血液及其他體液傳播,也存在通過接觸污染物表面進(jìn)而感染的風(fēng)險(xiǎn)[19]。目前尚無研究證據(jù)發(fā)現(xiàn)馬爾堡病毒可通過蚊子或其他節(jié)肢動(dòng)物在人類之間傳播[20]。

1.3 致病性馬爾堡病毒的潛伏期 通常在2～21 d,最長(zhǎng)潛伏期可達(dá)26 d。感染早期會(huì)出現(xiàn)突然高燒、發(fā)冷、頭痛、吞咽痛等癥狀,皮膚伴有非瘙癢性的紅斑和丘疹斑,從局部性病灶發(fā)展成彌散性或成片病灶區(qū)域。病程在第3 d通常會(huì)出現(xiàn)嘔吐、腹痛,可能持續(xù)一周的水性腹瀉,同時(shí)伴有嚴(yán)重的疲勞和嗜睡。病程發(fā)展5～7 d會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的出血性皮疹及腎損傷,需進(jìn)行透析來維持生命體征。嚴(yán)重者逐漸發(fā)展為低血壓、休克和多器官衰竭而死亡[21]。大多數(shù)致命病例在發(fā)病第2周死亡。死者的嘔吐物和糞便中通常有新鮮血液,鼻腔、牙齦或陰道等天然孔洞也會(huì)有出血情況[22]。部分感染者通過較長(zhǎng)的恢復(fù)期逐漸好轉(zhuǎn),但往往伴有較多的后遺癥,如肌痛、疲憊、多汗、皮膚脫屑、健忘癥、睪丸萎縮、性欲減退和脫發(fā)等。

2 馬爾堡病毒疫苗的研究進(jìn)展

2.1 滅活疫苗 在馬爾堡病毒最初發(fā)現(xiàn)時(shí),受當(dāng)時(shí)技術(shù)水平的限制,疫苗的研發(fā)主要以通過福爾馬林試劑滅活馬爾堡病毒而制備的滅活疫苗為主。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,滅活疫苗僅能保護(hù)約40%的豚鼠和50%的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物免受同源性病毒的攻擊[23-24],且在體內(nèi)建立的體液免疫和細(xì)胞免疫差異性較大,難以提供較全面的的保護(hù)。由于滅活疫苗存在保護(hù)性不高、保護(hù)期時(shí)間比較短、危險(xiǎn)性較高的缺點(diǎn),所以研究人員將更多的精力投入到了其他分子基因工程疫苗[25-28]。

2.2 DNA疫苗 DNA疫苗具有易生產(chǎn)、無傳染性、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),并且DNA疫苗能夠較好的誘導(dǎo)免疫機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫一直被作為疫苗研發(fā)的首選策略。絲狀病毒類的相關(guān)DNA疫苗在小型動(dòng)物模型中具有較好的免疫效果,可誘導(dǎo)高水平體液免疫和細(xì)胞免疫,但在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中,單質(zhì)粒DNA免疫誘導(dǎo)的保護(hù)力卻不高[29-30]。目前大多數(shù)MARV-DNA疫苗研究主要是靶向病毒的糖蛋白GP。研究顯示MARV-DNA疫苗可以完全保護(hù)小鼠和豚鼠免受病毒攻擊,但在NHP體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中僅能提供部分保護(hù)[31-33]。Geisbert等人的研究中,通過Biojector方式接種啟動(dòng)子經(jīng)修飾的DNA疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生更高的保護(hù)力。同時(shí)在獼猴免疫測(cè)試中發(fā)現(xiàn),含有MARV-Musoke-GP和MARV-Angola GP的DNA疫苗可刺激實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生高水平IgG,針對(duì)同源毒株的攻擊具有較好的保護(hù)力。但所有免疫動(dòng)物在病毒感染后均出現(xiàn)了一定的臨床癥狀,這表明IgG可以降低病毒感染引起的死亡率,并不能完全抑制病毒在體內(nèi)復(fù)制感染[34]?；贒NA疫苗初免,然后通過其他類型的疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫的策略研究已取得一定的成功。在用MARV-GP的DNA疫苗首免,后使用腺病毒載體疫苗rAd5-GP進(jìn)行加強(qiáng)免疫,結(jié)果顯示該免疫方案比單獨(dú)注射其中任何一種疫苗所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)度更高,可誘導(dǎo)更強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng),表達(dá)高水平腫瘤壞死因子α(TNF-α)和γ干擾素(IFN-γ),進(jìn)而構(gòu)筑更強(qiáng)的抗病毒免疫防線[34-36]。

2.3 水泡性口炎病毒載體重組疫苗 水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)是彈狀病毒科的一種負(fù)鏈RNA病毒。Jones, SM等人構(gòu)建了基于減毒VSV病毒載體表達(dá)Zaire埃博拉病毒(ZEBOV)跨膜糖蛋白的重組水皰性口炎病毒疫苗VSVΔG/ZEBOVGP以及表達(dá)馬爾堡病毒GP糖蛋白的VSVΔG/MARVGP,兩種疫苗均能夠保護(hù)獼猴免受EBOV和MARV的攻擊。而VSVΔG/MARVGP疫苗誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)比細(xì)胞免疫反應(yīng)更強(qiáng)。

