不同復(fù)溫時(shí)點(diǎn)的熱打擊人骨骼肌細(xì)胞損傷情況觀察及其機(jī)制

劉斌，袁芳芳，豆春麗，肖寶，李霖，李慧，蘇磊

1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬長沙醫(yī)院 長沙市第一醫(yī)院急診科，長沙 410005；2 南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科；3 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院血液科

中暑是一種嚴(yán)重威脅軍民生命的急危重病，尤其是重癥中暑，常合并多器官功能衰竭綜合征［1-3］。橫紋肌溶解癥（RM）是重癥中暑的常見并發(fā)癥，目前多采用熱打擊人骨骼肌細(xì)胞（HSKMC）的方法模擬RM［4］。瞬時(shí)感受器電位香草酸受體亞型（TRPV）通道是TRP 通道家族的一個(gè)亞型，又被稱為辣椒素受體，是目前研究最多的TRP 通道蛋白。TRPV 包括6 個(gè)亞型，其中TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4 均有明顯的熱敏感性，被稱作溫度敏感通道，對Ca2+具有通透性，其活化后介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流［5-6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，熱打擊可誘導(dǎo)HSKMC 細(xì)胞質(zhì)游離Ca2+濃度升高、線粒體損傷及炎癥因子釋放增加，從而造成細(xì)胞損傷，但是復(fù)溫后的熱打擊細(xì)胞是否恢復(fù)還是損傷加重尚不清楚［7］。2019年3月—2020年5月，本研究觀察了不同復(fù)溫時(shí)點(diǎn)的熱打擊HSKMC 損傷情況，并探討其機(jī)制是否與TRPV4 及其介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流有關(guān)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：HSKMC 購自美國Santa 公司，用高糖DMEM 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、10 萬U/L 青霉素、100 mg/L鏈霉素），于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。主要試劑：CCK-8 檢測試劑盒、ECL 發(fā)光液、鈣離子熒光探針均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TRPV4 激動(dòng)劑GSK1016790A（GSK）、TRPV4 抑制劑HC-067047（HC）均購自美國MCE 公司，TRPV4 抗體購自美國Abcam 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa 公司。儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher 公司，透射電子顯微鏡購自日本日立新公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Biorad 公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司，熒光定量PCR儀購自美國凱杰公司。

1.2 熱打擊細(xì)胞模型建立及復(fù)溫處理 將對數(shù)生長期的HSKMC 分為熱打擊組和對照組。熱打擊組于43 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，建立熱打擊細(xì)胞模型，然后置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中復(fù)溫，復(fù)溫時(shí)間分別為0、6、12、24 h。對照組置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8 法。將細(xì)胞以5 × 104/孔接種于96 孔板中，待貼壁穩(wěn)定后參照“1.2”進(jìn)行分組處理。按照CCK-8 試劑盒說明書操作，每孔加入CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃孵箱內(nèi)孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 取分組處理后的兩組細(xì)胞，2.5%戊二醛固定液固定，4 ℃孵育過夜，透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5 細(xì)胞TRPV4 蛋白檢測 采用Western blotting法。取分組處理后的兩組細(xì)胞，使用含有蛋白酶抑制劑的磷酸酶裂解液進(jìn)行裂解，提取總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒定量檢測蛋白總濃度。行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉1 h。洗膜后加入TRPV4 及內(nèi)參GAPDH 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗3 次，5 min/次；加入二抗（稀釋比例均為1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，5 min/次。使用ECL 發(fā)光液顯色、曝光，計(jì)算TRPV4蛋白相對表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞TRPV4 mRNA 檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。取分組處理后的兩組細(xì)胞，使用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，超顯微分光光度計(jì)根據(jù)OD260/280測定RNA 濃度和純度，轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，上PCR 儀進(jìn)行檢測。TRPV4 引物序列：上游引物5'-ATCGTCTCAGCAGCCCTCTA-3'、下游引物5'-TCGGAAAAGGTCCTTGAAGA-3'、引物長度168 bp；內(nèi)參GAPDH 引物序列：上游引物為5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'、下游引物為5'-TTCTAGACGGCAGGTCAGG-3'、引物長度201 bp。采用2-ΔΔCt法計(jì)算TRPV4 mRNA相對表達(dá)量。

