黑果小檗果花色苷提取物對(duì)小鼠肝纖維化的改善作用及其機(jī)制

孫吉祥，李倩，劉菁，姚俊英，范旻

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)研究所，烏魯木齊 830001

肝纖維化是各類有害因子對(duì)肝臟造成損害后表現(xiàn)出的一種病理狀態(tài)。肝纖維化具有向肝硬化轉(zhuǎn)變的病理基礎(chǔ)，進(jìn)一步發(fā)展將導(dǎo)致肝臟功能衰竭，最終危及生命［1］。目前研究已經(jīng)明確，導(dǎo)致肝纖維化的重要原因是肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成與降解紊亂，而肝臟內(nèi)固有的肝星狀細(xì)胞（HSC）是最重要的ECM 來(lái)源［2］。肝纖維化是一種動(dòng)態(tài)的雙向進(jìn)程，具有恢復(fù)和重塑的內(nèi)在能力，對(duì)肝纖維化進(jìn)行早期積極干預(yù)，是有望實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)其疾病進(jìn)程的。近幾年對(duì)肝纖維化的研究主要集中在促進(jìn)HSC 凋亡以及抑制HSC 激活等方面［3-4］?；ㄉ帐且活惗嗔u基的類黃酮化合物，具有黃酮類化合物C6-C3-C6的特征骨架結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)芳香環(huán)和一個(gè)含氧雜環(huán)組成［5］。近年來(lái)，花色苷的抗氧化能力、抑制炎癥反應(yīng)和抑制相關(guān)酶與蛋白表達(dá)的作用得到了肯定［6］。水飛薊賓是臨床常用的保肝藥物，被證實(shí)具有穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、維持肝細(xì)胞完整性作用，可以使毒素?zé)o法穿透破壞肝臟，并能加速合成肝臟細(xì)胞的去氧核糖核酸（DNA），可預(yù)防肝硬化、脂肪肝、膽管炎等疾?。?］。2021年9月—2022 年9 月，本研究采取腹腔注射CCl4的方法建立肝纖維化小鼠模型，以水飛薊賓為陽(yáng)性對(duì)照藥物，觀察黑果小檗果花色苷提取物（BHSTA）對(duì)小鼠的肝臟保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性昆明種小鼠40 只，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（新）2016-0003；實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于石河子大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物房，在自然晝夜節(jié)律光照下，自由進(jìn)食進(jìn)水，環(huán)境溫度18～26 ℃，相對(duì)濕度65%～80%，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。主要試劑：CCl4購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司，陽(yáng)性對(duì)照藥物水飛薊賓購(gòu)自天津天士力圣特制藥公司，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）及其下游靶基因凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）、半胱天冬酶1（Caspase-1）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）相關(guān)抗體均購(gòu)自美國(guó)ABCam公司。

1.2 BHSTA 的提取、純化及溶液配置 成熟的黑果小檗果實(shí)購(gòu)自新疆烏魯木齊市水西溝鎮(zhèn)南山山區(qū)，用藥材粉碎機(jī)將果皮粉碎、過(guò)20 目篩，-20 ℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆?。?duì)鮮果的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行測(cè)定，再分別測(cè)定70%甲醇、乙醇、丙酮溶劑提取物的總酚、總花色苷含量，并檢測(cè)其DPPH 自由基、羥自由基、ABTS 自由基、超氧陰離子自由基等抗氧化活性相關(guān)指標(biāo)。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化BHSTA 的超聲輔助提取工藝，確定相應(yīng)的優(yōu)化工藝參數(shù)。采用XDA-7A 大孔樹(shù)脂對(duì)BHSTA 粗提物進(jìn)行純化，進(jìn)一步得到BHSTA 純化物凍干粉。分別稱取BHSTA 1.0、4.0 g，加入到100 mL水中，攪拌均勻，得到質(zhì)量濃度分別為10、40 mg/mL的BHSTA溶液。

1.3 動(dòng)物分組與BHSTA處理 40只雄性昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組，每組8只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠腹腔注射CCl4油劑（CCl4∶ 橄欖油=1∶ 4）3 μL/g，2 次/周，連續(xù)4周，建立肝纖維化模型；正常對(duì)照組腹腔注射等體積橄欖油。BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組腹腔注射CCl4油劑開(kāi)始建模后，分別灌胃給予10、40 mg/kg 的BHSTA 溶液和1 μg/10 g的水飛薊賓，1次/天，連續(xù)4周；正常對(duì)照組、模型對(duì)照組均灌胃給予等體積蒸餾水。

