葡萄鐵還原酶FRO基因的克隆、鑒定與表達模式分析

王建萍，劉萬好，隋永超，唐美玲,2,，李進，徐維華，宋志忠,2,5

（1山東省煙臺市農業(yè)科學研究院，山東煙臺 264000；2魯東大學農林工程研究院，山東煙臺 264025；3龍口市農業(yè)技術推廣中心果樹站，山東煙臺 265700；4山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術創(chuàng)新中心/中糧長城葡萄酒（蓬萊）有限公司，山東煙臺 264000；5劍橋大學植物系，英國劍橋 CB2 3EA）

0 引言

鐵(Fe)是植物細胞中含量較為豐富的礦物元素之一，作為鐵硫蛋白和細胞色素的組成成分，參與植物呼吸作用、光合作用、激素合成、DNA修復和氨基酸與嘌呤代謝等多種生命活動過程[1-4]。果樹學中，合理的鐵肥施放促進果樹生長發(fā)育，并與果實品質和產(chǎn)量息息相關，土壤缺鐵將阻礙果樹的正常生長和發(fā)育，特別是石灰性土壤缺鐵現(xiàn)象更為明顯，造成作物嚴重減產(chǎn)或品質降低[5-8]。然而，有關果樹鐵素營養(yǎng)高效與利用的分子基礎研究較少。

土壤中的鐵多為Fe3+，植物根際對Fe3+的利用微乎其微[5,7-9]。目前，有關植物吸收、轉運和分配鐵的分子機制研究是植物營養(yǎng)領域的熱點，主要集中在擬南芥、水稻等模式植物中[5-6,9]，果樹作物中的研究鮮少。研究表明高等植物為適應缺鐵脅迫而進化出了2種根際鐵吸收策略[10]。吸收策略Ⅰ，見于雙子葉植物（如擬南芥、番茄等）和非禾本科單子葉植物（如黃瓜等），通過定位于根細胞膜表面的H-ATP酶向根際分泌H+，降低周圍土壤pH，促進Fe3+的溶解，并通過鐵還原酶FRO(ferric reduction oxidase)將根系周圍的Fe3+被還原為Fe2+，再通過Fe2+轉運蛋白IRT(ferrous iron transporter)進入根系被植物吸收利用[5-6,9-10]；吸收策略Ⅱ，見于小麥、玉米等禾本科植物，通過分泌麥根酸類物質，與根際的Fe3+形成螯合物后，由專門的鐵載體PS(phytosiderophore)的方式被根系吸收和利用[5-6,9-11]。

Robinson等[12]最早從擬南芥根中克隆獲得AtFRO2基因，將AtFRO2在鐵還原酶缺陷的突變體fro互補表達后，緩解低鐵脅迫對突變體植株生長的抑制，并檢測到互補株系根表面FRO的酶活性逐漸回到正常水平。水稻中已報道2 個在旗葉中高量表達的基因OsFRO1和OsFRO7，其表達水平均受鹽、干旱、熱、重金屬等非生物脅迫的調控，OsFRO1被RNAi干涉后，轉基因株系生長受抑制，鐵素含量、葉綠素含量和活性氧ROS(active oxygen savaging)清除能力均顯著降低[11]。玉米ZmFRO2主要在葉片表達，短期缺鐵誘導其在玉米幼苗葉片和根部的表達，在玉米中過表達后顯著增強了轉基因玉米的產(chǎn)量和各組織部位的鐵含量[13]。果樹作物中有關FRO家族基因的研究較少，已有報道表明資陽香橙含有5 個FRO 家族基因，在幼苗中的整體表達量差異較大，缺鐵脅迫顯著誘導CjFRO4在幼苗根中的表達[14]；小金海棠MxFRO4和MxFRO6均在根和新葉中高量表達，并受NaCl、缺鐵和高鐵脅迫的調控[15]。