1.7 TRPV4 對Ca2+內(nèi)流的影響觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。將對數(shù)生長期的HSKMC分為四組，即HS組、GSK+HS 組、HC+HS 組和NC 組。HS 組、GSK+HS組、HC+HS組均參照1.2建立熱打擊細(xì)胞模型，復(fù)溫時(shí)間均為12 h，GSK+HS 組、HC+HS 組在熱打擊前0.5 h 分別給予GSK 500 nmol、HC 5 μmol；NC 組僅在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。去除各組細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 沖洗3 次。按照鈣離子熒光探針說明書加入Fluo-4 AM 工作液（2 μmol），37 ℃孵育60 min進(jìn)行熒光探針裝載。PBS 沖洗3 次，上流式細(xì)胞儀檢測Fluo-4 熒光強(qiáng)度，以此表示細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為520 nm。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用S-W 正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞存活率比較 復(fù)溫0、6、12、24 h的熱打擊組與對照組細(xì)胞存活率分別為80.81% ±6.14%、73.19% ± 6.09%、61.41% ± 7.9%、40.33% ±2.08%、100.00%；與對照組比較，復(fù)溫0、6、12、24 h的熱打擊組細(xì)胞存活率均降低（P均＜0.05）；隨著復(fù)溫時(shí)間的延長，熱打擊組細(xì)胞存活率依次降低，兩兩比較P均＜0.05。

2.2 兩組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較 與對照組比較，復(fù)溫0、6 h的熱打擊組細(xì)胞即可出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、體積變大，細(xì)胞質(zhì)空泡化，線粒體腫脹、脫顆粒、雙嵴消失，細(xì)胞核周間隙增寬，細(xì)胞核凝聚、固縮，部分包膜連續(xù)性中斷；復(fù)溫12、24 h的熱打擊組細(xì)胞出現(xiàn)核仁溶解消失，細(xì)胞核碎裂、染色質(zhì)邊集，細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)崩解、呈顆粒狀。見OSID碼圖1。

2.3 兩組細(xì)胞TRPV4 mRNA 及蛋白相對表達(dá)量比較 與對照組比較，復(fù)溫0、6、12、24 h的熱打擊組細(xì)胞TRPV4 mRNA 及蛋白相對表達(dá)量均升高（P均＜0.05）。復(fù)溫0、6、12 h 的熱打擊組細(xì)胞TRPV4 蛋白相對表達(dá)量依次升高（P均＜0.05），復(fù)溫12、24 h的熱打擊組細(xì)胞TRPV4 蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。復(fù)溫0、6、12、24 h的熱打擊組細(xì)胞TRPV4 mRNA 依次升高，兩兩比較P均＜0.05。見表1及OSID碼圖2。

表1 兩組細(xì)胞TRPV4 mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較（）

表1 兩組細(xì)胞TRPV4 mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

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2.4 四組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較 NC 組、HC+HS 組、HS 組、GSK+HS 組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度分別為2.72 ±0.54、6.06 ± 0.70、11.94 ± 1.35、31.61 ± 1.73，組間兩兩比較P均＜0.05。

3 討論

中暑是在劇烈的體力活動(dòng)或暴露在熱環(huán)境后發(fā)生的極端高溫（核心體溫 ＞ 40.5 ℃）。根據(jù)病因和易感人群，中暑可分為經(jīng)典型中暑和勞累型中暑［1］。RM 是勞累型中暑的常見并發(fā)癥，防治RM 是改善重癥中暑患者多器官功能衰竭綜合征及預(yù)后的關(guān)鍵措施［8，10-12］。RM 發(fā)生時(shí)肌細(xì)胞被破壞，釋放細(xì)胞內(nèi)毒素、自由基及炎癥介質(zhì)等物質(zhì)入血，進(jìn)一步引起凝血功能紊亂、血管內(nèi)皮損傷、酸堿失衡等，從而造成多器官功能衰竭，增加患者病死率。以往研究報(bào)道，RM 并發(fā)其他臟器功能損傷的發(fā)生率為51.0%，病死率高達(dá)32.0%［8］。急性腎功能衰竭和彌漫性血管內(nèi)凝血是RM 晚期最嚴(yán)重的并發(fā)癥，15%～33%的RM 患者可能發(fā)生急性腎功能衰竭［8-9］。此外，約25%的RM 患者還可能合并肝功能異常。因此，針對RM 進(jìn)行相關(guān)研究對于降低重癥中暑患者病死率具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，復(fù)溫0、6、12、24 h的熱打擊組細(xì)胞存活率均低于對照組，且隨著復(fù)溫時(shí)間的延長，熱打擊組細(xì)胞存活率依次降低；超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，復(fù)溫0、6 h的熱打擊組細(xì)胞即可出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)改變，而復(fù)溫12、24 h的熱打擊組細(xì)胞甚至出現(xiàn)核仁溶解消失，細(xì)胞核碎裂、染色質(zhì)邊集，細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)崩解、呈顆粒狀；這提示熱打擊會(huì)降低HSKMC 存活率，且會(huì)造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，復(fù)溫時(shí)間越長，上述變化越明顯。