隨后,Jones SM團(tuán)隊(duì)又基于VSV病毒載體構(gòu)建了表達(dá)MARV-Musoke株糖蛋白GP的重組水皰性口炎病毒疫苗 VSVΔG/MARVGP-Musoke,該疫苗可刺激獼候產(chǎn)生高水平抗MARV IgG抗體(≥1∶1 000),免受同源MARV-Musoke毒株的攻擊,且免疫獼猴對(duì)致病性更強(qiáng)的Angola毒株和同源關(guān)系較遠(yuǎn)的Ravn毒株均表現(xiàn)出很好的保護(hù)力,所有獼猴均無發(fā)病癥狀,生命特征穩(wěn)定。此外,疫苗對(duì)免疫動(dòng)物無不良反應(yīng),表明該疫苗具有較好的保護(hù)性和安全性[37]。Geisbert等人基于VSV水泡性口炎病毒,構(gòu)建了包含VSV-ZEBOV-GP、VSV-MARV-GP和VSV-SEBOV-GP的一種混合疫苗,該疫苗由等量的 VSV-SEBOV-GP、VSV-ZEBOV-GP 和 VSV-MARV-GP載體疫苗組成。在11只獼猴接種了混合疫苗,4個(gè)星期后,這些動(dòng)物中的3只用MARV攻擊,3只用CIEBOV攻擊,3只用ZEBOV攻擊,2只用SEBOV攻擊。結(jié)果顯示接種混合疫苗的獼猴均健康存活。這證明該疫苗可保護(hù)NHP免受所有人類致病性絲狀病毒的代表性菌株的致命攻擊[38]。另一項(xiàng)研究表明,獼猴在接種rVSV-MARV-GP疫苗 14個(gè)月后,進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),體內(nèi)存在的IgG可以產(chǎn)生相應(yīng)的保護(hù)作用[39]。基于該研究,在2014-2016年西非埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)流行期間,一種rVSV-EBOV疫苗成功研制并用于人體接種試驗(yàn)[40]。總而言之,以rVSV平臺(tái)搭載MARV構(gòu)建疫苗很有前景,在接觸病毒后20～30 min內(nèi)注射rVSV疫苗可有效保護(hù)50%～100%的獼猴免受絲狀病毒攻擊,保護(hù)水平取決于病毒株,但是目前還沒有正在進(jìn)行的一期臨床試驗(yàn)的疫苗[41-43]。

2.4 病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒(Virus-Like Particle, VLP)由于不包含病毒核酸,沒有感染與復(fù)制能力,所以具有較高的安全性,并且其形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒相似,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫原性較好的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,是目前病毒疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)[44-48]。Warfield等人使用馬爾堡基質(zhì)蛋白VP40和糖蛋白GP生產(chǎn)了馬爾堡VLP (mVLP)疫苗,該疫苗產(chǎn)生的VLP在形態(tài)上與馬爾堡病毒粒子相似[49]。Swenson等人針對(duì)MARV-Musoke毒株構(gòu)建了VLP疫苗,在NHP中進(jìn)行了測(cè)試,接種動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生了免疫反應(yīng)并產(chǎn)生抗體,4周后進(jìn)行MARV-Musoke、MARV-Ravn和MARV-Ci67毒株攻擊實(shí)驗(yàn),所有NHP都表現(xiàn)出交叉保護(hù),由此說明該疫苗具有較好的免疫原性[50]。蓋微微等人通過使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)馬爾堡病毒糖蛋白 (GP) 和基質(zhì)蛋白 (VP40) 制成MARV-VLP疫苗。該MARV- VLP疫苗與佐劑茯苓多糖 (PCP-II) 混合接種恒河猴產(chǎn)生了高達(dá)1∶1 280的糖蛋白GP特異性IgG抗體滴度和1∶320的病毒中和抗體滴度。MARV-VLP還可以引發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的干擾素-γ (IFN-γ)和白介素-4 (IL-4)分泌。這些數(shù)據(jù)表明,混合了佐劑PCP-II的MARV-VLP疫苗在恒河猴中具有優(yōu)異的免疫原性,可能是一種很有前途的 MARV 候選疫苗[51-52]。John MD等人構(gòu)建了MARV的GP、NP和VP40蛋白病毒樣顆粒疫苗,并使用QS-21佐劑或polyI:C佐劑混合注射獼猴,結(jié)果表明用該疫苗接種后可以完全保護(hù)獼猴免受環(huán)境中MARV-Musoke毒株攻擊[53]。目前研究中的MARV病毒樣顆粒疫苗主要是通過在動(dòng)物細(xì)胞共表達(dá)GP和VP40或者在昆蟲細(xì)胞中通過共同感染 GP、VP40和NP組裝形成VLPs,這些病毒樣顆粒疫苗能夠激活機(jī)體免疫反應(yīng),最終可以誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

