N7-甲基鳥苷（m7G）在肝細(xì)胞癌中的作用機(jī)制

高 春， 江晶晶， 陳玉春， 于曉輝， 張久聰， 鄭曉鳳

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000； 2 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院消化內(nèi)科， 蘭州 730050； 3 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科， 蘭州 730030

肝癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，肝細(xì)胞癌（HCC）約占肝癌相關(guān)死亡的90%［1］，手術(shù)切除、消融治療、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞、免疫治療和全身化療藥物已經(jīng)用于早期至晚期HCC 的治療［2］。盡管近年來(lái)HCC的治療已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但由于其發(fā)病機(jī)制的高度復(fù)雜性和靶點(diǎn)的單一性，使得患者的預(yù)后仍然相對(duì)較差［3］。此外，生物分子研究的最新進(jìn)展在疾病分子機(jī)制、診斷生物標(biāo)志物和預(yù)后生物標(biāo)志物的鑒定中起重要作用。然而，目前還沒(méi)有確定的可以預(yù)測(cè)治療效果的生物標(biāo)志物。因此，尋找有效的生物標(biāo)志物可以幫助臨床醫(yī)生為患者制訂精準(zhǔn)的治療方案。

由于高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后修飾在多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。迄今為止，已經(jīng)在不同分子中發(fā)現(xiàn)了170 多種類型的RNA修飾，包括信使RNA（mRNA）、核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）［4-5］。N7-甲基鳥苷（N7-methylguanosine，m7G）修飾是最常見的RNA修飾之一，通常位于真核細(xì)胞mRNA的5′帽和內(nèi)部區(qū)域，或所有物種的rRNA 和tRNA 內(nèi)部區(qū)域，且是一種帶正電荷的RNA 修飾［6-8］。先前的研究［9］表明，有100 多個(gè)基因與m7G 甲基化及其位點(diǎn)相關(guān)。此外，文獻(xiàn)［10-12］報(bào)道m(xù)7G 甲基化修飾與部分癌癥發(fā)展密切相關(guān)，并參與多種癌癥相關(guān)的生物學(xué)活動(dòng)，但m7G甲基化與HCC發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚未闡明。因此，本文就m7G 甲基化修飾在HCC 發(fā)病機(jī)制中的潛在作用及與m7G 相關(guān)的診斷技術(shù)和治療策略進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，為深入研究HCC的分子機(jī)制及治療提供新的理論支持。

1 m7G概述

tRNA 是蛋白質(zhì)翻譯的銜接分子，用于識(shí)別mRNA密碼子并產(chǎn)生相應(yīng)的氨基酸。tRNA 的修飾對(duì)tRNA穩(wěn)定性、密碼子識(shí)別和有效的蛋白質(zhì)合成至關(guān)重要，研究［13］表明tRNA 修飾的失調(diào)與線粒體疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。m7G 是位于tRNA 可變環(huán)中第46 位核苷酸上的最常見的一種高度保守的tRNA 修飾，存在于原核生物、真核生物以及一些古細(xì)菌中，可促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)控和致癌mRNA 的翻譯，并最終推動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌癥進(jìn)展［12］。m7G tRNA 修飾由酵母中的Trm8p/Trm82p 異二聚體復(fù)合物和人類中相應(yīng)的鄰位甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白1（methyltransferase-like 1，METTL1）和WD 重 復(fù) 結(jié) 構(gòu) 域4（WD repeat domain 4，WDR4）蛋白催化（圖1）［14］。m7G tRNA 修飾在酵母中是一種不必要的修飾，但在哺乳動(dòng)物中，它決定著受損的干細(xì)胞的命運(yùn)，并且與發(fā)育畸形等疾病密切相關(guān)。在人類中，編碼WDR4 的突變導(dǎo)致tRNA m7G 修飾受損，并導(dǎo)致一種以面部畸形、腦畸形、大腦發(fā)育異常，以及伴有癲癇發(fā)作的嚴(yán)重腦?。?5-17］。位于人類染色體21q22.3的WDR4也是一些唐氏綜合征表型的候選基因，包括由人類患者染色體區(qū)域三體性導(dǎo)致的智力低下［18］。這表明與酵母相比，m7G tRNA 修飾在哺乳動(dòng)物中可能具有更重要的生理功能。此外，據(jù)報(bào)道［19］在生長(zhǎng)因子刺激下，METTL1 受蛋白激酶B 和核糖體S6激酶調(diào)節(jié)，并影響癌癥細(xì)胞的存活率和對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性。這與Liu 等［20］、Okamoto 等［21］的研究結(jié)果類似，METTL1在癌癥組織中上調(diào)，并可調(diào)節(jié)5-氟尿嘧啶的敏感性。然而，尚未在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)到m7G tRNA 修飾的全部程度，并且由于METTL1/WDR4缺陷介導(dǎo)的缺陷m7G tRNA 修飾所導(dǎo)致的不良發(fā)育后果或相關(guān)疾病的分子和細(xì)胞機(jī)制尚不明確。

