靈芝酸治療阿爾茨海默病作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

覃云鵬,邵 楠,葉 樹,宋 航,蔡 標(biāo),3,4

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,安徽 合肥 230012;3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所,安徽 合肥 230012;4.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230012)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,是老年人癡呆最常見的類型[1]。AD患病人數(shù)及發(fā)病率的逐漸增多給家庭和社會(huì)帶來了巨大的健康問題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AD患者的初期臨床癥狀主要表現(xiàn)為記憶障礙,隨著疾病進(jìn)展出現(xiàn)認(rèn)知和行為功能障礙。β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)積聚形成的老年斑、Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)被認(rèn)為是促進(jìn)AD發(fā)生的兩個(gè)重要病理特征[2]。此外,AD發(fā)病機(jī)制可能與膽堿能系統(tǒng)失衡、神經(jīng)炎癥、胃腸道菌群失調(diào)和氧化應(yīng)激等有關(guān)[3]。由于AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚無有效治療AD的方法。臨床治療以緩解癥狀為主,不能達(dá)到治愈的效果,而且可能會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)。

靈芝是著名的“藥食同源”菌類。靈芝酸屬于三萜類化合物,是靈芝子實(shí)體中重要的生物活性成分[4]。研究證實(shí),靈芝酸可以緩解神經(jīng)炎癥、抗抑郁[5]、減少海馬神經(jīng)元凋亡、緩解大腦生理衰退和治療AD[6]。由于靈芝的種類繁多,成分復(fù)雜,對(duì)于研究整體藥物往往不具有說服力與代表性,且針對(duì)靈芝酸的藥理學(xué)作用,特別是在神經(jīng)退行性疾病方面的機(jī)制目前尚不清晰。因此,探索靈芝酸治療AD的機(jī)制具有重要意義。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)的研究手段,收集靈芝酸與AD的共同靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性,為靈芝酸治療AD提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

PC12細(xì)胞株(大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株):中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清:以色列Biological Industries公司;Aβ25-35:美國(guó)Sigma公司;靈芝酸A:北京Solarbio公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell count kit-8,CCK-8):美國(guó)GLPBIO公司;RIPA裂解液:上海Beyotime公司;GAPDH兔抗大鼠抗體:成都Zen BioScience公司;磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶(phosphorylated serine/threonine kinase,p-AKT)兔抗大鼠抗體:美國(guó)Cell Signaling Technology公司;磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(phosphorylated phosphoinositide 3-kinase,p-PI3K)兔抗大鼠抗體:英國(guó)Abcam公司;山羊抗兔IgG二抗(HRP標(biāo)記):美國(guó)Abbkine公司。

2 方法

2.1 藥物成分分析及靶點(diǎn)收集 在Pubchem數(shù)據(jù)庫(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中輸入靈芝酸的英文全稱“Ganoderic acid”,得到不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的靈芝酸,收集靈芝酸中主要成分的相關(guān)信息,并將其結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss target prediction平臺(tái)(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),取預(yù)測(cè)得分大于0的靶標(biāo),去除重復(fù)校正后作為藥物靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)收集 在Disgenet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)和Genecards數(shù)據(jù)庫(http://Genecards.org)中,以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,獲得疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)。最后將3個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)綜合統(tǒng)計(jì),去掉其中重復(fù)的靶點(diǎn),提高準(zhǔn)確性。

2.3 構(gòu)建“活性成分—疾病—潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 通過Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),將靈芝酸的活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因和AD相關(guān)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行匹配,繪制韋恩圖。采用Cytoscape 3.7.2軟件(http://www.cytoscape.org)構(gòu)建“活性成分—疾病—潛在作用靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò),使用Network Analyzer功能對(duì)靈芝酸類化合物的主要活性成分進(jìn)行分析,探究靈芝酸與AD相互作用基因的影響。節(jié)點(diǎn)連接度(Degree)反映該成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù),即該成分的重要性。

2.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interactions,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及核心靶點(diǎn)的篩選 將靈芝酸治療AD的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(http//stringdb.org/),設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”,結(jié)果收集閾值高于0.4的PPI,獲取靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù),以便進(jìn)行進(jìn)一步的研究。隨后利用Cytoscape軟件將數(shù)據(jù)可視化,建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)關(guān)聯(lián)程度調(diào)整節(jié)點(diǎn)的大小和顏色的深淺情況。根據(jù)Degree值的大小將靶點(diǎn)進(jìn)行排序,選取分值大于平均分的基因作為核心靶點(diǎn),最后將排名前30的靶點(diǎn)使用R 3.6.0軟件繪制條形圖。

