富士和新紅星蘋果虎皮病抗病性與生理生化特性關(guān)系比較研究

王 燕 王建鋒 謝欣蔚 王 穎 惠 偉

中國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國和消費(fèi)國，2021 年全國蘋果總產(chǎn)量4 579.34 萬t，占世界總產(chǎn)量的54.7%。 我國蘋果90%以上用于鮮食，貯藏保鮮在緩解果實(shí)賣難，實(shí)現(xiàn)季產(chǎn)年銷中起到了重要作用。 由于貯藏期長， 一些蘋果品種在冷藏中、 后期易發(fā)生虎皮病， 造成嚴(yán)重的貯藏?fù)p失。 虎皮病發(fā)病初期， 病變部位呈不規(guī)則狀淡褐色， 面積較小， 后隨冷藏時(shí)間延長，病斑擴(kuò)大， 嚴(yán)重時(shí)連接成片。 果實(shí)出庫后，病斑面積迅速擴(kuò)大，顏色加深，病果失去商品價(jià)值。前人研究表明，虎皮病的發(fā)生與品種、采收與處理、貯藏條件等有關(guān)。目前有關(guān)發(fā)病機(jī)理的研究主要集中在果實(shí)中α-法尼烯及代謝產(chǎn)物和抗氧化能力兩個(gè)方面。Mditshwa 等發(fā)現(xiàn)，果實(shí)產(chǎn)生的乙烯誘導(dǎo)α-法尼烯合成，之后它自氧化成共軛三烯（CT）和6-甲基-5-庚烯-2-酮(MHO)，誘發(fā)虎皮病。 α-法尼烯通過甲羥戊酸途徑合成，其中α-法尼烯合成酶(AFS)是α-法尼烯合成過程中關(guān)鍵的限速酶， 而AFS1是AFS基因家族中與蘋果虎皮病關(guān)系較為密切的基因。此外，蘋果虎皮病的發(fā)生與果皮中氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)。果實(shí)衰老過程中形成的活性氧參與α-法尼烯自氧化過程， 降低了膜的完整性， 讓處于細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域的酚類物質(zhì)與多酚氧化酶發(fā)生酶促反應(yīng)， 形成醌， 從而產(chǎn)生褐斑， 導(dǎo)致虎皮病。 蘋果多酚和類黃酮具有抗氧化作用， 通過清除自由基來保護(hù)果皮細(xì)胞， 花色素苷是類黃酮的主要組分， 是紅色品種著色的物質(zhì)基礎(chǔ)，一般著色面具有良好的抗氧化性， 虎皮病發(fā)病率較低。 本文試圖通過比較不同虎皮病發(fā)生程度的富士（抗病性強(qiáng)）和新紅星（感病性強(qiáng)）兩個(gè)品種在冷藏期間果皮中α-法尼烯代謝以及抗氧化能力等變化， 揭示紅色蘋果品種虎皮病發(fā)生的可能機(jī)理， 為培育抗虎皮病蘋果品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理 在陜西白水縣采收達(dá)到商業(yè)成熟度的富士和新紅星蘋果， 采后當(dāng)天選取大小均勻、 無機(jī)械損傷和病蟲害的果實(shí)作為試驗(yàn)材料， 次日裝箱貯藏于冷庫，3 天降溫至0±0.5 ℃，相對濕度保持90%～95%。冷藏210 天后轉(zhuǎn)移至25 ℃環(huán)境中進(jìn)行貨架貯藏。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1）測定硬度與可溶性固形物。每次取10 個(gè)果實(shí)，用FT327 型硬度計(jì)測硬度，用WYT-J 型手持折光儀測可溶性固形物含量。

2）測定乙烯釋放速率與呼吸速率。 參照高俊鳳方法， 每個(gè)處理從冷庫中取10 個(gè)果實(shí)，在真空干燥器中密封2 小時(shí)，用注射器抽取1 mL氣體，用安捷倫6890N 氣相色譜儀測定乙烯釋放速率（單位μL/kg·h），重復(fù)3 次。

3）統(tǒng)計(jì)虎皮病發(fā)病率和病情指數(shù)。

4）AFS1基因的表達(dá)。 采用改良后的CTAB法， 提取-80 ℃蘋果果皮凍樣總RNA。 使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒對已提純度較好的RNA進(jìn)行cDNA 合成。 通過上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成引物，實(shí)時(shí)定量引物序列為Actin（F：5’-ATCGTGGTCATTGGCCATGT-3’R:5’-AGCCTGTGAGGTTCCAGTAATCAT-3’)AFS1(F:5’-CACAAGAATGAAGATCTTTTGTΑ -3’R:5’ -CAACAACGTTACAAACTGTAAAG-3’)。 將已轉(zhuǎn)錄成cDNA 的樣品取出后，參照TaKaRa SYBR Premix ExTaq ll 試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 分析。