葡萄(Vitisvinifera)是一種全球重要的水果，基因組序列已公布[16]。然而，葡萄FRO家族基因的生物學功能依然未知。筆者從‘煙釀1號’中鑒定葡萄FRO家族基因，并通過實時熒光定量PCR分析其組織特異性表達模式，及其在轉錄水平對等缺鐵、高鐵毒害、ABA、PEG、NaCl、低溫和高溫等非生物脅迫的響應特征，為研究果樹的鐵吸收與轉運機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材與采樣

本研究所用的5年生‘煙釀1號’成年葡萄果實和葉片材料由山東省煙臺市農業(yè)科學研究院葡萄資源圃提供，樹體健壯，南北行向，常規(guī)田間管理。參照張璐等[17]描述，2021 年分別于特定日期采集不同發(fā)育時期的果實（幼果期為6月30日，硬核期為7月15日，轉色期為8 月5 日，第二次膨大期為8 月20 日，成熟期為9月20日）和葉片（幼葉為6月30日，老葉為9月20日），迅速用液氮處理并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

脅迫實驗的供試材料為魯東大學園藝作物遺傳改良創(chuàng)新團隊提供的‘煙釀1 號’組培脫毒幼苗，所用培養(yǎng)基為1/2MS 固體培養(yǎng)基，組培室溫度為(25±1)℃，濕度70%，光照3000 lx，培養(yǎng)2 個月的組培苗先進行3 d 的煉苗處理，然后轉移至1/2MS 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。以1/2MS 液體培養(yǎng)基作為對照條件，根據(jù)Song 等[18]和李又歡等[19]描述，對‘煙釀1 號’組培幼苗分別設置缺鐵(0 mmol/L FeNa-EDTA)、高鐵(500 μmol/L FeNa-EDTA)、ABA(200 μmol/L)、PEG6000(10% ，w/v)、NaCl(200 mmol/L)、低溫(4℃)和高溫(45℃)脅迫，處理48 h后，采集根部材料用于轉錄水平的表達差異分析。

1.2 葡萄FRO家族基因的篩選與克隆

以8 個擬南芥FRO基因的氨基酸序列為參考[9,20]，在Phytozome葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.phytozome.net)中檢索葡萄中潛在的FRO家族蛋白(VvFRO)，并利用Pfam 在線服務器(http://pfam.xfam.org/search)驗證VvFRO 蛋白的功能結構域。根據(jù)獲得的葡萄VvFRO基因的編碼區(qū)CDS(coding sequence)序列，設計上下游引物（表1），利用高保真聚合酶Prime STARTMHS DNA試劑盒（TaKaRa，大連）進行PCR 擴增，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。

表1 CDS擴增所用上下游引物序列

1.3 葡萄FRO基因及其編碼蛋白的特征分析

在Phytozome 葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.phytozome.net)下載VvFRO家族基因的CDS 及基因組DNA 序列，借助Gene Structure Display(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)分析VvFRO的基因結構；利用ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html) 分析VvFRO蛋白的理化性質，包括理論等電點、分子量、穩(wěn)定性等，分別借助MEME v4.8.1(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)、PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)、TMpredict(http://ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)、SignalP4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/) 和 Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)在線服務器分別預測VvFRO 蛋白的保守結構域、亞細胞定位、跨膜結構域、信號肽和三級結構。借助Clustal X 2.0軟件對VvFRO蛋白與擬南芥（7 個，AtFRO1～AtFRO7）、水稻（2 個，OsFRO1 和OsFRO2）、玉米（1 個，ZmFRO2）、番茄（1 個，SlFRO1）、大豆（1 個，GmFRO2）、落花生（2 個，AhFRO1 和AhFRO2）、小金海棠（2個，MxFRO4 和MxFRO6）、蒺藜苜蓿（4個，MtFRO1和MtFRO2～MtFRO4）、資陽香橙（5個，CjFRO1～CjFRO5）等已報道植物FRO 同源蛋白進行氨基酸序列一致性分析，通過MEGA 13.0 軟件中的最大相似法(maximum likelyhood method)構建植物FRO蛋白的統(tǒng)進化樹；在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫下載VvFRO各基因起始密碼子ATG 上游2 kb 的啟動子區(qū)域，通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測VvFRO啟動子區(qū)域可能存在的cis-順式作用元件。

