霍山石斛多糖對(duì)帕金森病小鼠運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)元受損及星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老的改善作用

張培，董健健，徐陳陳，汪世靖，程楠

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所，合肥 230038；2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

帕金森?。≒D）以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡、紋狀體多巴胺含量減少和神經(jīng)元內(nèi)異常蛋白聚集為主要病理特征，是繼阿爾茨海默病（AD）之后第二常見的神經(jīng)退行性疾?。?］。PD 發(fā)病機(jī)制眾多，目前已有研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙會(huì)導(dǎo)致PD的神經(jīng)變性［2］。細(xì)胞衰老在PD 發(fā)生中具有重要作用，衰老細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長停滯的現(xiàn)象，且會(huì)分泌衰老相關(guān)分泌表型（SASP）分子，從而影響周圍細(xì)胞［3］。研究顯示，延緩星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老可以改善AD小鼠的認(rèn)知功能，清除衰老細(xì)胞能夠減輕PD小鼠的神經(jīng)變性［4-5］。因此，靶向衰老的星形膠質(zhì)細(xì)胞可能是治療PD 的一種策略?；羯绞嗵牵―HP）是從霍山石斛中提純的具有高度生物活性的一種物質(zhì)，是石斛發(fā)揮功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。DHP 具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、抗氧化以及抗衰老等廣泛的藥理作用［6-9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DHP 可以改善PD小鼠的神經(jīng)損傷，但關(guān)于其機(jī)制還需要進(jìn)一步了解［10］。2022 年12 月—2023 年7 月，本研究采用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來探討DHP 對(duì)PD 小鼠運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)元受損及星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老的抑制作用，為研究PD的發(fā)病機(jī)制及治療策略提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人神經(jīng)母瘤SH-SY5Y 細(xì)胞購自合肥苗茁生物科技有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青—鏈霉素的MEM/F12 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次；小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞C8-D1A 購自凱基生物科技有限公司，培養(yǎng)于含10% FBS、1%青—鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠40 只，8 周齡，體質(zhì)量23～25 g，購自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)2023061906；飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12 h光/暗循環(huán)，溫度20～22 ℃，濕度50%～60%，本研究通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核（AHUCMmouse-2020025）。主要試劑：DHP（純度60%）購自上海源葉生物科技有限公司，細(xì)胞噻唑藍(lán)（MTT）購自賽國生物科技有限責(zé)任公司，1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）均購自美國Sigma 公司，β-微管蛋白（β-tubulin）兔單克隆抗體購自成都正能生物技術(shù)有限公司，酪氨酸羥化酶（TH）、衰老標(biāo)志物核纖層蛋白B1（Lamin B1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）抗體均購自英國Abcam 公司，細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（β-gal）染色試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；周期蛋白依賴性激酶抑制劑p16INK4a、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.1 PD 小鼠模型構(gòu)建及分組給藥 將DHP 用ddH2O稀釋，60 ℃水浴加熱至完全溶解，分別配置成濃度為5、17.5 kg/L 的溶液。40 只雄性C57BL/6 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為NC 組、MOD 組、DHP100 組、DHP350 組，每組10 只。MOD 組、DHP100 組、DHP350 組腹腔注射30 mg/kg 的MPTP 0.2 mL，1 次/天，連續(xù)5 d，建立PD 小鼠模型［11］；NC組腹腔注射等體積生理鹽水，1 次/天，連續(xù)5 d。DHP100 組、DHP350 組建模后分別灌胃給予100、350 mg/kg的DHP各0.5 mL，1次/天，連續(xù)2周［10］。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)能力觀察

1.2.2.2 懸掛實(shí)驗(yàn) 將一根直徑為1.5 mm的金屬棒水平放置在距底部30 cm 的開口箱上方。將小鼠前爪懸掛在金屬棒上，記錄小鼠懸掛至著陸前的時(shí)間，即為懸掛時(shí)間。實(shí)驗(yàn)每隔1 min 進(jìn)行1 次，共3 次，取平均值。

