骨髓增生異常綜合征患者異基因造血干細(xì)胞移植后繼發(fā)慢性肥大細(xì)胞白血病現(xiàn)象分析

丁 靜 劉偉玲 夏新新 藺麗慧

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院檢驗科，上海 201600；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院血液科，上海 201600）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一組克隆性造血干細(xì)胞疾病，異基因造血干細(xì)胞移植是目前唯一可能治愈MDS的方法[1]。系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥是克隆性、腫瘤性肥大細(xì)胞增殖性疾病，肥大細(xì)胞白血病在系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥各亞型中侵襲性最強、預(yù)后最差，患者中位生存時間僅約為2個月[2]。本研究回顧分析1例異基因造血干細(xì)胞移植后繼發(fā)肥大細(xì)胞白血病的MDS患者疾病進(jìn)程，總結(jié)相關(guān)實驗室檢驗結(jié)果與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以提高臨床對該類疾病的認(rèn)識。

1 材料和方法

1.1 研究對象

患者，女，60歲。2014年因白細(xì)胞、血紅蛋白降低確診高危型骨髓增生異常綜合征伴原始細(xì)胞增多1型（myelodysplastic syndrome with excess blasts 1，MDS-EB-1）。2014年9月行全相合異基因造血干細(xì)胞移植，移植成功。該患者移植術(shù)后6年間反復(fù)發(fā)熱；伴干咳、氣喘，并夜間加重；頭痛，盜汗，消瘦，乏力。2016年4月曾因“間斷發(fā)熱、咳嗽、咳痰”就診，骨髓檢查提示含嗜堿性顆粒的細(xì)胞增多（約占36%），外周血涂片示含嗜堿性顆粒的細(xì)胞約占10%，電子計算機斷層掃描提示肺部感染，行抗感染治療后稍好轉(zhuǎn)，但癥狀仍有反復(fù)。有過敏性鼻炎史。2020年7月，患者胸悶氣促加重、面色潮紅，血常規(guī)示兩系降低。于上海市第一人民醫(yī)院血液科住院治療。

住院期間骨髓病理檢查示：有核細(xì)胞高度增生，原始細(xì)胞高度增生、形態(tài)一致，正常造血細(xì)胞增生高度受抑，網(wǎng)狀纖維增生（MF Ⅱ級）。免疫組化：MPO（-）、CD20（-）、CD34（-）、CD2（-）、CD117（+）、BM2（+）、Ki-67（個別+）、CD42b（-）、CD7（-）、CD68（+）。正電子發(fā)射斷層顯像/X線計算機體層成像（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT）提示全身多發(fā)骨病灶伴葡萄糖代謝輕度增高，肝脾腫大，傾向血液系統(tǒng)疾病。腹部B超提示肝脾大，門靜脈高壓，腹腔積液，提示肝硬化。行甲磺酸伊馬替尼聯(lián)合小劑量醋酸潑尼松片治療。2021年7月電話隨訪獲知預(yù)后良好。

1.2 實驗室檢驗

采集患者乙二胺四乙酸抗凝血，采用深圳邁瑞公司Mindray6800流水線及配套試劑進(jìn)行血細(xì)胞計數(shù)。

收集患者骨髓細(xì)胞，制片后采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司W(wǎng)right-Giemsa染液染片，采用日本OLYMPUS公司CX33顯微鏡觀察。

抽取患者骨髓液，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。采用美國貝克曼庫爾特公司Navios流式分析儀及配套試劑進(jìn)行免疫表型分析，采用江蘇康為世紀(jì)生物科技公司柱式抽提試劑盒提取總RNA，采用多重巢式聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測RUNX1-RUNX1T1、BCR-ABL1、CBFβ-MYH11、KMT2A-MLLT6、KMT2A-MLLT11、KMT2A-MLLT3，KMT2AMLLT10等56種急性白血病相關(guān)融合基因（上海源奇生物醫(yī)藥有限公司），以循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）＜33為陽性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）合成cDNA；然后提取DNA，試劑盒購自江蘇康為世紀(jì)生物科技公司；采用美國illumina公司illumina測序平臺進(jìn)行測序，平均靶基因覆蓋率≥90%，平均測序深度≥1 000×；單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）檢測參照文獻(xiàn)[3]。