1.4 實時熒光定量PCR分析

分別采集‘煙釀1 號’發(fā)育不同時期的組織材料，通過MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa，大連）提取葡萄各組織的總RNA，借助PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaRa，大連）反轉錄獲得第一鏈cDNA。設計VvFRO各基因的特異性表達引物（表2），以葡萄Ubiquitin[17,21-23]作為內參基因，以熒光染料SYBR Green（TaKaRa，大連）作為標記，利用實時熒光定量PCR儀(ABI 7500，Applied Biosystems，USA)檢測VvFRO在不同組織中的表達模式及其在轉錄水平對不同非生物脅迫的響應特征。利用ABI 7500PCR 儀記錄不同反應的Ct值，經(jīng)內參基因Ubiquitin均一化處理后，采用2-ΔΔCt法計算VvFRO的相對表達量，每個樣品進行3次生物學反應，每個反應3次技術重復[17,19,21-23]。

表2 研究所用的特異性引物序列

2 結果與分析

2.1 葡萄FRO家族基因的篩選與克隆

以擬南芥鐵還原酶AtFRO 的氨基酸序列為參考[9,20]，在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到6 個潛在的葡萄FRO 家族蛋白，下載葡萄FRO各基因的CDS 電子序列，利用高保真酶擴增‘煙釀1 號’葡萄FRO各基因CDS（圖1 和表3），測序驗證后分別命名為VvFRO1-VvFRO6，其編碼蛋白均預測到FAD 結合區(qū)域(FADbinding site)、NADPH結合區(qū)域(NADPH-binding site)和氧化還原輔酶結合區(qū)(oxidoreductase signature)功能結構域（圖2），均屬于典型的鐵還原酶家族蛋白。

圖1 VvFRO家族基因CDS擴增

圖2 VvFRO家族蛋白氨基酸序列比對

表3 VvFRO基因及編碼蛋白基本信息

2.2 植物FRO同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

分別下載葡萄（葡萄科）、資陽香橙（蕓香科）、小金海棠（薔薇科）、擬南芥（十字花科）、番茄（茄科）、蒺藜苜蓿（豆科）、落花生（豆科）、大豆（豆科）、水稻（禾本科）和玉米（禾本科）等植物FRO同源蛋白的序列。氨基酸序列一致性比對結果表明，10 種不同科屬植物FRO 蛋白之間具有較高的同源性，在氨基酸水平的一致性為43.66%（數(shù)據(jù)未展示），同源關系較近的兩者之間的序列一致性均高于67.35%。此外，6個VvFRO 蛋白在氨基酸水平的一致性為51.62%（圖2），在核苷酸水平的一致性為48.65%。

系統(tǒng)發(fā)育樹結果（圖3）表明，10 種不同科屬植物FRO家族蛋白可分為Group I和II 2個亞族，其中，葡萄VvFRO1～VvFRO3 屬于Group I，而葡萄VvFRO4～VvFRO6 屬于Group II（圖3）。此外，10 種植物FRO家族蛋白在遺傳進化關系上有差異，相較于其他8 種植物，葡萄FRO傾向于和資陽香橙和小金海棠同源蛋白的遺傳進化距離更近，如VvFRO1 和VvFRO4 分別與CjFRO1 和CjFRO5 緊密聚集在一起，VvFRO6 與CjFRO3 和CjFRO4 緊密聚在一起，而VvFRO2 和VvFRO3 與MxFRO6 均緊密聚集在一起；大豆(GmFRO2)、蒺藜苜蓿(MtFRO1)和落花生(AhFRO1、AhFRO2)同屬于豆科植物，其FRO 同源蛋白傾向于緊密地聚在一起，而禾本科水稻(ZmFRO2)和玉米(OsFRO1)的同源蛋白在遺傳距離上也是最近的。