2.5 靶點(diǎn)的生物功能及通路富集分析 基于R 3.6.0軟件,使用Bioconducter生物信息軟件包,對(duì)靈芝酸治療AD的交集基因進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號(hào)通路分析(選取條件為P<0.05,Q<0.05)。以研究靈芝酸治療AD靶點(diǎn)的主要生物進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞組分等,將結(jié)果進(jìn)行圖表可視化。

2.6 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)和處理 將PC12細(xì)胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,并在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用含30 μmol/L Aβ25-35的培養(yǎng)基干預(yù)24 h建立AD細(xì)胞模型[7]。

2.7 CCK-8法篩選靈芝酸A的最佳濃度 根據(jù)成分篩選結(jié)果,靈芝酸為排名前三的核心成分之一。此外,相較其他成分而言,有關(guān)靈芝酸神經(jīng)保護(hù)作用的報(bào)道更多聚焦于靈芝酸A[8]。因此,本研究選用靈芝酸A進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將1×105/mL PC12細(xì)胞接種于96孔板中,每孔100 μL,待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行試驗(yàn)。分為7組:正常組,不同濃度(5、10、20、50、100、200 μmol/L)的靈芝酸A組。每組重復(fù)6次。處理24 h后,棄去舊培養(yǎng)基,每孔中加入100 μL含10 μL CCK-8試劑的培養(yǎng)基,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后,最后使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度,根據(jù)細(xì)胞存活率選取安全用藥濃度。然后將PC12細(xì)胞分為以下5組:對(duì)照組,模型組,靈芝酸A低劑量(10 μmol/L)、中劑量(20 μmol/L)、高劑量(50 μmol/L)組。每組重復(fù)6次。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,選取最佳用藥濃度。

2.8 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 取具有良好生長(zhǎng)狀態(tài)的PC12細(xì)胞,計(jì)數(shù)后稀釋至合適的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,分為對(duì)照組、模型組、靈芝酸A組,對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基,其他組加入含30 μmol/L Aβ25-35的DMEM以建立AD細(xì)胞模型。靈芝酸A組加入含最佳濃度靈芝酸A的DMEM。培養(yǎng)24 h后,置于倒置顯微鏡下,選擇合適的放大倍數(shù),觀察細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。

2.9 Western blot法檢測(cè)PC12細(xì)胞p-AKT和p-PI3K蛋白表達(dá)水平 將PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、靈芝酸A組,根據(jù)最佳用藥濃度進(jìn)行相應(yīng)的藥物處理。藥物干預(yù)結(jié)束后,加入細(xì)胞裂解液,通過吹打或超聲充分裂解細(xì)胞,然后離心收集細(xì)胞上清液,最后加入蛋白上樣緩沖液煮沸后得到蛋白樣品。將每組蛋白樣品按順序加至SDS-PAGE凝膠孔中電泳,電泳結(jié)束后置于轉(zhuǎn)膜儀中轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TBST洗滌,然后孵育對(duì)應(yīng)的一抗抗體,并于4 ℃環(huán)境下孵育過夜。第2天,使用TBST洗滌后,加入預(yù)先配置好的二抗溶液,室溫孵育1 h。二抗孵育完成后,將洗滌后的蛋白條帶置于自動(dòng)成像儀內(nèi)檢測(cè)。使用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度值定量分析。

3 結(jié)果

3.1 靈芝酸與AD靶點(diǎn)收集 通過Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索“Ganoderic acid”,共獲得176種化合物。其中,7種靈芝酸目前處于不同臨床試驗(yàn)階段,具有良好的疾病治療和預(yù)防前景[9],分別為靈芝酸 A、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸DM、靈芝酸F、靈芝酸X、靈芝酸Y。隨后這將7種靈芝酸化合物導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫,取預(yù)測(cè)得分大于0的靶標(biāo)作為藥物靶點(diǎn),去除重復(fù)后獲得247個(gè)靶點(diǎn)。這表明靈芝酸具有多成分、多靶點(diǎn)的特征。通過檢索Disgenet數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫和Genecards數(shù)據(jù)庫,去除重復(fù)后得到AD靶點(diǎn)1 020個(gè)。將靈芝酸活性成分作用靶點(diǎn)與AD靶點(diǎn)相匹配,得到靈芝酸與AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)56個(gè)。見圖1。結(jié)果提示,靈芝酸可能通過共同作用靶點(diǎn)的協(xié)同作用發(fā)揮治療AD的功能。