1.4 體質(zhì)量觀察 記錄各組小鼠分組處理0 ～ 4周的體質(zhì)量。

1.5 肝臟指數(shù)分析及肝臟組織病理觀察 各組末次給藥后禁食12 h，稱取體質(zhì)量后摘眼球取血，處死并進(jìn)行解剖；剝離完整肝臟，生理鹽水清洗，濾紙蘸干表面水分，肉眼觀察肝臟大體形態(tài)。稱取并記錄肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/末次體質(zhì)量×100%。取各組小鼠新鮮肝臟左葉組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片。HE染色后觀察肝臟組織病理情況，包括肝細(xì)胞變性、壞死、細(xì)胞排列、小葉結(jié)構(gòu)、有無(wú)假小葉、纖維組織增生等；Masson染色后觀察肝臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維增生情況。剩余肝臟組織保存于液氮中。

1.6 肝臟功能檢測(cè) 取各組小鼠眼球血，離心后分離血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝臟功能相關(guān)指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。

1.7 肝臟組織SOD、GSH、MDA 表達(dá)檢測(cè) 取各組小鼠部分新鮮肝臟組織，進(jìn)行組織勻漿，采用改良鹽酸羥胺法檢測(cè)SOD、GSH、MDA表達(dá)。

1.8 肝臟組織NLRP3 及其下游靶基因蛋白檢測(cè)采用Western blotting 法。取各組保存于液氮中的肝臟組織，冰上剪取質(zhì)量為100 mg 的肝臟組織，采用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙擦干后放入干凈的燒杯內(nèi)。用干凈消毒的手術(shù)剪刀反復(fù)剪切，稱取質(zhì)量后加入9 倍的裂解液RIPA 進(jìn)行裂解，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑。進(jìn)行蛋白抽提前再加入0.1%苯甲基磺酰氟，進(jìn)行組織勻漿，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min。取上清液，加入NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 及內(nèi)參GAPDH 一抗及二抗。使用Chemi-Scopemini 化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)、拍照，凝膠掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，Image J 軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用S-W 正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊的兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊的兩組間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量比較 模型對(duì)照組、BHSTA高劑量組各死亡1 只。隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組小鼠體質(zhì)量均呈升高趨勢(shì)。分組處理第4 周，正常對(duì)照組、水飛薊賓組、BHSTA 高劑量組、BHSTA 低劑量組、模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量依次降低，組間兩兩比較P均＜0.05。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較（）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較（）

注：與正常對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.05；與水飛薊賓組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05；與BHSTA 高劑量組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.05；與BHSTA低劑量組同時(shí)間點(diǎn)比較，▲P＜0.05。

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2.2 各組小鼠肝臟指數(shù)比較 正常對(duì)照組、水飛薊賓組、BHSTA 高劑量組、BHSTA 低劑量組、模型對(duì)照組小鼠肝臟指數(shù)分別為4.84% ± 0.67%、5.29% ±1.01%、5.56% ± 0.91%、5.90% ± 0.95%、6.40% ±0.95%；與正常對(duì)照組比較，其余各組肝臟指數(shù)均升高，以模型對(duì)照組升高最明顯（P均＜0.05）， 水飛薊賓組、BHSTA 高劑量組、BHSTA 低劑量組、模型對(duì)照組小鼠肝臟指數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.3 各組小鼠肝臟大體形態(tài)比較 正常對(duì)照組小鼠肝臟呈粉紅色，表面光滑，色澤光鮮，質(zhì)地柔軟，容易夾碎。模型對(duì)照組小鼠肝臟暗紅，肝臟表面呈細(xì)顆粒狀，邊緣變鈍。水飛薊賓組小鼠肝臟被膜、質(zhì)地、顏色接近對(duì)照組，與模型對(duì)照組差異較為明顯。BHSTA 低劑量組小鼠肝臟顏色和質(zhì)地較模型對(duì)照組有所改善，部分仍有淤血現(xiàn)象。BHSTA 高劑量組小鼠肝臟質(zhì)地進(jìn)一步改善，基本沒(méi)有淤血現(xiàn)象，與模型對(duì)照組差異較為明顯。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.4 各組肝臟組織病理觀察結(jié)果比較

2.4.1 HE染色結(jié)果 正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)比較完整，肝細(xì)胞正常，基本無(wú)變性壞死，無(wú)脂肪浸潤(rùn)，匯管區(qū)未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組大多數(shù)肝竇消失，肝細(xì)胞可見(jiàn)中度或者重度水腫改變，多發(fā)氣球樣及脂肪樣變性，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組肝細(xì)胞氣球樣變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較模型對(duì)照組有所減輕。見(jiàn)OSID碼圖2。