圖3 植物FRO同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 葡萄FRO家族基因及編碼蛋白特征分析

VvFRO基因主要定位于12 號(VvFRO5)、15 號(VvFRO3、VvFRO4)、16 號(VvFRO1、VvFRO2)和17 號(VvFRO6)染色體上（表3），均至少含有7個長度不一的內含子（圖4 和表3）。保守基序分析結果表明VvFRO1～VvFRO4 含有所有Motif 基序(Motif 1～7)，VvFRO5和VvFRO6僅含有5個Motif基序，缺失Motif 6和Motif 7（圖4和表3）；VvFRO1的等電點PI＞7.00，含有的堿性氨基酸較多，VvFRO4 的等電點PI≈7.00，為中性蛋白，而其他4 個成員(VvFRO2、VvFRO3、VvFRO5、VvFRO6)的等電點PI均小于7.00，含有酸性氨基酸較多；VvFRO蛋白含有10或11個跨膜區(qū)，且均不含有信號肽；VvFRO1和VvFRO4的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白，而其他4 個VvFRO 的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，為穩(wěn)定蛋白（表3）。此外，葡萄VvFRO 蛋白具有相似的蛋白質三級結構（圖5）。

圖4 葡萄FRO家族蛋白Motif和基因結構分析

圖5 葡萄FRO家族蛋白三級結構預測

2.4 VvFRO啟動子cis-順式作用元件預測

在VvFRO基因啟動子區(qū)域至少鑒定到了11 種cis-順式作用元件，包括激素響應、脅迫響應和晝夜規(guī)律等不同生物功能或代謝途徑的調控元件，且不同VvFRO啟動子中的順勢作用元件數(shù)量差異顯著（表4）。其中，2種轉錄元件（光感應和脫落酸ABA 響應）在全部6 個VvFRO的啟動子區(qū)域中均能檢測到，在5個VvFRO啟動子區(qū)域檢測到響應熱脅迫（除VvFRO3）和赤霉素（除VvFRO5）的順式作用元件，在4 個VvFRO的啟動子區(qū)域檢測到響應干旱誘導、厭氧感應和生長素的順式作用元件，在3個VvFRO的啟動子區(qū)域檢測到響應防御與脅迫、低溫感應和晝夜規(guī)律的順式作用元件，在VvFRO2的啟動子區(qū)域鑒定到2 個乙烯響應有關的作用元件（表4）。

表4 啟動子順式作用元件分析

2.5 VvFRO亞細胞定位預測

亞細胞定位預測結果表明，VvFRO 蛋白主要定位于細胞質膜，其次是內質網(wǎng)膜（VvFRO2 和VvFRO6 除外）、液泡膜（VvFRO2 和VvFRO4 除外）和線粒體（VvFRO2 和VvFRO3 除外），VvFRO2 和VvFRO3 分別在葉綠體和細胞核上也有少量分布（表5）。

表5 葡萄FRO家族蛋白的亞細胞定位預測 %

2.6 VvFRO表達模式分析

熒光定量PCR 分析結果表明，VvFRO1～VvFRO6在‘煙釀1號’成年樹體和幼苗不同組織中的表達量存在差異（圖6）。其中，VvFRO3在不同組織中的整體表達水平最高，且在成年樹體1 年生幼葉和幼苗葉片中的表達量較高，遠高于其他組織；VvFRO2的表達特征與VvFRO3類似；VvFRO5在硬核期和轉色期果實中的表達量較高，遠高于其他組織；而其他3 個基因(VvFRO1、VvFRO4、VvFRO6)在葡萄不同組織中的整體表達水平相對較低（均小于0.1且較為接近）。

