滅活的新型結(jié)核病疫苗菌株(B/R菌株)對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞免疫記憶的影響

豐啟盈,鄧喜玲,張 杰,董江濤,柳小玲,梁 粟,王 菊,張 輝,吳江東,章 樂,吳 芳,張萬江

結(jié)核病(Tuberculosis, TB),是結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis, Mtb)作為病原體所引起的機(jī)體慢性傳染性疾病[1],是影響人類健康和導(dǎo)致死亡的主要疾病之一。2022年全球結(jié)核病報(bào)告顯示,受COVID-19流行的影響,結(jié)核病確診人數(shù)在2017年至2019年大幅增長后,2020年患病人數(shù)顯著減少,但這一改變?cè)?021年再次扭轉(zhuǎn),全球預(yù)估有1 060萬人患病,與2020年患病人數(shù)相比增加4.5%[2]。目前世界范圍內(nèi)唯一獲準(zhǔn)應(yīng)用的結(jié)核病預(yù)防性疫苗——卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG),其問世已超百年,近年來越來越多的研究對(duì)其保護(hù)效力提出質(zhì)疑。雖然BCG對(duì)新生兒結(jié)核與兒童重癥結(jié)核病具有較好且長時(shí)間的預(yù)防作用[3],但對(duì)于潛伏性肺結(jié)核與成人肺結(jié)核,BCG的保護(hù)作用并不穩(wěn)定[4],且BCG缺失了與結(jié)核病致病高度相關(guān)的RD1和RD2區(qū)域編碼的相關(guān)抗原[5]。加之耐藥結(jié)核與HIV感染等因素對(duì)結(jié)核病流行的影響,BCG的保護(hù)效用已無法滿足現(xiàn)今結(jié)核病防治的嚴(yán)峻形勢(shì),研制出更為有效的新型結(jié)核病疫苗,已然是重要方向。

目前,根據(jù)研究平臺(tái)的不同,可將正在研制的結(jié)核病疫苗分為兩大類:分枝桿菌全菌衍生疫苗與亞單位疫苗[6-7]。全菌疫苗因包含更為完整的抗原成分,可能比亞單位疫苗具有更優(yōu)的免疫原性,但其中活菌疫苗的安全性需要更為廣泛和長期的研究與評(píng)估[8]。相比之下,滅活疫苗的安全性更為可靠,且利于保存與運(yùn)輸。分枝桿菌滅活疫苗始終在結(jié)核疫苗發(fā)展史上擁有一席之地,如RUTI與MIP兩款疫苗已在臨床試驗(yàn)中展示出良好效果[9]。

本課題組前期成功構(gòu)建并選育的新型結(jié)核病疫苗菌株B/R菌株[10],是以BCG菌株與H37Ra菌株為親本菌株,利用原生質(zhì)體與電穿孔技術(shù)融合而成的結(jié)核桿菌融合菌株。目前已完成安全性[11]、生物特性與遺傳性狀[12]方面的研究,并以實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株在免疫小鼠后,可建立較高水平免疫記憶與短期保護(hù)效力[13]。為進(jìn)一步探索B/R菌株滅活后建立小鼠免疫記憶的能力,研究滅活B/R菌株作為結(jié)核病疫苗的可能性,本研究以滅活B/R菌株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探討其對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞免疫記憶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株種屬 BCG菌株購自中國食品藥品檢定研究院,B/R菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性 C57BL/6小鼠,6～8周齡,購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心集中飼養(yǎng)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周無異常后,開展實(shí)驗(yàn)。所有研究方法依照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)的有關(guān)要求進(jìn)行開展,實(shí)驗(yàn)方案已通過石河子大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑 1640培養(yǎng)基購自Thermo Fisher公司;胎牛血清購自Hyclone公司;小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶生物科技有限公司;Anti-MouseCD4-PE、Anti-Mouse CD8a-PE、Anti-Mouse CD44-PE Cy5.5與Anti-Mouse CD62L-FITC購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株處理與滅活 將保存在-80 ℃冰箱的BCG菌株與B/R菌株取出,置于生物安全柜中自然解凍至常溫。將BCG菌株與B/R菌株分別接種至新制的改良羅氏培養(yǎng)基斜面上,置于37 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳代3次后選擇生長狀態(tài)良好的菌株用于實(shí)驗(yàn)。取適量菌株充分研磨,而后以PBS進(jìn)行稀釋,期間利用細(xì)菌比濁儀檢測(cè)懸液濃度,將各菌株懸液濃度調(diào)整為1×107cfu/mL。將制備完成的懸液置于干式恒溫儀中,在100 ℃,30 min條件下[14],制備滅活的菌株懸液。