圖1 m7G的結(jié)構(gòu)及修飾Figure 1 Structure and modification of m7G

此外，Pandolfini 等［22］發(fā)現(xiàn)，由METTL1/WDR4 復(fù)合物介導(dǎo)的m7G 也可以發(fā)生于miRNA，進(jìn)而調(diào)節(jié)miRNA 結(jié)構(gòu)并促進(jìn)細(xì)胞遷移。Zhang 等［23］通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物mRNA 內(nèi)部m7G 位點(diǎn)進(jìn)行m7G MeRIP 測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)m7G 甲基化可能影響mRNA 翻譯。同時(shí)，Zhao等［24］也證明了m7G 在mRNA 中的作用，該研究發(fā)現(xiàn)METTL1是導(dǎo)致缺血組織mRNA 內(nèi)m7G 減少的主要潛在原因，并通過(guò)促進(jìn)VEGFA mRNA 翻譯以促進(jìn)缺血后血管生成。

2 m7G檢測(cè)方法

自m7G 首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為m7G 在生物學(xué)過(guò)程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，但具體的調(diào)控機(jī)制尚不明朗［25］。此外，由于m7G 不影響Watson-Crick 堿基雜交，且在RNA 中相對(duì)含量較低，準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)m7G 存在一定困難。因此，尋找一種高效的m7G 檢測(cè)方法迫在眉睫。目前檢測(cè)m7G 甲基化的方法包括定量檢測(cè)和位點(diǎn)檢測(cè)。最先用于甲基化測(cè)序的檢測(cè)方法是高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，它們通過(guò)核苷的極性不同，使用UV、質(zhì)譜分離得到的核苷進(jìn)行檢測(cè)［26］。基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法具有高度特異性和極高的靈敏度，檢測(cè)限值為0.2 fmol［27］。雖然這些方法可實(shí)現(xiàn)m7G tRNA 定量檢測(cè)，但成本均較昂貴且操作不當(dāng)易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。

隨著高通量測(cè)序的出現(xiàn)，對(duì)m7G 進(jìn)行位點(diǎn)的檢測(cè)成為了可能［28］，目前相關(guān)檢測(cè)方法包括m7G MeRIP seq、m7G seq 和m7G miCLIP seq 技 術(shù)。傳 統(tǒng) 的m7G MeRIP seq 方法依賴于抗體免疫沉淀，分辨率有限（～80 bp）［29］。基于逆轉(zhuǎn)錄終止，m7G seq 在檢測(cè)人mRNA和tRNA中的m7G修飾時(shí)實(shí)現(xiàn)了堿基解析（圖2）。Zhang 等［23］研發(fā)的m7G seq 可以在沒(méi)有抗體富集的情況下，在人類細(xì)胞中以單核苷酸分辨率實(shí)現(xiàn)內(nèi)部m7G的轉(zhuǎn)錄組范圍映射。同時(shí)，他們?cè)贛ETTL1 敲除細(xì)胞中進(jìn)行了m7G seq，并證實(shí)了METTL1 的tRNA m7G 甲基化功能。這種新方法使人們能夠以高特異性和保真度繪制內(nèi)部m7G 修飾的精確位置和序列基序，但會(huì)影響單個(gè)m7G 位點(diǎn)修飾水平的準(zhǔn)確檢測(cè)，因?yàn)橹挥幸徊糠治稽c(diǎn)轉(zhuǎn)化為可以被檢測(cè)到的堿性位點(diǎn)。Lin等［30］使用了m7G seq 和tRNA 還原和切割測(cè)序（TRAC seq），以揭示小鼠胚胎干細(xì)胞中的m7G tRNA甲基化，最終發(fā)現(xiàn)Mettl1敲除的小鼠胚胎干細(xì)胞中相應(yīng)密碼子的核糖體表達(dá)增加。m7G seq 和TRAC seq 在m7G 甲基化的檢測(cè)中具有高度特異性，因?yàn)檫@兩種方法可以增加m7G的位點(diǎn)特異性切割分?jǐn)?shù)，使研究者能夠以單核苷酸分辨率識(shí)別tRNA 中的全局m7G 修飾。新的m7G miCLIP seq在通過(guò)修改的miCLIP方案繪制m7G修飾圖中具有更高的靈敏度和特異度［7］，但是該方法的應(yīng)用還有待繼續(xù)探索。