圖6 VvFRO組織特異性表達分析

2.7 VvFRO對非生物脅迫的相應差異

熒光定量PCR分析結果（圖7）表明，在轉錄水平，VvFRO1～VvFRO6在‘煙釀1 號’幼苗根部對7 種不同非生物脅迫的響應情況存在差異。葡萄FRO家族基因對缺鐵和NaCl脅迫最為敏感，除VvFRO6外，其他5個FRO基因在根部的表達量均受缺鐵和NaCl 處理的誘導而顯著增加；3 個基因(VvFRO1、VvFRO3、VvFRO5)在根部對PEG 處理較為敏感，其表達量顯著增加；僅有VvFRO3對ABA處理有響應，其在根部的表達量顯著被誘導而上調，此外，也僅有VvFRO3對鐵毒害有響應，其在根部的表達量顯著被抑制而降低；然而，葡萄FRO家族基因對溫度變化不敏感，其表達量在低溫(4℃)和熱(45℃)脅迫條件下均沒有顯著變化。特別地，3 個(VvFRO1、VvFRO3、VvFRO5)基因在根部的表達易受外界非生物脅迫的調控，在轉錄水平至少對3 種處理有響應，其中，VvFRO3在葡萄中的整體表達量最高，且對5 種脅迫處理（除了低溫和熱脅迫之外）均有響應；雖然VvFRO6的整體表達量相對較低，但其表達最為穩(wěn)定，且在轉錄水平對本研究設置的7種脅迫條件均沒有任何響應。

圖7 VvFRO對非生物脅迫的響應情況

3 討論

鐵在果實品質形成方面發(fā)揮重要作用，并與果實產(chǎn)量密切相關，然而，果樹中鐵吸收與轉運相關基因的生物學功能依然未知。葡萄屬于雙子葉植物，其根際對鐵的吸收屬于策略I[5-6,9,24-25]，有關葡萄鐵吸收與轉運的分子機制尚未見報道。本研究從葡萄中克隆并鑒定了6 個鐵還原酶FRO 編碼基因（圖2），數(shù)量略低于擬南芥（8 個）同源基因的數(shù)量[9,20]，暗示同一家族的基因數(shù)目在不同的科屬植物之間存在差異。此外，不同的科屬植物FRO同源蛋白在遺傳進化關系上存在差異，相較于其他禾本科、豆科、茄科和十字花科植物，VvFRO 傾向于和資陽香橙和小金海棠等多年生木本果樹同源蛋白的遺傳進化距離更近（圖3），暗示木本果樹鐵還原酶可能具有相似或相近的生物學功能。在6個VvFRO 蛋白中，VvFRO1～VvFRO3 同屬于Group I，且擁有相似的Motif基序和高級蛋白結構，暗示同一亞族且進化關系上相近的鐵還原酶FRO 之間可能具有相似的生物學功能，仍需進一步的實驗證實。此外，同屬于Group II 的VvFRO5 和VvFRO6 具有一致的Motif基序，且比Group I成員少了2個特征Motif基序（圖4），暗示其生物學功能可能與Group I成員存在差異，這些結果表明同一家族的鐵還原酶FRO 不同成員之間雖然遺傳關系相近，但在長期進化關系中可能發(fā)生了功能差異的演變。

研究表明水稻OsFRO1主要定位于細胞質膜上[11]，本研究中亞細胞定位預測表明VvFRO 蛋白主要分布在細胞質膜上（表5），與水稻中的報道相一致。已有研究表明，水稻OsFRO1和OsFRO7[11]、玉米ZmFRO2[13]、小金海棠MxFRO4和MxFRO6[15]、資陽香橙CjFRO1[14]均在葉片中高量表達，與之相一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)VvFRO2和VvFRO3成年樹體1 年生幼葉和幼苗葉片中高量表達，其表達水平是其他檢測組織中的2～4 倍（圖6），再次印證植物FRO 家族基因在植物葉片中鐵素的吸收與轉運過程中發(fā)揮重要作用。此外，有關FRO基因在果實中的表達特征情況未見報道，本研究發(fā)現(xiàn)VvFRO5在硬核期和轉色期果實中高量表達（遠高于其他檢測的組織），暗示該基因可能在硬核形成至轉色的這一關鍵發(fā)育時期參與果實中的鐵素動態(tài)平衡。