1.2.2 動(dòng)物分組與疫苗免疫 將小鼠隨機(jī)分為PBS組、BCG組、B/R組與滅活B/R組,每組9只。取各實(shí)驗(yàn)組菌株0.1 mL懸液(即1.0×106cfu),通過背部皮下注射,以單次免疫的接種方案分別免疫各組小鼠,PBS組注射0.1 mL PBS作為陰性對(duì)照。

1.2.3 分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞 在免疫小鼠后第9周、第12周與15周,無菌條件下取各組小鼠脾臟,制備脾臟單細(xì)胞懸液。小心吸取單細(xì)胞懸液于淋巴細(xì)胞分離液上,注意保持液面界限清晰。室溫條件下,懸液以水平轉(zhuǎn)子800 g離心,20 min。緩慢吸取第2層環(huán)狀乳白色液體層,至無菌的15 mL離心管中,向其中加入10 mL的細(xì)胞洗滌液,250 g離心10 min。棄上清,加入PBS重懸細(xì)胞,250 g離心10 min,2次。1 mL PBS重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL。

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) 免疫后淋巴細(xì)胞的分型及數(shù)量比例分別取各組100 μL細(xì)胞懸液至標(biāo)記好的1.5 mL離心管中,按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入CD4、CD8a、CD44與CD62L熒光標(biāo)記抗體,4 ℃,避光孵育30 min。孵育完成后,向管中加入1 mL PBS,4 ℃,300 g離心5 min,棄上清,重復(fù)2次。最后加入500 μL PBS重懸細(xì)胞,準(zhǔn)備流式上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)設(shè)置空白管與抗體單標(biāo)管,用以調(diào)節(jié)相關(guān)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)遵從以下設(shè)門原則:設(shè)置P1門用于淋巴細(xì)胞分選,設(shè)置P2門用于分選CD4+、CD8+細(xì)胞,通過檢測(cè)CD62L,CD44的表達(dá)情況,區(qū)分中央型T淋巴細(xì)胞TCM(CD62L高表達(dá),CD44高表達(dá))與效應(yīng)型T淋巴細(xì)胞TEM(CD62L低表達(dá),CD44高表達(dá))細(xì)胞數(shù)量水平。

1.2.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) 免疫后經(jīng)PPD刺激淋巴細(xì)胞的分型及數(shù)量比例提取各實(shí)驗(yàn)分組的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,置于24孔培養(yǎng)板中,單孔置入細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)。向每孔內(nèi)分別加入20 μL anti-CD28mcAb工作液和終濃度為10 μg/mL的結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD),再添加RPMI-1640完全培養(yǎng)基至1 mL。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃,5% CO2中培養(yǎng)72 h后,收集各組脾臟淋巴細(xì)胞,4 ℃,300 g,離心5 min,棄上清,加入100 μL PBS重懸細(xì)胞。后續(xù)抗體孵育、上機(jī)操作與設(shè)門原則同上所述。