1.2.2.3 平衡木實(shí)驗(yàn) 取一根長1 m、寬度14 mm的方形平衡木。平衡木一端是60瓦的燈泡，用于將光線照射到起點(diǎn)上方，作為令小鼠反感的刺激源，另一端是黑色暗盒。正式測試前兩天，每天訓(xùn)練小鼠通過平衡木進(jìn)入黑色暗盒，3 次/天，每次間隔2 h。第三天為正式測試，記錄小鼠在60 s 內(nèi)通過平衡木進(jìn)入黑色暗盒內(nèi)的時(shí)間，即為通過時(shí)間。若未能到達(dá)暗盒，則記為60 s。

1.2.3 小鼠中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）和星形膠質(zhì)細(xì)胞Lamin B1 檢測 采用免疫熒光法。四組小鼠麻醉取腦，石蠟切片、烘烤、脫蠟后，0.3% Triton X-100 打孔5 min。5%正常驢血清封閉1 h，加入特異性一抗孵育過夜，熒光二抗室溫孵育2 h，共定位的兩種二抗按比例混合，含DAPI 的封片劑封片，閉光保存，鏡檢拍照。DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外光激發(fā)下為藍(lán)色，TH和星形膠質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅色，Lamin B1 為綠色。高倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，計(jì)數(shù)中腦黑質(zhì)TH染色陽性細(xì)胞數(shù)，分析星形膠質(zhì)細(xì)胞中Lamin B1的熒光表達(dá)量。

1.2.4 小鼠中腦Lamin B1、IL-1β、IL-6蛋白檢測采用Western blotting 法。取四組小鼠中腦組織，經(jīng)裂解、離心后，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱8 min，-80 ℃冰箱保存。十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC 膜上。4 ℃條件下，用含5%脫脂奶粉的PBST 封閉液搖床孵育過夜；PBST 緩沖液洗滌，加入一抗常溫?fù)u床孵育4 h，PBST 緩沖液洗滌，將NC 膜與二抗常溫?fù)u床孵育1.5 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光，Image J 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白Tubulin 灰度值的比值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 小鼠中腦p16INK4a、MMP-3 mRNA 檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。取四組小鼠中腦組織，加入TRIzol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用引物和探針進(jìn)行PCR 反應(yīng)。p16INK4a引物序列：上游引物5′-GGACATCAAGACATCGTGCG-3′，下游引物5′-TTGAGCTGAAGCTATGCCCG-3′；MMP-3引物序列：上游引物5′-GGCCTGGAACAGTCTTGGC-3′，下游引物5′-TGTCCATCGTTCATCATCGTCA-3′；內(nèi)參GAPDH 引物序列：上游引物5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′，下游引物5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 體外實(shí)驗(yàn)

1.3.1 MPP+半數(shù)有效濃度確定 采用MTT 法。將C8-D1A 細(xì)胞以3 × 103/孔接種于96 孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至60%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmo1/L 的MPP+。MPP+作用24 h 后，避光條件下每孔加入MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。避光條件下每孔加入DMSO 溶液150 μL，酶標(biāo)儀測定450 nm 處各孔吸光度。細(xì)胞存活率 = （給藥孔吸光度 - 空白孔吸光度）/（對(duì)照孔吸光度 - 空白孔吸光度） × 100%。結(jié)果顯示，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmo1/L MPP+的C8-D1A 細(xì)胞存活率分別為100.00% ± 7.22%、63.47% ± 3.70%、54.57% ± 4.52%、49.66% ± 5.39%、48.28% ±6.40%、42.13% ± 7.65%。確定MPP+的半數(shù)有效濃度為0.6 mmo1/L，以該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 DHP 最佳作用濃度確定 采用MTT 法。將C8-D1A 細(xì)胞以3×103/孔接種于96 孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至60%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基。加入0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL 的DHP 100 μL，作用12 h 后，加入0.6 mmo1/L MPP+作用24 h。以未經(jīng)處理的C8-D1A細(xì)胞作為正常對(duì)照，參照“1.3.1”進(jìn)行MTT 檢測。結(jié)果顯示，正常對(duì)照細(xì)胞及加入0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL DHP + 0.6 mmo1/L MPP+的C8-D1A細(xì)胞存活率分別為100% ± 5.10%、53.71% ±6.44%、68.22% ± 8.24%、78.51% ± 5.76%、72.14% ± 3.67%、86.23% ± 6.99%、82.29% ±5.47%、76.32% ± 4.99%、71.80% ± 6.79%、62.71% ± 7.40%，C8-D1A 細(xì)胞經(jīng)0.6 mmo1/L MPP+作用后的細(xì)胞存活率降低，加入不同濃度DHP 預(yù)處理的細(xì)胞存活率升高，以8 μg/mL DHP 作用最明顯（P均＜0.05）。確定DHP的最佳作用濃度為8 μg/mL，以該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