前人研究表明，OsFRO1和OsFRO7在轉錄水平的表達受鹽、干旱、熱、重金屬等非生物脅迫的調控[11]，小金海棠MxFRO4和MxFRO6受NaCl脅迫的調控[15]。本研究在VvFRO啟動子區(qū)域鑒定到多種順式作用元件，且均含有ABA 響應和光感應的順式作用元件（表4），表明這2 種作用元件傾向于與VvFRO啟動子區(qū)域的關鍵位點相結合，進而調控VvFRO的轉錄或表達。特別地，水稻OsFRO7在轉錄水平易受ABA處理的誘導，可能參與水稻響應和調節(jié)滲透作用，而OsFRO1在轉錄水平對ABA沒有響應[11]，本研究中VvFRO啟動子區(qū)域均含有ABA 響應的作用元件，然而，本研究中僅有VvRFO3在根部受ABA 處理誘導而顯著增高，暗示該基因可能參與或響應滲透調節(jié)，為進一步研究葡萄鐵還原酶FRO 的生物學功能及其調控機理提供理論參考。此外，VvFRO2-5的啟動子區(qū)域均鑒定到響應干旱誘導的順式作用元件，VvFRO1、VvFRO3和VvFRO5在根部受PEG 處理的誘導而顯著上升（圖7），初步暗示了這3個基因傾向于參與葡萄對干旱脅迫的響應機制，仍需后續(xù)的實驗證實。

此外，本研究表明VvFRO在轉錄水平受不同鐵素供應水平的調控，特別是對缺鐵處理較為敏感，除VvFRO6外，其他5個基因在根部均受缺鐵誘導而增強（圖7），推測葡萄FRO 家族基因在缺鐵脅迫條件下更傾向于被誘導表達，以便最大限度地發(fā)揮鐵還原酶的活性，進而維持葡萄根部鐵吸收和轉運功能以保障基本的依賴于鐵的生命活動，F(xiàn)RO 家族因表達水平的增高可能是葡萄響應環(huán)境缺鐵的信號之一。特別地，VvFRO3在‘煙釀1 號’不同組織中的整體表達水平最高，其在根中的表達量約為其他5個VvFRO基因的3～7倍，且在根部受高鐵毒害處理的抑制而顯著降低（約3倍），受缺鐵脅迫的誘導而顯著增加（約1.7倍），暗示該基因可能是葡萄樹體中具有較強活性的鐵還原酶蛋白，其活性直接受外界鐵素供應水平的調控，這些結果與擬南芥[20]、玉米[13]、資陽香橙[14]和小金海棠[15]中有關FRO基因響應鐵素供應水平的報道一致。雖然VvFRO6在‘煙釀1 號’不同組織中的整體表達水平較低，但其在根部不受本研究設定的7 種脅迫處理的影響，暗示VvFRO6可能在葡萄樹體中持續(xù)、穩(wěn)定地發(fā)揮鐵還原酶的活性，進而有效地參與葡萄對鐵的吸收和轉運過程。此外，葡萄屬于溫帶果樹作物，在熱帶地區(qū)或寒冷地區(qū)的生長適應性相對很差，本研究發(fā)現(xiàn)VvFRO在根部的表達水平均不受低溫(4℃)或熱處理(45℃)的影響，暗示葡萄VvFRO的表達不易受外界溫度變化的影響，在不利溫度環(huán)境條件下依然可以穩(wěn)定發(fā)揮活性，進而保障葡萄樹體一些必需鐵的代謝途徑或生命活動，以適應或耐受不利溫度脅迫對葡萄生長的影響。