2.5 腺病毒載體重組疫苗 腺病毒(adenovirus, Ad)是一種雙鏈DNA病毒,具有感染性高、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易操作等特性,通過編輯插入外源基因,可用于細(xì)胞表達(dá)蛋白和抗體,并且重組腺病毒能夠快速、大量生產(chǎn),其連續(xù)傳代后的基因組穩(wěn)定。以腺病毒為載體構(gòu)建重組毒株轉(zhuǎn)導(dǎo)成功率較高,疫苗進(jìn)入機(jī)體可以模擬病毒感染,刺激機(jī)體黏膜免疫,因此很多新發(fā)傳染病疫苗的研發(fā)都是以改造好的腺病毒為載體來進(jìn)行。

當(dāng)前針對(duì)EBOV已經(jīng)開展了幾種腺病毒疫苗的研究,但是目前對(duì)MARV的研究有限,主流研究是將馬爾堡病毒糖蛋白(GP)搭載在腺病毒血清型5平臺(tái)上制成重組疫苗。在一項(xiàng)研究中,獼猴被給予單劑量MARV-GP的rAd5疫苗。4周后它們被同源MARV攻擊,均沒有出現(xiàn)臨床疾病[34]。Swenson等人重組構(gòu)建了包含EBOV、SUDV 和 MARV(Ravn、Musoke 和 Ci67)毒株的5種糖蛋白,以及 EBOV、MARV-Musoke的2種NP蛋白的腺病毒(CAdVax)。并給獼猴接種這種疫苗,后期通過接種EBOV、SUDV 和 MARV-Musoke/Ci67毒株進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示獼猴機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)所有5種絲狀病毒的抗體,并且沒有動(dòng)物出現(xiàn)臨床疾病[54]。Melinda J Hamer MD等人用有復(fù)制缺陷黑猩猩腺病毒3型(cAd3)為載體,構(gòu)建了MARV-Angola腺病毒疫苗cAd3-Marburg。該疫苗目前已經(jīng)開展人體一期臨床實(shí)驗(yàn),大多數(shù)參與者(n=27/40,68%)有輕度至中度注射部位疼痛或壓痛。所有參與者的全身癥狀主要為輕度至中度,最常見的癥狀是不適(n=18/40,45%)、頭痛(n=17/40,43%)和肌痛(n=14/40,35%)。沒有出現(xiàn)與疫苗相關(guān)的嚴(yán)重不良事件。95%的參與者在單次疫苗接種后4周產(chǎn)生糖蛋白特異性抗體反應(yīng),T細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFN-γ、IL-2和TNF。在48周時(shí)仍有70%的參與者產(chǎn)生糖蛋白特異性抗體反應(yīng)。試驗(yàn)表明該藥物是安全的且具有免疫原性,未來的將在加納、肯尼亞和烏干達(dá)開展2期臨床試驗(yàn)[55]。

3 小結(jié)與展望

馬爾堡病毒發(fā)現(xiàn)至今已超過50多年,病毒致病力強(qiáng),全球目前仍然沒有治療方法和預(yù)防藥物。由于MARV病死率高達(dá)88%,屬于生物安全四級(jí)病原微生物,因此其相關(guān)的致病機(jī)制和疫苗的研究受到一定的限制,研究進(jìn)度緩慢。而目前非洲多國(guó)相繼報(bào)道人感染馬爾堡病毒病例,且疫情呈擴(kuò)散趨勢(shì),加快馬爾堡病毒的疫苗及藥物研究迫在眉睫。目前,馬爾堡病毒疫苗的研究中,腺病毒(CAdVax-panFilo、rAD5或cAd3)載體重組馬爾堡病毒蛋白的病毒活載體疫苗具有較好發(fā)展和應(yīng)用前景,其中cAd3-Marburg疫苗是目前唯一進(jìn)入一期臨床實(shí)驗(yàn)的疫苗。而水皰性口炎病毒重組疫苗技術(shù)也具有高效、快速的特點(diǎn),目前以該技術(shù)構(gòu)建的埃博拉病毒疫苗在西非已獲得生產(chǎn)許可,其有效率高達(dá)97.5%,且具有很好的安全性,其在馬爾堡病毒疫苗的運(yùn)用上也具有較好的應(yīng)用前景。其他種類疫苗如滅活疫苗、DNA疫苗及亞單位疫苗雖然各具優(yōu)勢(shì),但其在免疫原等方面仍需要進(jìn)一步優(yōu)化。2018年世界衛(wèi)生組織將馬爾堡病毒確定為需要緊急研發(fā)疫苗的重點(diǎn)病原體,旨在加速全球馬爾堡病毒疫苗的研發(fā),完善疫苗評(píng)估,建立能夠保護(hù)全世界人民的馬爾堡病毒防控體系。

利益沖突：無