圖2 m7G MeRIP seq、m7G seq檢測(cè)技術(shù)的比較Figure 2 Comparison of m7G MeRIP seq and m7G seq detection techniques

3 m7G與HCC

3.1 METTL1/WDR4 復(fù)合物與HCC 相關(guān) HCC 為全球第六大最流行的腫瘤，每年約有84.1萬(wàn)例新發(fā)病例和78.2 萬(wàn) 例 死 亡 病 例［31］。然 而，METTL1 和m7G tRNA 修飾在HCC 發(fā)生發(fā)展中的確切作用和調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。但m7G 為HCC 不明確的分子機(jī)制提供了新的線索，并可能指導(dǎo)新的治療策略。一些研究基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)分析了METTL1和WDR4的表達(dá)水平，并報(bào)告了與正常肝組織相比，在HCC 樣本中表達(dá)上調(diào)。Chen等［32］發(fā)現(xiàn)，在組織層面上，m7G tRNA修飾及其催化酶METTL1/WDR4 復(fù)合物在HCC 中升高，并與HCC患者生存率呈負(fù)相關(guān)。在細(xì)胞層面上，沉默METTL1 或WDR4 可以抑制HCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而強(qiáng)制性表達(dá)野生型METTL1 可催化死亡突變體的形成，進(jìn)而促進(jìn)HCC 進(jìn)展。這可能是因?yàn)镸ETTL1介導(dǎo)的m7G 修飾增強(qiáng)了mRNA 翻譯，并在體內(nèi)外加速了HCC 的發(fā)生和進(jìn)展，而METTL1 的敲除可使mRNA的翻譯降低［10］。這表明靶向METTL1 和調(diào)節(jié)不當(dāng)?shù)膖RNA 修飾可能是HCC 治療的一種有前途的策略。Xia 等［33］首 次 發(fā) 現(xiàn)MYC/WDR4/CCNB1 信 號(hào) 通 路 在HCC 侵襲遷移中具有一定地位。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MYC可以激活WDR4 轉(zhuǎn)錄，WDR4 通過(guò)促進(jìn)真核翻譯起始因子1A 與CCNB1 mRNA 的結(jié)合來(lái)增強(qiáng)CCNB1 翻譯，而WDR4本身也受MYC 的調(diào)節(jié)。CCNB1通過(guò)促進(jìn)P3泛素化影響HCC 中的PI53K 和AKT 磷酸化并降低P53 蛋白表達(dá)。此外，WDR4 通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞向G2/M 周期轉(zhuǎn)變和抑制細(xì)胞凋亡以減少HCC 細(xì)胞的凋亡。因此，WDR4 可作為HCC 發(fā)生和進(jìn)展中的腫瘤啟動(dòng)子，可 能 作 為HCC 的 候 選 治 療 靶 點(diǎn)。Tian 等［34］發(fā) 現(xiàn)METTL1 在HCC 中顯著上調(diào)，并通過(guò)PTEN/AKT 信號(hào)通路表現(xiàn)出致癌活性。PTEN 在METTL1 低表達(dá)的患者中被激活，PTEN 的異位表達(dá)或AKT 活性的抑制可以顯著減弱METTL1 介導(dǎo)的惡性表型。在臨床樣本中，METTL1 表達(dá)與PTEN 表達(dá)相反。METTL1 低表達(dá)和PTEN 高表達(dá)同時(shí)發(fā)生與總生存期延長(zhǎng)顯著相關(guān)，而單獨(dú)表達(dá)METTL1 或PTEN 更與不良總生存期相關(guān)。這就提示靶向METTL1/PTEN 信號(hào)軸可能在HCC的治療中具有潛在作用。