抽取患者肝素抗凝骨髓液，采用短期培養(yǎng)法對骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色體分析，培養(yǎng)基購自上海樂辰生物科技公司。

收集患者相關(guān)臨床表現(xiàn)和診療經(jīng)過等相關(guān)資料。

2 結(jié)果

2.1 實驗室檢驗結(jié)果和診斷

2.1.1 血常規(guī)

血紅蛋白73 g/L，紅細(xì)胞2.16×1012/L，白細(xì)胞2.45×109/L，中性粒細(xì)胞絕對值1.48×109/L，血小板193×109/L。

2.1.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

骨髓有核細(xì)胞增生明顯活躍。肥大細(xì)胞約占96.5%。細(xì)胞中等偏大，多數(shù)規(guī)則，約8%為梭形；核中等，圓形，居中或稍偏位，染色質(zhì)偏成熟；胞質(zhì)偏多，布滿紫黑色粗大顆粒，可蓋于核上。約21%胞體偏大，核畸形，呈啞鈴樣或雙核，染色質(zhì)偏細(xì)，可見少數(shù)細(xì)胞顆粒缺乏。細(xì)胞化學(xué)染色：過氧化物酶染色（-），特異性酯酶染色（+++），糖原染色（++），甲苯胺藍(lán)染色（+++），非特異性酯酶染色（++）且不被氟化鈉抑制。提示：肥大細(xì)胞增多癥骨髓象，肥大細(xì)胞白血病待排。形態(tài)學(xué)結(jié)果見圖1。

圖1 形態(tài)學(xué)涂片和染色結(jié)果（×1 000）

2.1.3 細(xì)胞免疫學(xué)分型結(jié)果

共分析約4.9 個萬細(xì)胞，其中異常細(xì)胞約占白細(xì)胞總數(shù)的88.35%，免疫表型為：CD45dimSSC高CD34-CD117+CD13+CD33+CD16+CD64partCD123dimCD2-CD25dimCD203c+FcεRI+，提示肥大細(xì)胞待排。見圖2。

圖2 細(xì)胞免疫學(xué)分型結(jié)果

2.1.4 基因檢測結(jié)果

檢出突變KITD816H48.57%，IDH2R140Q40.30%，DNMT3AW601X34.01%。融合基因未檢出。移植后SNP和骨髓肥大細(xì)胞比例始終呈負(fù)相關(guān)（圖3）。

圖3 SNP和骨髓肥大細(xì)胞的變化曲線

2.1.5 染色體

染色體核型分析結(jié)果示：46，XX[3]。

3 討論

系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥的確診需要符合主要標(biāo)準(zhǔn)和1個次要標(biāo)準(zhǔn)，或符合至少3個次要標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。依據(jù)文獻(xiàn)[5]，本例患者存在外周血兩系減低、肝脾腫大伴肝功能異常等“C所見”表現(xiàn)，骨髓穿刺液形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞學(xué)和基因檢測結(jié)果符合3項次要標(biāo)準(zhǔn)，同時，骨髓穿刺液涂片示肥大細(xì)胞≥20%，可診斷為系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥中的肥大細(xì)胞白血病。

肥大細(xì)胞白血病預(yù)后極差，而回顧本例患者病史，2016年4月骨髓穿刺液中即出現(xiàn)肥大細(xì)胞，占骨髓有核細(xì)胞的36%，外周血肥大細(xì)胞占10%，已符合肥大細(xì)胞白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)。直至2021年7月隨訪時狀態(tài)良好，與既往研究中的中位生存時間[2]分歧較大。