大港油田提出了技術(shù)經(jīng)濟(jì)一體化，開放合作，有效建產(chǎn)的思路。油田創(chuàng)新開發(fā)模式，從開發(fā)方案設(shè)計(jì)入手，最大限度開展地質(zhì)設(shè)計(jì)及過程優(yōu)化來探討未動(dòng)用儲(chǔ)量的效益開發(fā)；創(chuàng)新提出全生命周期模式，在沈家鋪、舍女寺等20個(gè)區(qū)塊動(dòng)用地質(zhì)儲(chǔ)量1609萬噸，鉆新井109口，總進(jìn)尺32.11萬噸，建產(chǎn)能22.5萬噸，形成日產(chǎn)520噸規(guī)模，累積產(chǎn)油24.8萬噸，提高低滲油藏的開發(fā)效果；推進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)作業(yè)管理模式，6個(gè)風(fēng)險(xiǎn)合作區(qū)塊最高日產(chǎn)達(dá)200噸以上，最高年產(chǎn)3萬噸，累計(jì)產(chǎn)出原油10.5萬噸，推動(dòng)了低滲難采區(qū)塊的有效動(dòng)用。

1.3.3 細(xì)胞分組處理 DHP用DMEM培養(yǎng)基稀釋，超聲波輔助溶解，參數(shù)設(shè)置為溫度37 ℃、時(shí)間120 min、超聲頻率90 kHz，離心速率3 000 r/min，微孔濾膜針式過濾器過濾，配制12 μg/mL 母液，現(xiàn)用現(xiàn)配。將C8-D1A 細(xì)胞分為三組，正常組用不含血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，模型組用0.6 mmol/L MPP+作用24 h構(gòu)建PD 細(xì)胞模型，DHP 組用8 μg/mL DHP 預(yù)處理12 h后加入0.6 mmol/L MPP+作用24 h。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響觀察 采用MTT 法。將SH-SY5Y 細(xì)胞以5 × 104/孔接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至90%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，分別加入正常組、模型組、DHP 組的細(xì)胞培養(yǎng)基，每組均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。作用24 h 后，參照“1.3.1”進(jìn)行MTT檢測，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 細(xì)胞周期觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集三組細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 清洗，胰酶消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液終止消化。1 000 r/min 離心5 min，去上清，加1 mL預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中再次離心，去上清。輕彈管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免成團(tuán)。加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇，吹打混勻，4 ℃固定12 h。1 000 r/min 離心5 min，去上清。再次加入1 mL 預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞、離心、去上清。輕彈管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免成團(tuán)。避光條件下配制染色液，每管樣品加0.5 mL 染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞。37 ℃避光孵育30 min，4 ℃避光存放。24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀，分析細(xì)胞周期比例。

1.3.6 細(xì)胞β-gal 陽性檢測 取各組細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 洗滌1 次，加入β-gal 染色固定液1 mL，室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液，PBS 洗滌3 次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入染色工作液1 mL，37 ℃孵育過夜。β-gal 陽性細(xì)胞染為藍(lán)色，顯微鏡下觀察并計(jì)算β-gal陽性率。

1.3.7 細(xì)胞端粒酶表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取三組細(xì)胞，加入TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 端粒酶檢測試劑盒（小鼠）進(jìn)行25 μL 體系的實(shí)時(shí)定量PCR檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。將樣品和每個(gè)引物加入PCR反應(yīng)系統(tǒng)，并進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用S-W 正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 與NC 組比較，MOD 組停留時(shí)間、懸掛時(shí)間均縮短，通過時(shí)間均延長（P均＜0.05）；與MOD 組比較，DHP100 組、DHP350 組停留時(shí)間、懸掛時(shí)間均延長，通過時(shí)間均縮短，且DHP350 組停留時(shí)間、通過時(shí)間變化更明顯（P均＜0.05）。見表1。