圖1 靈芝酸類化合物AD靶點(diǎn)韋恩圖

3.2 活性成分—疾病—關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將活性成分和潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,得到“靈芝酸活性化合物—AD—潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。見圖2。圖中紫色代表靈芝酸類化合物中7種活性成分,紅色代表疾病,綠色代表56個(gè)共同靶點(diǎn)。使用Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?通過Degree值篩選核心成分。見表1。結(jié)果表明,靈芝酸D、靈芝酸A、靈芝酸C2為Degree值排名前3的活性成分,說明這些活性成分可能在靈芝酸治療AD中起著關(guān)鍵作用。

表1 靈芝酸的核心成分在網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)浞治?/p>

圖2 成分—靶點(diǎn)—疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)以及核心靶點(diǎn)分析 將靈芝酸與AD的56個(gè)共同靶點(diǎn)基因輸入至STRING數(shù)據(jù)庫,得到蛋白相互作用信息,隨后導(dǎo)入Cytocape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖3A。其中蛋白之間的相互關(guān)聯(lián)越多,則它的節(jié)點(diǎn)越大,顏色越深。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap中,通過Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?通過Degree值排序,選取分值大于平均分的基因作為核心靶點(diǎn),將前30個(gè)靶點(diǎn)使用R 3.6.0繪制條形圖。見圖3B。其中排名前10的靶點(diǎn)依次為AKT1、ALB、MAPK3、CASP3、TNF、MAPK1、PTGS2、JUN、SRC、STAT3。

注:A.PPI網(wǎng)絡(luò);B.基于PPI拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)排序(排名前30)

3.4 GO富集分析 通過GO富集分析可以大致了解基因富集在哪些生物學(xué)功能、途徑或細(xì)胞定位,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。本研究GO富集分析結(jié)果顯示:共有1 648個(gè)GO條目(P<0.05,Q<0.05),包含1 513個(gè)生物學(xué)進(jìn)程(biological process,BP)條目,35個(gè)細(xì)胞組成(cellular component,CC)條目,100個(gè)分子功能(molecular function,MF)條目,并展示各部分富集基因數(shù)排名前20的通路可視化條形圖。其中,條形的長(zhǎng)度代表基因的數(shù)量,顏色的深淺代表顯著性水平。見圖4。在GO富集的BP分析中,基因主要富集在對(duì)脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、衰老(aging)、調(diào)節(jié)神經(jīng)元死亡(regulation of neuron death)等。通過CC分析,可以了解到,靈芝酸治療AD的靶點(diǎn)大多集中膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)和膜區(qū)(membrane region)等。在MF分析中可以看出,靶點(diǎn)主要涉及內(nèi)肽酶活性(endopeptidase activity)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)等。

注:A.生物學(xué)進(jìn)程;B.細(xì)胞組成;C.分子功能

3.5 KEGG通路富集分析 根據(jù)KEGG通路富集分析結(jié)果,共得到154條KEGG信號(hào)通路。以Count值排序,展示富集基因數(shù)排名前20的通路可視化氣泡圖。見圖5。其中,氣泡顏色的深淺代表顯著性水平。結(jié)果顯示,靈芝酸治療AD主要涉及的通路如下:神經(jīng)變性(pathways of neurodegeneration),17個(gè)基因;人巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection),16個(gè)基因;卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection),15個(gè)基因;癌癥中蛋白聚糖(proteoglycans in cancer),15個(gè)基因;TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway),14個(gè)基因;乙型肝炎(hepatitis B),14個(gè)基因;糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications),13個(gè)基因;細(xì)胞凋亡(apoptosis),13個(gè)基因;C型凝集素受體信號(hào)通路(C-type lectin receptor signaling pathway),13個(gè)基因;恰加斯病(Chagas disease),13個(gè)基因。表明靈芝酸的活性成分靶點(diǎn)分布于不同的通路,靈芝酸可能通過多個(gè)通路對(duì)AD發(fā)揮作用。