目前，RM 引發(fā)肌細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚未明確，可能與下列因素有關(guān)：①三磷酸腺苷（ATP）耗竭：位于質(zhì)膜（肌膜）上的離子通道（包括Na+/K+泵和Na+/Ca2+交換器）在正常情況下維持細(xì)胞內(nèi)低Na+和Ca2+濃度，而在肌纖維內(nèi)保持高K+濃度；肌肉去極化導(dǎo)致Ca2+從肌質(zhì)網(wǎng)流入細(xì)胞質(zhì)，引起肌肉細(xì)胞發(fā)生肌動(dòng)蛋白—肌球蛋白交聯(lián)收縮，所有這些過程都依賴于ATP 提供能量。RM 發(fā)生時(shí)伴隨ATP 能量耗竭，肌酸磷酸水平下降，糖元儲(chǔ)存減少等代謝紊亂；當(dāng)ATP 能量降低或ATP 消耗發(fā)生時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)平衡的破壞，結(jié)果是細(xì)胞內(nèi)過多的Na+和Ca2+流入，細(xì)胞內(nèi)Na+增加會(huì)將水吸入細(xì)胞內(nèi)，破壞細(xì)胞內(nèi)空間的完整性；而細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的肌原纖維收縮，進(jìn)一步耗盡ATP。②細(xì)胞內(nèi)鈣超載：肌肉缺血損傷導(dǎo)致各種病理性變化，使Ca2+內(nèi)流增多，細(xì)胞內(nèi)鈣超載繼發(fā)細(xì)胞功能失調(diào)，磷酸化酶、蛋白酶、核酸酶被激活，細(xì)胞膜被降解，細(xì)胞呼吸被抑制，造成ATP 生成減少。酶的激活伴隨大量能量需求，從而加劇缺血細(xì)胞已經(jīng)存在的能量危機(jī)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但不管其機(jī)制如何，往往都是通過級聯(lián)效應(yīng)，使細(xì)胞外的Ca2+進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致鈣超載，細(xì)胞內(nèi)鈣依賴性蛋白酶及磷脂酶被激活，肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白產(chǎn)生病理性交互作用，導(dǎo)致肌原纖維、細(xì)胞骨架及細(xì)胞膜蛋白破壞，引起肌肉破壞、肌纖維壞死及細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外和血液中。各種損傷最終結(jié)合在一個(gè)共同的效應(yīng)通路上，從而啟動(dòng)RM的級聯(lián)反應(yīng)［14］。

TRPV4 是一種非選擇性的Ca2+通道蛋白，能被機(jī)械刺激、熱和內(nèi)源性花生四烯酸代謝物（環(huán)氧二十三烷酸）在內(nèi)的多種物理化學(xué)刺激以及炎癥刺激激活［14-15］。目前研究顯示，TRPV4 在腸上皮細(xì)胞、腸巨噬細(xì)胞和腸神經(jīng)元等細(xì)胞中高表達(dá)［16-17］。TRPV4 激活可引起腸膠質(zhì)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，并促進(jìn)ATP 釋放與炎癥因子表達(dá)［18］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，復(fù)溫0、6、12、24 h 的熱打擊組細(xì)胞TRPV4 mRNA 及蛋白相對表達(dá)量均升高，且隨著復(fù)溫時(shí)間的延長，其升高更明顯；這提示熱打擊造成HSKMC損傷的機(jī)制與激活TRPV4 有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，NC組、HC+HS組、HS組、GSK+HS組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度依次升高，提示TRPV4特異性抑制劑HC可降低Ca2+內(nèi)流，TRPV4特異性激動(dòng)劑GSK則促進(jìn)Ca2+內(nèi)流。

綜上所述，熱打擊會(huì)造成HSKMC 存活率降低及結(jié)構(gòu)損傷，熱打擊后復(fù)溫時(shí)間越長對細(xì)胞的損傷越大，其機(jī)制可能與促進(jìn)TRPV4 表達(dá)及其介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流有關(guān)，為尋找預(yù)防與治療RM 提供了新的干預(yù)靶點(diǎn)。但是本研究僅初步探討了TRPV4 參與RM的可能機(jī)制，仍需進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證并深入探討其相關(guān)調(diào)控機(jī)制。