超高效液相色譜法測(cè)定德谷胰島素含量

李晴晴，孟盼盼，李敬

（江蘇萬(wàn)邦醫(yī)藥科技有限公司，江蘇徐州 221004）

糖尿?。―iabetic Mellitus，DM）屬慢性終身性疾病，是一種高發(fā)病率、嚴(yán)重影響人們正常生活工作的慢性病[1]。近些年，全球糖尿病患病人數(shù)一直在大幅度增加，其中2 型糖尿?。―iabetic Mellitus Type 2，T2DM）患者約占糖尿病患者總數(shù)的90%，已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。德谷胰島素（Insulin Degludec，IDeg）為超長(zhǎng)效基礎(chǔ)胰島素類(lèi)似物[2]，注射后形成多六聚體，從可溶性?xún)?chǔ)存庫(kù)中緩慢釋放，能夠持久、平穩(wěn)、長(zhǎng)期降血糖，減輕病人的生理痛苦，增強(qiáng)病人順應(yīng)性[3-7]，廣泛用于2 型糖尿病的治療[8]。

德谷胰島素含量檢測(cè)方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC），其中紫外分光光度法采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行直接測(cè)定，HPLC 通過(guò)色譜柱分離作用將有關(guān)物質(zhì)、雜質(zhì)等進(jìn)行分離，故結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠[9]。江蘇萬(wàn)邦醫(yī)藥科技有限公司現(xiàn)采用HPLC 控制產(chǎn)品中德谷胰島素含量，德谷胰島素主峰出峰時(shí)間約為22 min,高效液相色譜法分析時(shí)間長(zhǎng)、系統(tǒng)死體積較大，檢測(cè)成本高。與傳統(tǒng)的HPLC 相比，超高效液相色譜（UPLC）填料顆粒小、均勻，具有柱效高、分析速度快、分離度高、靈敏度好等特點(diǎn)[10-11]，因此被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物研究分析等領(lǐng)域[12]。因此，本研究采用UPLC 法測(cè)定德谷胰島素的含量，為提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30A 超高效液相色譜儀，日本Shimadzu 公司；XS105 分析天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；ToledoXSR105 電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司。

無(wú)水硫酸鈉、磷酸二氫鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，默克股份兩合有限公司；德谷胰島素，江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件及參數(shù)

色譜柱：Waters C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A 為0.1 mol/L 硫酸鈉溶液（稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉14.2 g，磷酸二氫鈉15.6 g，加水800 mL，溶解后用8 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至5.7，加入乙腈100 mL，加水定容至1 000 mL，混勻）-乙腈（體積比90 ∶10），流動(dòng)相B 為50%乙腈；梯度洗脫程序：0 ～20 min，50%B；20 ～21 min，50%B ～80%B；21 ～24 min，80%B；24 ～25 min，80%B ～50%B；25 ～30 min，50%B）；柱溫：40 ℃；流速：0.25 mL/min；波長(zhǎng)：214 nm，進(jìn)樣量：2 μL。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 空白溶液

0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液：稱(chēng)取1.56 g 二水合磷酸二氫鈉，加1 000 mL 水溶解混勻后，1 mol/L NaOH調(diào)pH 至7.5，混勻，經(jīng)微孔濾膜（水系0.45μm）過(guò)濾后作為空白溶液。

1.2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液

取德谷胰島素適量，60 ℃烘箱放置2 ～5 d，使與主峰保留時(shí)間約為1.16 min 的雜質(zhì)分離度大于2.0。稱(chēng)取以上樣品，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適用性溶液。

1.2.2.3 對(duì)照品溶液

取德谷胰島素對(duì)照品約10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.2.4 供試品溶液

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：取德谷胰島素對(duì)照品約50 mg，置25 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成2 mg/mL 的對(duì)照品濃溶液，分別取對(duì)照品溶液適量，配制成約0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL、1.0 mg/mL 與1.2 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

（2）重復(fù)性溶液：取德谷胰島素樣品約10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液，平行6 份。

（3）中間精密度溶液：取德谷胰島素樣品約10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液。兩名分析人員分別處理6 份，并于不同日期使用不同儀器進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)量。

（4）準(zhǔn)確度溶液：取德谷胰島素對(duì)照品約8 mg、10 mg、12 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成含德谷胰島素約80%、100%、120%的供試品溶液，每個(gè)濃度分別平行3 份。