5）測定α-法尼烯、共軛三烯和MHO。 參照Anet 方法稍作改進(jìn)，用打孔器打取組織小圓片，隨機(jī)取20 片，放入50 mL 離心管中，加入10 mL純化的正己烷，在25 ℃，60 Hz 搖床上震蕩提取2 小時(shí)，之后過濾定容至10 mL，迅速在232 nm波長下比色，測定α-法尼烯含量。

另取提取液3 mL，于281 nm 及290 nm 處比色，測定共軛三烯含量。

參照J(rèn)u 等方法稍作改進(jìn)，測定MHO 含量。使用固相微萃取—?dú)庀嗌V法（SPME-GC），用直徑2 cm 的打孔器隨機(jī)打20 個(gè)果皮組織圓片（厚度3 mm）， 加入15 mL 樣品瓶中， 加2 mL NaCl 溶液（200 g/L）密閉3 小時(shí)。 用老化后的萃取頭萃取20 分鐘后進(jìn)行GC 分析。 進(jìn)樣口解析2 分鐘。 GC 設(shè)置為不分流進(jìn)樣；柱初溫40 ℃保持2 分鐘后， 以50 ℃/min 的速率升至250 ℃，運(yùn)行2 分鐘；用氫離子火焰（FID）檢測器，溫度250 ℃。 用外標(biāo)法定性，單位μL/kg·h。

6）測定總酚和類黃酮含量。參照陳瑋琦等的方法，采用Folin-ciocalteu 法測定總酚。取研磨后的果皮凍樣于1%HCL-甲醇溶液中避光浸提24小時(shí)，70 ℃超聲波提取60 分鐘，9 000 rpm/min 離心10 分鐘， 取上清液用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法測定果皮類黃酮含量，每個(gè)樣品3 次重復(fù)。

7）測定花青苷相對含量。 參照宋哲等的方法測定花青苷含量，稍作改進(jìn)。取10 個(gè)樣果，將果皮切碎充分混合， 取0.5 g 鮮樣， 加入20 mL HCL-甲醇溶液，4 ℃下浸提24 小時(shí)， 用分光光度法測定提取液657 nm 和530 nm 處吸光度值， 兩者吸光度值之差即為花青苷的相對含量。

8）測定DPPH 自由基清除率。 參照陳瑋琦等的方法測定DPPH 自由基清除率，稍作改進(jìn)。向0.5 mL 樣品提取液中加入4.5 mL DPPH 溶液，搖勻，暗處室溫放置30 分鐘，于517 nm 處測定吸光度值，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

9）數(shù)據(jù)處理與作圖。 所有處理和測定指標(biāo)均重復(fù)3 次， 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Excel 2003 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏期間富士和新紅星蘋果硬度、可溶性固形物含量變化 由圖1A 可知，冷藏期間，富士和新紅星的硬度皆隨冷藏時(shí)間延長呈逐漸降低趨勢。 除在第120 天時(shí)兩種蘋果的硬度達(dá)到相同值6 kg/cm2外， 在整個(gè)冷藏過程中富士的硬度整體高于新紅星，且差異顯著（P＜0.05）。由圖1B 可知， 富士在整個(gè)冷藏期間的可溶性固形物含量始終高于新紅星， 兩者差異極顯著（P＜0.01）。冷藏7 個(gè)月時(shí)，它們的可溶性固形物含量分別由16.8%、12.4%降到14%、10%。

圖1 冷藏期間富士和新紅星蘋果硬度、可溶性固形物含量變化

2.2 冷藏期間富士和新紅星蘋果乙烯釋放速率和呼吸速率的變化 由圖2A 可知，整個(gè)冷藏期間，富士在第120 天達(dá)到乙烯釋放峰值，而新紅星在冷藏第90 天即達(dá)到乙烯釋放峰值， 比富士提前30 天，而且峰值極顯著高于富士（P＜0.01）。由圖2B 可知，整個(gè)冷藏期間，富士和新紅星呼吸速率皆于冷藏第90 天達(dá)到峰值，富士呼吸速率始終低于新紅星，兩者差異顯著（P＜0.05）。