2.4.2 Masson染色結(jié)果 正常對(duì)照組匯管區(qū)未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維增生情況，僅在中央靜脈等血管周圍發(fā)現(xiàn)少量膠原纖維。模型對(duì)照組可見(jiàn)大量的膠原纖維增生，主要分布在匯管區(qū)和血管周圍，沿匯管區(qū)或炎癥壞死區(qū)可見(jiàn)膠原纖維向外延伸。BHSTA低劑量組、BHSTA高劑量組、水飛薊賓組膠原纖維增生減輕，主要分布在血管區(qū)。見(jiàn)OSID 碼圖3。

2.5 各組小鼠血清AST、ALT 水平及肝臟組織SOD、GSH、MDA 表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清AST、ALT 水平及肝臟組織MDA 表達(dá)均升高，肝臟組織SOD、GSH 表達(dá)均降低（P均＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，BHSTA低劑量組、BHSTA高劑量組、水飛薊賓組血清AST、ALT 水平及肝臟組織MDA 表達(dá)均降低，肝臟組織SOD、GSH 表達(dá)均升高；其中，BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組血清AST、ALT 及肝臟組織MDA 表達(dá)降低更明顯，水飛薊賓組肝臟組織SOD、GSH 表達(dá)升高更明顯（P均＜0.05）。見(jiàn)表2及OSID碼圖4。

表2 各組小鼠血清AST、ALT水平及肝臟組織SOD、GSH、MDA表達(dá)比較（）

表2 各組小鼠血清AST、ALT水平及肝臟組織SOD、GSH、MDA表達(dá)比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與水飛薊賓組比較，#P＜0.05；與BHSTA高劑量組比較，△P＜0.05；與BHSTA低劑量組比較，▲P＜0.05。

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2.6 各組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、Caspase-1 及IL-1β 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與正常對(duì)照組比較，BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組及模型對(duì)照組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，以模型對(duì)照組升高最明顯（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表3 各組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與水飛薊賓組比較，#P＜0.05；與BHSTA高劑量組比較，△P＜0.05；與BHSTA低劑量組比較，▲P＜0.05。

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3 討論

花色苷在保護(hù)肝臟方面顯示出較好的生物學(xué)活性，目前其在抗肝纖維化、抗化學(xué)性肝損傷、抗酒精性肝損傷、抗肝癌、防治非酒精性脂肪肝等研究中的作用已較為明確［8-13］。研究顯示，花色苷的肝臟保護(hù)作用與其抗氧化能力、抑制炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān)［14］。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量降低，肝臟指數(shù)及血清AST、ALT升高；病理結(jié)果顯示大多數(shù)肝竇消失，肝細(xì)胞可見(jiàn)中度或者重度水腫改變，多發(fā)氣球樣及脂肪樣變性，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)有大量膠原纖維增生；提示成功采用腹腔注射CCl4的方法建立小鼠肝纖維化模型。

水飛薊賓的主要成分是從水飛薊種子中提取的一種化合物，可通過(guò)穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、清除氧自由基發(fā)揮保肝作用，主要用于治療急慢性肝炎、脂肪肝等導(dǎo)致的肝臟功能異常，是一種輔助治療肝病的藥物。因此，本研究選用水飛薊賓作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。本研究結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組體質(zhì)量均升高而血清AST、ALT 水平均降低，肝細(xì)胞氣球樣變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維增生均有所減輕，且BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組血清AST、ALT 降低更明顯。這提示BHSTA 可以有效阻斷小鼠肝臟組織纖維化進(jìn)展，緩解炎癥反應(yīng)對(duì)肝細(xì)胞的損傷，達(dá)到減輕CCl4引起肝損傷的目的，具有一定的肝臟保護(hù)作用，且高劑量應(yīng)用效果更明顯，這與以往關(guān)于花色苷抗肝纖維化的研究結(jié)果一致［15-16］。