圖5 靈芝酸與AD交集靶點(diǎn)的KEGG通路圖

3.6 靈芝酸A安全濃度和最佳用藥濃度的篩選 與對(duì)照組比較,當(dāng)靈芝酸A濃度為5、10、20、50 μmol/L時(shí),細(xì)胞存活率沒有明顯改變,而當(dāng)靈芝酸A濃度為100、200 μmol/L時(shí),細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05),表明對(duì)海馬神經(jīng)元造成了損傷。見圖6a。因此,后期實(shí)驗(yàn)選擇10、20、50 μmol/L作為靈芝酸A低、中、高劑量組的用藥濃度。結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05);與模型組比較,靈芝酸A 10 μmol/L組細(xì)胞存活率沒有明顯改變,靈芝酸A 20、50 μmol/L組細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05),見圖6b。結(jié)果表明,靈芝酸A可以抑制AD細(xì)胞模型中的細(xì)胞死亡,其中以高劑量組效果最好。因此,選用50 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)靈芝酸A組的用藥劑量。

注:A.對(duì)照組;B.靈芝酸A 5 μmol/L組;C.靈芝酸A 10 μmol/L組;D.靈芝酸A 20 μmol/L組;E.靈芝酸A 50 μmol/L組;F.靈芝酸A 100 μmol/L組;G.靈芝酸A 200 μmol/L組;H.模型組;與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.7 靈芝酸A對(duì)AD細(xì)胞模型形態(tài)的影響 對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,貼壁生長(zhǎng),呈梭形或多邊形,交織成網(wǎng)狀。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞數(shù)目明顯減少,形態(tài)明顯損傷,出現(xiàn)不同程度的變圓、皺縮、脫落,細(xì)胞間隙增大。與模型組比較,靈芝酸A組細(xì)胞數(shù)目增多,整體形態(tài)趨于正常,單一部分細(xì)胞減少。結(jié)果證實(shí),靈芝酸A對(duì)AD細(xì)胞模型中的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。見圖7。

圖7 倒置顯微鏡下的各組細(xì)胞形態(tài)(10×20倍)

3.8 靈芝酸A對(duì)AD細(xì)胞模型中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響 根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析,靈芝酸A治療AD的核心靶點(diǎn)為AKT1。AKT1是AKT的3種亞型之一[10]。AKT被上游的PI3K激活,對(duì)KEGG分析中關(guān)鍵的AD途徑發(fā)揮重要作用[11]。故本研究選取PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步探討靈芝酸A對(duì)AD的作用機(jī)制。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組p-AKT、p-PI3K蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,靈芝酸A組p-AKT、p-PI3K蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見圖8。結(jié)果表明,靈芝酸A可明顯減少AD細(xì)胞模型PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.靈芝酸A組;與對(duì)照組比較,*P<0.05,與模型組比較,#P<0.05

4 討論

AD是由眾多因素引起的復(fù)雜的疾病,也是癡呆常見的類型之一。AD的發(fā)病人群主要集中在老年人,且隨著年齡的增加,發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)越來越大。AD患者常有不同程度的語言、記憶和行為障礙。然而,目前臨床上并無有效治療AD的方法,大多數(shù)藥物僅能緩解AD患者最明顯的癥狀。靈芝酸是靈芝三萜類次級(jí)代謝物,具有抑癌、抗炎、抗衰老[12]等多種藥理活性。近年來,靈芝酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)保護(hù)作用與機(jī)制備受關(guān)注。已有研究[13]證明,靈芝的活性提取物可以延緩AD的進(jìn)展。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析手段對(duì)靈芝酸和AD的共同靶點(diǎn)及涉及的相關(guān)通路,并結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證進(jìn)行綜合分析,為后續(xù)藥理實(shí)驗(yàn)的開展奠定基礎(chǔ)。

本研究所選取的靈芝酸化合物共7種,其治療AD的核心化合物為靈芝酸D、靈芝酸A和靈芝酸C2。據(jù)報(bào)道,靈芝酸A通過激活A(yù)xl誘導(dǎo)的自噬促進(jìn)Aβ清除[6],改善AD小鼠模型中的認(rèn)知功能障礙。靈芝酸C2可以促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的產(chǎn)生[14],從而治療神經(jīng)退行性疾病。靈芝酸D可以通過PERK/NRF2信號(hào)通路抵抗氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的衰老[15]。此外,靈芝酸DM、靈芝酸F在神經(jīng)系統(tǒng)中均具有保護(hù)作用[16-17]。然而,對(duì)靈芝酸X和靈芝酸Y的研究尚未涉及神經(jīng)疾病領(lǐng)域,這是未來研究的方向。