圖2 冷藏期間富士和新紅星蘋果乙烯釋放速率和呼吸速率變化

2.3 冷藏期間富士和新紅星蘋果虎皮病發(fā)病率和病情指數(shù)的變化 由圖3A 可知， 冷藏結(jié)束（210 天）時(shí)，富士未發(fā)生虎皮病，出庫室溫下（25 ℃）放置10 天后，仍沒有發(fā)生虎皮病。 冷藏結(jié)束（210 天）時(shí)，新紅星虎皮病果率為73.3%，出庫室溫下放置10 天后， 新紅星病果率增至100%， 相比冷藏期剛結(jié)束時(shí)， 發(fā)病率增加26.7%，差異顯著（P＜0.05）。 由圖3B 可知，冷藏結(jié)束（210 天）時(shí)新紅星虎皮病病情指數(shù)為51.1%，出庫室溫下放置10 天后，病情指數(shù)升高到87.8%，相比冷藏期剛結(jié)束時(shí)增加了36.7%，差異極顯著（P＜0.01）。

圖3 富士和新紅星蘋果在210 天冷藏和10 天貨架期后虎皮病發(fā)病率和病情指數(shù)指數(shù)

2.4 冷藏期間富士和新紅星蘋果果皮內(nèi)AFS1基因相對表達(dá)量的變化 由圖4 可知， 整個(gè)冷藏期間， 富士和新紅星果皮內(nèi)AFS1基因的表達(dá)量與乙烯的變化趨勢相似， 富士比新紅星推遲1 個(gè)月， 分別在第120 天和90 天達(dá)到峰值，且峰值差異顯著（P＜0.05）

圖4 冷藏期間富士和新紅星蘋果果皮內(nèi)AFS1 基因相對表達(dá)量的變化

2.5 冷藏期間富士和新紅星蘋果果皮中α-法尼烯、 共軛三烯和MHO 含量的變化 由圖5A可知， 整個(gè)冷藏期間， 富士和新紅星果皮內(nèi)α-法尼烯含量變化類似AFS1基因表達(dá)量變化， 富士于150 天達(dá)到峰值， 新紅星于120 天達(dá)到峰值， 富士峰值低于新紅星， 二者差異顯著（P＜0.05）。由圖5B 可知，整個(gè)冷藏期間，富士和新紅星果皮內(nèi)共軛三烯含量皆呈增加趨勢，富士共軛三烯含量始終低于新紅星， 二者差異顯著（P＜0.05）。 由圖5C 可知，冷藏90 天后新紅星果皮內(nèi)MHO 含量呈快速增加趨勢， 而富士果皮中MHO 的含量保持相對穩(wěn)定水平，且冷藏第120 天后均低于新紅星， 二者差異顯著（P＜0.05）。

圖5 冷藏期間富士和新紅星蘋果果皮內(nèi)α-法尼烯、共軛三烯、MHO 含量的變化

2.6 冷藏期間富士和新紅星蘋果抗氧化能力的變化 由圖6A 可知，整個(gè)冷藏期間，富士果皮內(nèi)類黃酮含量波動較大， 在150 天時(shí)出現(xiàn)峰值達(dá)到0.34 mg/g，而新紅星果皮內(nèi)類黃酮含量較富士變化平穩(wěn)，二者差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 冷藏期間富士和新紅星蘋果果皮中類黃酮、花青苷、總酚和DPPH 自由基清除率變化

由圖6B 可知，整個(gè)冷藏期間，兩個(gè)品種果實(shí)花青苷含量都呈現(xiàn)先短暫升高后降低的變化趨勢。 在冷藏初期（0～60 天），富士花青苷含量變化不明顯，第90 天前有過短暫增加，此后開始降低；果皮內(nèi)花青苷含量0～60 天時(shí)較高，峰值出現(xiàn)在冷藏第60 天， 此后開始降低。 冷藏120 天后， 富士和新紅星果皮內(nèi)花青苷含量差異不顯著（P＞0.05）。

如圖6C 所示，整個(gè)冷藏期間，富士和新紅星果皮內(nèi)總酚含量皆呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，富士于冷藏120 天達(dá)到峰值（6.98 mg/g），新紅星于150 天達(dá)到峰值（6.6 mg/g），整個(gè)冷藏期間富士果皮內(nèi)總酚含量整體高于新紅星，二者差異顯著（P＜0.05）。

自由基清除能力是蘋果總抗氧化能力的一個(gè)指標(biāo)，由圖6D 可知，整個(gè)冷藏期間，兩個(gè)品種果皮內(nèi)DPPH 自由基清除能力都呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，但富士的下降速度相對緩慢。 在冷藏初期（30 天），兩個(gè)品種DPPH 自由基清除能力差異不顯著（P＞0.05），30 天后，富士DPPH 自由基清除能力始終高于新紅星， 二者差異顯著（P＜0.05）。由此說明，冷藏期間富士果皮抗氧化能力高于新紅星。