3.2 METTL1 介導(dǎo)的Arg-TCT-tRNA m7G 修飾與HCC相關(guān) 目前，關(guān)于METTL1 在癌癥中的整體相關(guān)性基本未知。但研究發(fā)現(xiàn)，METTL1/WDR4在HCC中負(fù)性介導(dǎo)m7G tRNA的密碼子依賴性核糖體停滯。METTL1功能增強(qiáng)導(dǎo)致m7G tRNA 修飾的增加，進(jìn)而引起tRNA 亞群的豐度增加，包括Arg-TCT-4-1（5個(gè)負(fù)責(zé)解碼AGA密碼子的同解碼器tRNA 之一），以及富含AGA 密碼的mRNA（包括與細(xì)胞周期相關(guān)的密碼子）的翻譯相應(yīng)增加。報(bào)告［35］分析表明，METTL1 或Arg-TCT-4-1 的過(guò)表達(dá)促進(jìn)富含AGA 密碼子的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。這說(shuō)明tRNA-Arg-TCT-4-1 上調(diào)表型復(fù)制METTL1/WDR4 過(guò)表達(dá)表型，并導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化和致癌。這與Dai 等［36］的研究結(jié)果一致，兩者都表明細(xì)胞周期進(jìn)展mRNA（如Cdk4）和某些致癌mRNA（例如Hmga2、Ash2l、Setdb1、Ube2t）富含與Arg-TCT-4-1 同源tRNA 相對(duì)應(yīng)的AGA 密碼子，因此其翻譯增加（圖3）。此外，Orellana等［35］研究表明，在沒(méi)有增加METTL1/WDR4 活性或水平的情況下，僅僅過(guò)度表達(dá)m7G-tRNA Arg-TCT-4-1，就會(huì)出現(xiàn)METTL1/WDR4 過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象，并且本身就是惡性轉(zhuǎn)化。這些發(fā)現(xiàn)增加了一個(gè)重要的新概念，即翻譯調(diào)控作為驅(qū)動(dòng)因素而不僅僅是腫瘤發(fā)生的參與者，并且這一過(guò)程極為復(fù)雜且經(jīng)常被低估。

4 前景與挑戰(zhàn)

m7G 修飾在各種腫瘤中的作用已被廣泛探討［37］。METTL1/WDR4 作為m7G 修飾的最核心調(diào)節(jié)因子在HCC 中發(fā)揮重要作用，在臨床診斷和治療中顯示出巨大潛力。據(jù)報(bào)道，METTL1和WDR4還與免疫抑制腫瘤微環(huán)境相關(guān)，并參與調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和癌癥細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞之間的促腫瘤相互作用，這可能為未來(lái)的免疫治療方法提供潛在的思路［38］。Huang 等［39］認(rèn)為，METTL1 和WDR4 的上調(diào)可促進(jìn)HCC 中侖伐替尼的耐藥性，并賦予對(duì)METTL1 靶向的敏感性，從而為解決化療藥物耐藥這一臨床難題提供了一種有希望的理論依據(jù)。此外，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后編輯靶向調(diào)節(jié)失調(diào)的METTL1/WDR4 或功能失調(diào)的m7G 位點(diǎn)可能是治愈HCC的一種潛在方法，并且可以與化療或免疫療法相結(jié)合，以在未來(lái)獲得更好的治療效果。但是迄今為止，尚未報(bào)道METTL1/WDR4 抑制劑或潛在的m7G 相關(guān)轉(zhuǎn)錄后編輯系統(tǒng)。與其他RNA 修飾類似，m7G 調(diào)節(jié)因子的小分子抑制劑可能是最有前途和最有效的腫瘤治療方法。因此，有必要對(duì)ETTL1、WDR4 兩種酶的詳細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行探討，為更早地研發(fā)有效的靶向藥物做準(zhǔn)備。

5 小結(jié)與展望

m7G 甲基化是RNA 修飾研究中的一個(gè)新興熱點(diǎn)，目前已被證明參與多種細(xì)胞過(guò)程，并與mRNA、tRNA和rRNA 的失調(diào)密切相關(guān)。盡管與m7G 相關(guān)的研究仍處于初步階段，但現(xiàn)有的研究足以表明m7G在HCC發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用。m7G 甲基轉(zhuǎn)移酶METTL1 和WDR4 的功能是在靶向RNA 中的特定位置安裝m7G修飾，從而影響RNA 分子（包括mRNA、miRNA 和rRNA）的生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)和成熟，最終調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程。目前有研究表明m7G 修飾的相關(guān)基因在HCC 中異常表達(dá)，可能作為診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的新生物標(biāo)志物。因此，靶向m7G tRNA 修飾有望成為治療HCC 患者的一種有前景的策略。目前，對(duì)于m7G 修飾這一復(fù)雜過(guò)程仍然具有太多的未知性和不確定性，尤其在HCC 中m7G 和其他轉(zhuǎn)錄后修飾是否存在相互協(xié)同或者拮抗影響等更多作用，有必要進(jìn)一步研究以更全面地闡明m7G修飾在HCC中的分子機(jī)制。

利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：高春負(fù)責(zé)論文撰寫與修改；江晶晶、陳玉春等負(fù)責(zé)論文修改和審閱；鄭曉鳳負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集；張久聰、于曉輝等負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。