表1 四組小鼠停留時(shí)間、懸掛時(shí)間及通過時(shí)間比較（s，）

表1 四組小鼠停留時(shí)間、懸掛時(shí)間及通過時(shí)間比較（s，）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與MOD組比較，#P＜0.05；與DHP100組比較，△P＜0.05。

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2.2 四組小鼠中腦TH 陽性神經(jīng)元數(shù)量、Lamin B1、IL-1β、IL-6 蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA 表達(dá)比較 與NC 組比較，MOD 組中腦TH 陽性神經(jīng)元數(shù)量、Lamin B1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，IL-1β、IL-6 蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均升高（P均＜0.05）；與MOD 組比較，DHP100 組、DHP350 組中腦TH 陽性神經(jīng)元數(shù)量、Lamin B1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，IL-1β 蛋白及MMP-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，且DHP350 組IL-1β 蛋白及MMP-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量變化更明顯，DHP350 組IL-6 蛋白及p16INK4amRNA 相對(duì)表達(dá)量均低于MOD組、DHP100 組（P均＜0.05）。見表2 及OSID 碼圖1、2。

表2 四組小鼠中腦TH陽性神經(jīng)元數(shù)量和Lamin B1、IL-1β、IL-6蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA表達(dá)比較（）

表2 四組小鼠中腦TH陽性神經(jīng)元數(shù)量和Lamin B1、IL-1β、IL-6蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA表達(dá)比較（）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與MOD組比較，#P＜0.05；與DHP100組比較，△P＜0.05。

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2.3 四組小鼠中腦黑質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Lamin B1表達(dá)比較 NC 組、MOD 組、DHP100 組、DHP350 組小鼠中腦黑質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Lamin B1 熒光表達(dá)量分別為10.44 ± 1.58、6.86 ± 0.38、8.09 ± 0.48、10.47 ± 1.17；MOD 組小鼠中腦黑質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Lamin B1 熒光表達(dá)量均低于NC 組、DHP100 組、DHP350組（P均＜0.05）。見OSID碼圖3。

2.4 加入三組細(xì)胞培養(yǎng)基的SH-SY5Y 細(xì)胞存活率比較 加入正常組、模型組、DHP 組細(xì)胞培養(yǎng)基的SH-SY5Y 細(xì)胞存活率分別為100.00% ± 8.48%、55.70% ± 5.73%、88.15% ± 6.55%，兩兩比較P均＜0.05。

2.5 三組細(xì)胞周期比例比較 與正常組比較，模型組G0/G1期細(xì)胞比例升高，S 期細(xì)胞比例降低（P均＜0.05）；與模型組比較，DHP 組G0/G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例升高（P均＜0.05）。三組G2/M 期細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、OSID碼圖4。

表3 三組細(xì)胞周期比例比較（%，）

表3 三組細(xì)胞周期比例比較（%，）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

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2.6 三組細(xì)胞β-gal 陽性率、端粒酶表達(dá)比較 與正常組比較，模型組β-gal 陽性率升高，端粒酶表達(dá)降低（P均＜0.05）；與模型組比較，DHP 組β-gal 陽性率降低，端粒酶表達(dá)升高（P均＜0.05）。見表4、OSID碼圖5。

表4 三組細(xì)胞β-gal陽性率、端粒酶表達(dá)比較（）

表4 三組細(xì)胞β-gal陽性率、端粒酶表達(dá)比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