2 結(jié) 果

2.1 免疫后各組小鼠CD4+TCM與TEM細(xì)胞水平 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,免疫小鼠后第9周、第12周與第15周,在CD4+T細(xì)胞分型中,各實(shí)驗(yàn)組TCM(F9周=13.2,F12周=15.97,F15周=15.4,P<0.05)和TEM(F9周=28.15,F12周=13.6,F15周=7.435,P<0.05)細(xì)胞比例均顯著高于PBS組(圖1),這與前期的研究結(jié)果相符。B/R組、滅活B/R組與BCG組相比,在免疫后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)出CD4+TCM細(xì)胞比例差距較小。滅活B/R組僅在第12周時(shí)CD4+TEM細(xì)胞比例高于BCG組與B/R組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組免疫小鼠后不同時(shí)間CD4+TCM和TEM細(xì)胞占比均保持在較高水平, BCG組、B/R組與滅活B/R組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 免疫后各組小鼠CD8+TCM與TEM細(xì)胞水平 對(duì)于CD8+T細(xì)胞而言,在免疫后不同時(shí)間點(diǎn),各實(shí)驗(yàn)組CD8+TCM(F9周=8.924,F12周=5.524,F15周=6.574,P<0.05)和TEM(F9周=6.13,F12周=20.15,F15周=9.268,P<0.05)細(xì)胞比例均顯著高于PBS組(圖2)。在第9周、第15周與第12周時(shí),各實(shí)驗(yàn)組CD8+TCM和TEM細(xì)胞占比差異較小,兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。滅活B/R組僅在第15周時(shí),CD8+TCM細(xì)胞比例稍高于BCG組,但此時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 免疫后經(jīng)PPD刺激各組小鼠CD4+TCM與TEM細(xì)胞水平 免疫第9周、第12周與第15周后再經(jīng)特異性抗原PPD刺激,滅活B/R組、B/R組與BCG組較PBS組相比CD4+TCM(F9w=9.659,F12周=9.326,F15周=39.88,P<0.05)與TEM(F9周=11.2,F12周=6.936,F15周=11.93,P<0.05)細(xì)胞比例高出的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。除12周時(shí)CD4+TCM外,滅活B/R組在其余各時(shí)間點(diǎn)的CD4+TCM與TEM細(xì)胞比例均高于BCG組,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傮w而言,在以上3個(gè)時(shí)間點(diǎn)免疫小鼠后再經(jīng)PPD刺激,BCG組、B/R組與滅活B/R組3者間CD4+TCM與TEM的差異,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)再經(jīng)刺激,各組小鼠淋巴細(xì)胞CD4+ TCM與TEM水平)

2.4 免疫后經(jīng)PPD刺激各組小鼠CD8+TCM與TEM細(xì)胞水平 免疫第9周、第12周與第15周后再經(jīng)特異性抗原刺激,BCG組、B/R組與滅活B/R組與PBS組相比,CD8+TCM(F9周=7.242,F12周=67.71,F15周=138.8,P<0.05)和TEM(F9周=9.295,F12周=10.86,F15周=38.47,P<0.05)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。值得注意的是,在第15周時(shí),滅活B/R組與B/R組的CD8+TCM(q滅活B/R=12.24,qB/R=12.61,P<0.05)與TEM(q滅活B/R=7.191,qB/R=4.997,P<0.05)細(xì)胞比例均顯著高于BCG組。第9與12周,各實(shí)驗(yàn)組間CD8+TCM與TEM水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第15周時(shí),滅活B/R組與B/R組間CD8+TCM與TEM水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)再經(jīng)刺激,各組小鼠淋巴細(xì)胞CD8+ TCM與TEM水平)

3 討 論

了解預(yù)防疾病或初始感染所需的免疫反應(yīng),是開發(fā)有效疫苗的關(guān)鍵[15]。結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程,涉及宿主免疫系統(tǒng)和細(xì)胞因子間的相互作用。首先,固有免疫在抵抗MTB感染中發(fā)揮著重要作用[16-17]。巨噬細(xì)胞作為首道防線,只有在數(shù)量眾多且干預(yù)及時(shí)的情況下才能控制MTB的感染[18],否則將會(huì)淪為MTB胞內(nèi)寄生的庇護(hù)所。當(dāng)感染蔓延至淋巴結(jié),適應(yīng)性免疫啟動(dòng)。體液適應(yīng)性免疫在結(jié)核病中的作用具有不確定性[19-20],機(jī)體抵抗MTB的感染由細(xì)胞免疫起決定性作用。依據(jù)表面抗原的不同,T細(xì)胞被分為CD4+與CD8+兩大亞群。由于CD4+T細(xì)胞耗竭,HIV患者感染結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)是單獨(dú)感染結(jié)核病的15～20倍[21],這足以證明CD4+T細(xì)胞在結(jié)核病免疫中的關(guān)鍵作用。以往一般認(rèn)為CD8+T細(xì)胞在控制MTB的感染中沒有作用,但這是不正確的。CD8+T細(xì)胞通過組織相容性復(fù)合物Ⅰ類分子識(shí)別MTB感染,并產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)。事實(shí)上,BCG對(duì)CD8+T 細(xì)胞的誘導(dǎo)不足被認(rèn)為是其保護(hù)效果較差的主要原因之一[22]。