有研究發(fā)現(xiàn)，少數(shù)肥大細(xì)胞白血病患者病程較為緩慢、穩(wěn)定，有時甚至在早期沒有“C所見”[6]。此類患者疾病可能會進(jìn)展，但總體預(yù)后優(yōu)于急性肥大細(xì)胞白血病患者，尤其是當(dāng)沒有“C所見”時，其形態(tài)學(xué)也以典型肥大細(xì)胞或非典型肥大細(xì)胞Ⅰ型為主。另外，急性肥大細(xì)胞白血病通常顯示出高增殖率（Ki-67陽性肥大細(xì)胞＞50%），而慢性肥大細(xì)胞白血病則顯示出低增殖率（Ki-67陽性肥大細(xì)胞＜10%）[6]。肥大細(xì)胞在Wright-Giemsa染色中可顯示出4種形態(tài)：1）典型肥大細(xì)胞，圓形，顆粒豐富，圓形核居中；2）非典型肥大細(xì)胞Ⅰ型，具有細(xì)長的細(xì)胞表面呈紡錘形、胞質(zhì)顆粒減少、核呈橢圓形且疏松中的2或3個特征；3）非典型肥大細(xì)胞Ⅱ型/前母細(xì)胞，具有雙葉或多葉核；4）異染性原始細(xì)胞，原始細(xì)胞伴有少量異染顆粒[6]。SPERR等[7]認(rèn)為Ⅰ型非典型肥大細(xì)胞中，梭形肥大細(xì)胞相對于規(guī)則形狀肥大細(xì)胞更成熟，而高比例的Ⅱ型非典型肥大細(xì)胞與不良預(yù)后相關(guān)。本例患者的骨髓細(xì)胞形態(tài)多數(shù)為相對成熟的典型肥大細(xì)胞和Ⅰ型非典型肥大細(xì)胞，骨髓病理免疫組化Ki-67僅個別陽性，病程進(jìn)展緩慢，符合慢性肥大細(xì)胞白血病的特征。

查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，僅見2例異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后發(fā)生肥大細(xì)胞白血病的病例[8-9]，臨床病程、形態(tài)學(xué)特征、治療與預(yù)后見表1。

表1 本例患者與文獻(xiàn)報道的2例患者基本情況

與文獻(xiàn)報道的2例移植后發(fā)生肥大細(xì)胞白血病的患者對比后，我們發(fā)現(xiàn)本例患者與病例1在移植前均未發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞，均接受了異基因造血干細(xì)胞移植，移植后肥大細(xì)胞形態(tài)均較為成熟，生存時間均超過5年，預(yù)后均符合文獻(xiàn)[6]。不同于本例患者移植后繼發(fā)肥大細(xì)胞白血病混合嵌合狀態(tài)，病例1通過供者淋巴細(xì)胞輸注有效實現(xiàn)了骨髓肥大細(xì)胞的清除。病例2在化療復(fù)發(fā)后即被診斷為系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥-急性髓系白血病，移植前骨髓中原始細(xì)胞占31.2%，肥大細(xì)胞占5.8%；半相合移植后骨髓中的肥大細(xì)胞增多，以異染性原始細(xì)胞和非典型肥大細(xì)胞Ⅱ型為主，肥大細(xì)胞脫顆粒后高水平的肝素引起臨床顯著出血，顱內(nèi)出血是病例2死亡的主要原因。