CCl4腹腔注射后經(jīng)門(mén)靜脈入肝，轉(zhuǎn)化為三氯甲基自由基（CCl3·）等大量自由基，可以活化HSC，釋放大量炎癥細(xì)胞因子及ROS。ROS是一類氧衍生的分子，包括超氧化物、羥自由基、烷氧基、過(guò)氧化氫、臭氧等，其產(chǎn)生是機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生與清除失衡所導(dǎo)致的。ROS不僅可以通過(guò)刺激免疫細(xì)胞釋放促纖維化因子，還可直接刺激HSC 的增殖與活化［17］。研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化患者體內(nèi)均存在大量自由基，機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)紊亂，表現(xiàn)為SOD、NOQ1、GSH 等表達(dá)異常。本研究選擇了GSH、SOD、MDA這三個(gè)抗氧化指標(biāo)，評(píng)價(jià)BHSTA 對(duì)CCl4致小鼠肝損傷的影響；結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組肝臟組織MDA表達(dá)均降低，SOD、GSH表達(dá)均升高，其中BHSTA高劑量組、水飛薊賓組肝臟組織MDA 表達(dá)降低更明顯，水飛薊賓組肝臟組織SOD、GSH 表達(dá)升高更明顯；這提示BHSTA 有助于減輕肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高其抗氧化作用及氧自由基的清除能力，從而使肝臟細(xì)胞免受自由基攻擊，發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。王治博等［18］研究發(fā)現(xiàn)，花色苷對(duì)提高CCl4所致急性肝損傷大鼠血清或肝臟組織抗氧化指標(biāo)有積極作用。此外，花色苷可以使糖尿病大鼠血液中過(guò)氧化氫酶、SOD、GSH 水平升高［19］。李衛(wèi)霞等［20］研究顯示，低劑量的花色苷提取物可以提高肝損傷小鼠肝臟組織中的SOD 和GSH 表達(dá)。但是不同來(lái)源的花色苷提取物是否均具有這種抗氧化性能，仍需進(jìn)一步探討。

NLRP3 炎癥小體在肝臟多種細(xì)胞中都有表達(dá)，在庫(kù)普弗細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)最多，其次是門(mén)脈周圍的肌成纖維細(xì)胞和HSC，這也充分說(shuō)明在炎癥加重肝損傷和肝纖維化的同時(shí)，在細(xì)胞水平不僅僅有巨噬細(xì)胞NLRP3 炎癥小體的活化，肝細(xì)胞及HSC 中的NLRP3 炎癥小體活化也參與了這一過(guò)程。不受限制的NLRP3 炎癥小體激活會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞生存時(shí)間縮短，嚴(yán)重肝病患者的病理特征是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和HSC 激活，并在肝臟中形成膠原纖維沉積。研究顯示，IL-1β 或IL-18 受體Ⅰ型敲除的小鼠肝纖維化模型的肝纖維化程度得到明顯改善，而IL-1β 拮抗劑基因敲除小鼠表現(xiàn)出肝纖維化的快速進(jìn)展，同時(shí)肝臟組織IL-1β、TGF-β1表達(dá)升高［21］。崔東娟等［22］研究發(fā)現(xiàn)，香葉木素通過(guò)抑制NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 表達(dá)來(lái)緩解肝纖維化。王文杰等［23］研究發(fā)現(xiàn)，?；撬峥梢酝ㄟ^(guò)抗氧化及抑制NLRP3炎癥小體生成來(lái)抑制酒精性肝?。ˋLD）的肝臟損傷，為ALD 的預(yù)防及治療提供一定的借鑒及依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，其余四組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、Caspase-1 及IL-1β 蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，以模型對(duì)照組升高最明顯；這提示肝纖維化小鼠存在NLRP3炎癥小體活化，而B(niǎo)HSTA可以抑制NLRP3 炎癥小體活化，這可能是其減輕肝纖維化的重要機(jī)制之一。此外，ROS 作為細(xì)胞的第二信使，參與了對(duì)NLRP3 炎癥小體活化過(guò)程的調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是NLRP3 炎癥小體活化的關(guān)鍵上游效應(yīng)因子［24］。研究顯示，ROS能夠活化HSC-T6細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體及其下游效應(yīng)分子，初步證實(shí)HSC-T6細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體活化對(duì)肝纖維化進(jìn)展具有促進(jìn)作用［25］。因此，清除過(guò)多的ROS 也是防治肝纖維化的重要環(huán)節(jié)。

綜上所述，BHSTA 對(duì)小鼠肝纖維化具有一定的改善作用，其機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)及抑制NLRP3 炎癥小體相關(guān)通路有關(guān)。但是，花色苷屬于離子型化合物，親水性強(qiáng)、脂溶性差，其應(yīng)用方式僅僅停留在泡飲使用上，生物利用度較差，且相關(guān)藥物研發(fā)或者功能性食品的開(kāi)發(fā)未有顯著進(jìn)展，這是未來(lái)研究的重點(diǎn)。