通過交集實(shí)驗(yàn)和PPI網(wǎng)絡(luò)分析共獲得了56個(gè)的共同靶點(diǎn),其中AKT1、ALB、MAPK3、CASP3、TNF和MAPK1等是該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在這些靶點(diǎn)中,AKT的所有亞型從胚胎期就在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元存活、神經(jīng)分化和神經(jīng)保護(hù)[18]。激活PI3K/AKT信號(hào)通路可能是增強(qiáng)神經(jīng)元存活率并阻斷AD發(fā)生的關(guān)鍵途徑[19]。此外,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促炎細(xì)胞因子也在AD病理生理中發(fā)揮重要作用[20]。而PI3K/AKT通路的刺激可以限制TNF-α的基因表達(dá)和活性[21],從而緩解神經(jīng)炎癥。此外,靶點(diǎn)Caspase-3的活化可以對(duì)AKT進(jìn)行剪切,抑制PI3K/AKT信號(hào)通路傳導(dǎo),誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而影響認(rèn)知功能[22]。綜上,靈芝酸可以通過多成分、多靶點(diǎn)形成相互作用網(wǎng)絡(luò),減輕神經(jīng)炎癥,減少神經(jīng)元凋亡,治療AD。

體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),靈芝酸A治療AD的最佳用藥濃度為50 μmol/L。倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn),靈芝酸A可以挽救AD細(xì)胞模型的形態(tài)損傷。靈芝酸A治療AD的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。研究[23]表明,異常的PI3K/AKT信號(hào)通路可以導(dǎo)致Tau蛋白的過度磷酸化,引發(fā)AD。因此,本研究通過結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果,驗(yàn)證靈芝酸A通過PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)AD的影響。結(jié)果表明,p-PI3K和p-AKT的異常增加是導(dǎo)致AD發(fā)生的重要原因。而通過靈芝酸A的治療,p-PI3K和p-AKT表達(dá)水平顯著降低。這一現(xiàn)象可能是由于PI3K/AKT信號(hào)通路的異常激活導(dǎo)致AD中神經(jīng)元發(fā)生自噬抑制所引起的[24]。

本研究通過對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,從功能、參與的生物途徑和細(xì)胞中的定位對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行了簡(jiǎn)單注釋。結(jié)果表明,靈芝酸治療AD的靶點(diǎn)分布在細(xì)胞的多種組分上,生物進(jìn)程主要包括組織或細(xì)胞在生長(zhǎng)、發(fā)育和死亡過程中的各類代謝反應(yīng),在分子功能上主要體現(xiàn)為各種活性物質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)。GO富集結(jié)果顯示,靈芝酸治療AD的靶點(diǎn)主要集中在細(xì)胞組分方面,這提示靈芝酸可能通過參與不同細(xì)胞反應(yīng)過程達(dá)到治療AD的作用。KEGG通路富集結(jié)果顯示,靈芝酸治療AD的核心通路主要涉及AD、人巨細(xì)胞病毒感染、C型凝集素受體信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡等。其中,巨細(xì)胞病毒慢性感染最近被證明是認(rèn)知能力下降和AD及相關(guān)癡呆的危險(xiǎn)因素[25]。樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-1受體與AD的神經(jīng)炎癥有關(guān)[26]。晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體RAGE增加活性氧并參與AD的發(fā)病機(jī)制[27]。這些有關(guān)感染、炎癥的因素,均可引起Aβ沉積、Tau過度磷酸化等反應(yīng),導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[28]。

綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選了靈芝酸的幾種活性成分,并分析了其與AD的共同靶點(diǎn)及調(diào)控的分子機(jī)制。通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其核心靶點(diǎn)AKT1及PI3K/AKT信號(hào)通路在AD發(fā)病機(jī)制中的作用。本研究結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)揭示了靈芝酸可能通過減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡和修復(fù)自噬障礙等多種途徑來治療AD,表現(xiàn)出多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。然而,由于數(shù)據(jù)庫信息的不全面、缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等因素,使得預(yù)測(cè)結(jié)果具有一定的局限性。但本研究仍可以為相關(guān)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步探究提供思路和方向。