機(jī)體應(yīng)對(duì)慢性感染性疾病時(shí),免疫記憶由經(jīng)抗原初次刺激后產(chǎn)生的記憶性T細(xì)胞主導(dǎo),該細(xì)胞具有自我更新能力可持續(xù)存在,再次受到同一抗原入侵時(shí)即刻發(fā)動(dòng)[23-24]。記憶性T細(xì)胞可分為TCM和TEM兩類細(xì)胞,前者長期存在于機(jī)體內(nèi),參與免疫應(yīng)答過程,后者生存時(shí)間較短但具有更強(qiáng)的免疫原性。再次接觸相同抗原時(shí),增殖能力較強(qiáng)的TCM可迅速分化為效用T淋巴細(xì)胞與TEM,TEM可快速啟動(dòng)免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)中,在未經(jīng)刺激的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CD4+T細(xì)胞流式結(jié)果中,滅活B/R組與B/R組間CD4+TCM、TEM的水平差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示,免疫小鼠后第9周、第12周與第15周,滅活B/R組、B/R組與BCG組CD4+TCM和TEM細(xì)胞數(shù)量差異不大且差異在各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傮w來看,滅活B/R菌株與B/R菌株誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生CD4+TCM和TEM的效力與BCG菌株相當(dāng),這與前期研究結(jié)果并不一致。本次實(shí)驗(yàn)中B/R菌株未展現(xiàn)出在檢測(cè)后期CD4+TEM顯著高于BCG菌株的結(jié)果,各實(shí)驗(yàn)組菌株所誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+TEM,均保持在較高水平。

能否誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答是評(píng)價(jià)結(jié)核病疫苗的首要標(biāo)準(zhǔn)[17],其具體表現(xiàn)為機(jī)體的免疫記憶水平。免疫記憶指再次感染相同抗原,引起較初次感染更為快速且強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[25]。在本研究中,免疫小鼠后第9周、第12周與第15周,分離淋巴細(xì)胞經(jīng)體外PPD刺激,滅活B/R組、B/R組與BCG組所產(chǎn)生CD4+和CD8+的TCM和TEM均顯著高于PBS組,證明滅活B/R組、B/R組與BCG組一致,均可誘導(dǎo)免疫記憶在二次應(yīng)答中產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。無論是CD4+或CD8+的TCM和TEM,在以上3個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi),各實(shí)驗(yàn)組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明滅活B/R菌株誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力與B/R、BCG菌株基本相當(dāng),熱滅活未對(duì)B/R組的免疫原性造成損害。免疫后第15周,滅活B/R與B/R菌株可誘導(dǎo)與BCG相比更高水平的CD8+TCM和TEM,這與先前的研究一致[26]。有研究認(rèn)為,BCG在誘導(dǎo)TEM上的不足是其保護(hù)效力隨年齡增長而減弱的原因[27-28],這提示滅活B/R與B/R菌株擁有較BCG更具優(yōu)勢(shì)的免疫保護(hù)期限。

滅活疫苗在各類疾病的預(yù)防中應(yīng)用廣泛,熱滅活在其他病原體上已有較多成功應(yīng)用。在一定限度內(nèi),熱滅活一般不影響滅活產(chǎn)品的免疫原性[29-30]。本研究中滅活B/R菌株誘導(dǎo)免疫記憶的能力與B/R菌株相當(dāng),在研究后期甚至表現(xiàn)出優(yōu)于BCG菌株的效力。綜上所述,我們證明了熱滅活不影響B(tài)/R菌株對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞免疫記憶的誘導(dǎo),滅活B/R菌株可以促進(jìn)高水平免疫記憶細(xì)胞的產(chǎn)生,并在保護(hù)期限方面可能更具優(yōu)勢(shì)。

利益沖突：無