值得注意的是，本例患者雖然在移植前無肥大細(xì)胞浸潤證據(jù)，但其全部病程進(jìn)展很可能涉及肥大細(xì)胞合并克隆性造血組織非肥大細(xì)胞系疾病（associated haematological neoplasm，AHN），這類血液系統(tǒng)惡性腫瘤多為髓系，如MDS、骨髓增生性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）、MDS/MPN或急性髓系白血病，5%～40%的系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥病例，AHN在其診斷的同時、之前或之后均可被發(fā)現(xiàn)。疾病初發(fā)時肥大細(xì)胞可能被造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的增殖掩蓋，而在治療引起的增生減低或造血恢復(fù)后變得明顯[10]。目前，關(guān)于肥大細(xì)胞合并AHN的發(fā)病機制有2種理論，一種是突變的骨髓干細(xì)胞由于存在c-KIT突變而分化并增殖為肥大細(xì)胞，另一種是具有獲得性C-KIT突變的骨髓祖細(xì)胞亞克隆轉(zhuǎn)化導(dǎo)致共存的肥大細(xì)胞增多癥[11]。CRAIG等[12]的研究中納入64例具有C-KIT突變的患者，其中患MDS、MPN或MDS/MPN的患者約占1/3，形態(tài)學(xué)和免疫表型特征表明有91%的患者檢出肥大細(xì)胞；隊列中有30名肥大細(xì)胞合并AHN患者，其中近1/3在疾病初期未檢出肥大細(xì)胞[12]。FRITSCHE-POLANZ等[13]發(fā)現(xiàn)，在101例急性髓系白血病患者中，有7例（6.9%）檢出KIT D816V伴肥大細(xì)胞，最終診斷為肥大細(xì)胞合并急性髓系白血病。JAWHAR等[14]認(rèn)為，肥大細(xì)胞合并AHN時，2種疾病可能互相掩蓋，他們發(fā)現(xiàn)KITD816mut/CBFnegSMAML和KITD816mut/CBFnegAML2個數(shù)據(jù)庫顯著相似，提示很大比例的急性髓系白血病患者體內(nèi)有潛在的肥大細(xì)胞，并可通過檢測血清類胰蛋白酶、規(guī)范骨髓活檢，提高肥大細(xì)胞的檢出率。

已發(fā)表的關(guān)于肥大細(xì)胞-急性髓系白血病伴t（8；21）的研究顯示了關(guān)于移植后肥大細(xì)胞來源的不同觀點，有研究認(rèn)為移植后肥大細(xì)胞可檢出t（8；21），來源于受者[15-17]，而CHEN等[18]在1例t（8；21）的MCL-AML患者移植后31 d，發(fā)現(xiàn)了供體來源肥大細(xì)胞，該患者移植前后均未發(fā)現(xiàn)C-KIT突變。本病例移植后SNP結(jié)果和骨髓肥大細(xì)胞的比例變化呈負(fù)相關(guān)，SNP檢測異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后供者細(xì)胞嵌合率降低，提示供者來源細(xì)胞減少，受者來源細(xì)胞增多，間接提示肥大細(xì)胞可能來源于受者自身，有待于基因測序加以確認(rèn)。

綜上所述，本例罕見的MDS行異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后發(fā)生慢性肥大細(xì)胞白血病的病例，揭示了較成熟的肥大細(xì)胞形態(tài)與良好預(yù)后的相關(guān)性。人類肥大細(xì)胞主要分布于機體與外界環(huán)境相通的組織器官，如皮膚、呼吸道和消化道，這些部位經(jīng)常可以接觸到病原體、變應(yīng)原，以及環(huán)境中的其他物質(zhì)。因此，當(dāng)血液腫瘤患者出現(xiàn)反復(fù)、不明原因的發(fā)熱、潮紅、骨質(zhì)疏松癥、過敏反應(yīng)、呼吸道和胃腸道疾病或慢性腹部絞痛癥狀時，應(yīng)高度懷疑肥大細(xì)胞增殖。建議具有KITD816V突變的急性髓系白血病、MDS、MPN或MDS/MPN的患者均應(yīng)通過血清類胰蛋白酶檢測、骨髓活檢篩查肥大細(xì)胞。由于持續(xù)肥大細(xì)胞增多癥會增加出血風(fēng)險和其他不良影響，因此可能需要考慮積極的干預(yù)措施，如輸注供體淋巴細(xì)胞。血液學(xué)檢驗工作者在日常工作中應(yīng)提高對罕見疾病的敏感性，加強對疾病進(jìn)展的認(rèn)識，完善疾病的診斷，為臨床工作提供幫助。