（5）穩(wěn)定性溶液：取德谷胰島素樣品約10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液。在樣品配制完成后約0 h、4 h、8 h、12 h、24 h 與36 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。

（6）耐用性溶液：取德谷胰島素樣品約10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成1 mg/mL 的供試品溶液。分別對(duì)柱溫（±2 ℃），流速（±0.01 mL/min）與波長(zhǎng)（±2 nm）進(jìn)行微小的變動(dòng)，每次變動(dòng)一個(gè)因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化過(guò)程

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相①：A 為0.1 mol/L 磷酸鹽溶液（稱(chēng)取磷酸二氫銨11.5 g，加水800 mL 溶解，加乙腈100 mL，混勻，用85%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.7，加水定容至1 000 mL），流動(dòng)相B 為80%乙腈。流動(dòng)相②：A 為0.1 mol/L 硫酸鈉溶液（稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉14.2 g，磷酸二氫鈉15.6 g，加水800 mL，溶解后用8 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至5.7，加入乙腈100 mL，加水定容至1 000 mL，混勻）-乙腈（體積比90 ∶10），流動(dòng)相B為50%乙腈。樣品色譜檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示，流動(dòng)相②峰型對(duì)稱(chēng)、響應(yīng)高、出峰時(shí)間早，適合作為流動(dòng)相使用。

圖1 不同流動(dòng)相檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 色譜柱的選擇

色譜柱①：Waters C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；色譜柱②：Shim-pack GISS C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）。樣品檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示，色譜柱①主峰拖尾因子為0.98，且主峰與主峰后雜質(zhì)分離效果較好；色譜柱②主峰拖尾因子為1.23，主峰與主峰后雜質(zhì)不能有效分離，故選擇色譜柱①進(jìn)行樣品檢測(cè)。

圖2 不同色譜柱檢測(cè)結(jié)果

2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

將空白溶液、系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，如圖3 所示。色譜結(jié)果顯示，空白溶液不干擾目標(biāo)色譜峰檢測(cè)，專(zhuān)屬性良好。

圖3 專(zhuān)屬性色譜圖

2.3 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。峰面積的RSD為0.08%，表明儀器的精密度良好。

2.4 線性與范圍

不同濃度下，德谷胰島素檢測(cè)峰面積見(jiàn)表1。以峰面積（y）對(duì)濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得線性方程為y=147.37x-0.018 7，R2=0.999 9。結(jié)果顯示，在線性范圍內(nèi)，德谷胰島素峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 重復(fù)性

重復(fù)性溶液的RSD為0.05%，見(jiàn)表2，表明該分析方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 中間精密度

中間精密度溶液的RSD為0.34%，見(jiàn)表3，表明該分析方法中間精密度良好。

表3 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 準(zhǔn)確度

回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，該方法下德谷胰島素的回收率在99.17%～101.27%，RSD＜5%，方法準(zhǔn)確度良好。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性

計(jì)算對(duì)照品溶液中德谷胰島素峰面積的RSD與供試品溶液含量的RSD，見(jiàn)表5。對(duì)照品溶液中德谷胰島素峰面積的RSD為0.28%；供試品溶液含量的RSD為0.21%。結(jié)果表明，對(duì)照品與供試品溶液至少36 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 耐用性

將柱溫（±2 ℃）、流速（±0.01 mL/min）與波長(zhǎng)（±2 nm）進(jìn)行微小的變動(dòng)，考察方法耐用性，見(jiàn)表6。結(jié)果表明，色譜條件進(jìn)行微小變動(dòng)時(shí)RSD均小于0.5%，方法耐用性良好。

表6 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 實(shí)際樣品測(cè)定

分別稱(chēng)取三批德谷胰島素產(chǎn)品（批號(hào)F01、F02、F03）約10 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL 量瓶，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL 的供試品溶液，按照1.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 實(shí)際樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了檢測(cè)德谷胰島素含量的UPLC 方法。該方法下，德谷胰島素出峰時(shí)間約為11 min，與普通高效液相色譜需要的22 min 相比，檢測(cè)時(shí)間縮短了50%，能快速檢測(cè)出德谷胰島素含量。該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，線性范圍廣，回收率高，重復(fù)性、穩(wěn)定性及耐用性良好，可用于提升德谷胰島素含量標(biāo)準(zhǔn)。