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3 討論

從中醫(yī)角度出發(fā)，PD 屬于虛損病癥，又因其臨床病機(jī)故歸為“顫證”范疇，對(duì)其最早的認(rèn)識(shí)可追溯到《黃帝內(nèi)經(jīng)》［12］。目前，我國PD 發(fā)病率仍呈上升趨勢，全球范圍內(nèi)的發(fā)病率也隨著年齡的增長而穩(wěn)步升高［13-14］。PD 是一種慢性進(jìn)行性疾病，其病程發(fā)展不可逆，一經(jīng)診斷必須終生治療［14］。傳統(tǒng)的治療策略通常是提高多巴胺（DA）水平、刺激DA 釋放、抑制DA 降解，但是隨著病情不斷進(jìn)展，PD 患者腦內(nèi)DA 神經(jīng)元不斷丟失，在這一長期過程中，傳統(tǒng)藥物的治療效果往往欠佳，并且會(huì)伴隨一些難以避免的不良反應(yīng)［15］。中醫(yī)藥已有數(shù)千年的發(fā)展歷史，近年來也已經(jīng)越來越被國際接受。雖然中醫(yī)藥治療起效慢，但可長期應(yīng)用，還可以減輕西藥的不良反應(yīng)與耐藥性［16］。研究表明，中草藥具有減緩PD進(jìn)展的神經(jīng)保護(hù)潛力，并且能夠同時(shí)減輕其運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)癥狀［17-18］。中醫(yī)以辨證論治為核心，強(qiáng)調(diào)個(gè)體化治療，不良反應(yīng)較小，中西醫(yī)結(jié)合治療可以克服二者的局限，提高整體療效，達(dá)到提高患者生活質(zhì)量的目的。

細(xì)胞衰老是一種不可逆的生長停滯，因?yàn)榫哂锌乖鲋匙饔?，通常被廣泛認(rèn)為是一種有效的腫瘤防御機(jī)制。短暫的細(xì)胞衰老可能于機(jī)體有益，但持續(xù)的細(xì)胞衰老代表著功能退化，會(huì)隨著年齡和年齡相關(guān)疾病的病理發(fā)展而增加［18］。在PD模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞中的陽性衰老標(biāo)志物含量最高［19］。但目前檢測細(xì)胞衰老沒有統(tǒng)一的金標(biāo)準(zhǔn)，因此現(xiàn)在的學(xué)者大多采用多標(biāo)記法綜合考量細(xì)胞的衰老。衰老細(xì)胞本身存在細(xì)胞周期停滯，而衰老細(xì)胞中，細(xì)胞周期停滯又與細(xì)胞周期抑制物水平的增加有關(guān)，包括p16INK4a升高、Lamin B1 丟失，以及衰老相關(guān)分泌表型如IL-1β、IL-6、MMP-3表達(dá)增加，衰老相關(guān)的β-gal 陽性率升高［20］。IL-1β、IL-6同時(shí)還是炎癥相關(guān)因子，與衰老標(biāo)志物p16 都是PD 患者臨床進(jìn)展的重要預(yù)測因子［21］。本研究首先進(jìn)行了小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示與NC組比較，MOD組停留時(shí)間、懸掛時(shí)間均縮短，通過時(shí)間延長，且中腦TH陽性神經(jīng)元數(shù)量、Lamin B1蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，IL-1β、IL-6 蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，提示PD小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)元受損及細(xì)胞衰老，而使用不同濃度DHP干預(yù)后，小鼠上述改變得到緩解；這提示DHP干預(yù)可以減輕PD小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)元受損及細(xì)胞衰老。同時(shí)本研究將細(xì)胞衰老具體定位在星形膠質(zhì)細(xì)胞，其后又以星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。

衰老細(xì)胞會(huì)對(duì)周圍環(huán)境產(chǎn)生不可預(yù)估的影響，其最明顯的特征就是細(xì)胞停止分裂，細(xì)胞周期停滯，且該過程不可逆。此外，衰老的分子機(jī)制還涉及端?？s短。端粒長度的維持和延伸需要端粒酶，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶是端粒酶的催化亞單位，其表達(dá)與端粒酶活性呈正相關(guān)關(guān)系［22］。研究表明，端粒酶表達(dá)升高能夠改善PD 癥狀和α-Syn 積聚［23］。端?？s短不會(huì)發(fā)生在表達(dá)端粒酶的細(xì)胞中，星形膠質(zhì)細(xì)胞雖不表達(dá)端粒酶活性，但可以通過分裂縮短端粒導(dǎo)致衰老，以此影響神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)基會(huì)導(dǎo)致SH-SY5Y 細(xì)胞存活率降低，且模型組存在細(xì)胞周期停滯、β-gal 陽性率升高及端粒酶表達(dá)降低，而經(jīng)過DHP 干預(yù)后的細(xì)胞上述改變得到緩解；這提示DHP可以減輕MPP+誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷、細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞衰老。

綜上所述，DHP 可以減輕PD 小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙，其機(jī)制可能與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老，從而減輕神經(jīng)元損傷、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。