3 討論

虎皮病是一種生理性病害， 不影響果肉顏色，但會造成果實(shí)風(fēng)味下降，失去商品價(jià)值。 富士和新紅星都是紅色蘋果品種， 新紅星冷藏4個(gè)月就開始發(fā)生虎皮病， 富士發(fā)病期在冷藏7個(gè)月以后，程度較輕。

Ding 等研究發(fā)現(xiàn)， 青香蕉蘋果冷藏90 天虎皮病隨乙烯釋放速率上升而加重。 本研究發(fā)現(xiàn)，冷藏過程中新紅星乙烯釋放速率、呼吸速率整體高于富士（圖2）；兩個(gè)品種冷藏后期虎皮病發(fā)病差異極顯著（P＜0.01），富士始終未發(fā)病而新紅星發(fā)病率極高（圖3A），這與品種耐貯性差異有關(guān)，新紅星果肉容易發(fā)綿，而富士則能夠一直保持較高的硬度（圖1A）。

有關(guān)蘋果虎皮病發(fā)病機(jī)理的研究表明，α-法尼烯及代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)了虎皮病的發(fā)生。 蘋果冷藏期間產(chǎn)生大量α-法尼烯， 之后極易被氧化生成共軛三烯， 共軛三烯又氧化成MHO， 這些揮發(fā)性物質(zhì)是誘導(dǎo)虎皮病發(fā)生的關(guān)鍵。 索江濤等認(rèn)為， α-法尼烯和共軛三烯的積累與紅富士蘋果虎皮病的發(fā)生有顯著正相關(guān)性。 Sabban 等證實(shí)了澳洲青蘋虎皮病的發(fā)生與其內(nèi)源MHO含量有關(guān)。 Farneti 等對澳洲青蘋果皮中非靶向代謝物進(jìn)行研究， 共發(fā)現(xiàn)3 種代謝產(chǎn)物， 其中MHO 與虎皮病關(guān)系極為密切。 蘋果的α-法尼烯合成酶基因AFS1對α-法尼烯合成起著至關(guān)重要的作用， 而且AFS1基因受到乙烯調(diào)控，感病品種的AFS1基因表達(dá)水平更高。 本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)， 雖然冷藏過程中兩個(gè)品種果皮的α-法尼烯含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢（圖5A），但富士AFS1基因表達(dá)量和α-法尼烯含量的峰值都比新紅星推遲1 個(gè)月； 新紅星果皮共軛三烯和MHO 含量在冷藏過程中均保持上升趨勢， 而富士共軛三烯和MHO 含量一直低于新紅星（圖5）， 這可能與富士蘋果較強(qiáng)的抗病性能有關(guān)。

虎皮病的發(fā)生與果實(shí)抗氧化能力有關(guān)，富士和新紅星都是紅色果皮品種， 且果皮中都富含類黃酮等多酚類物質(zhì)， 它們對虎皮病的抗病性差異是否與這些物質(zhì)含量有關(guān)， 目前未見報(bào)道。 伴隨α-法尼烯大量氧化， 細(xì)胞膜透性增大， 果皮細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性及多酚氧化酶（PPO）與底物的區(qū)域分布遭到破壞， 最終導(dǎo)致虎皮病發(fā)生。 索江濤等研究發(fā)現(xiàn)， 1-MCP 處理顯著抑制了紅富士蘋果乙烯形成， 并降低了多酚氧化酶（PPO）活性，進(jìn)而保持了多酚等抗氧化物質(zhì)的含量， 最終降低了蘋果虎皮病發(fā)病率。 蘋果富含多酚類物質(zhì)， 其中黃酮類和花青素類物質(zhì)是其重要組成， 具有較強(qiáng)的抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化活性， 并能延緩果實(shí)衰老褐變。本研究發(fā)現(xiàn)， 整體上富士和新紅星的類黃酮含量沒有顯著差異（圖6A）； 富士前期花青苷比新紅星還要低一些（圖6B），可能與新紅星乙烯和呼吸高峰更早出現(xiàn)有關(guān)。 宋哲等人發(fā)現(xiàn)， 伴隨著蘋果果實(shí)的衰老， 花青苷迅速降解； 楊小幸等研究發(fā)現(xiàn)，DPPH 自由基清除能力減弱可能是酚類物質(zhì)減少的重要原因。 所以， 本研究中富士DPPH 自由基清除能力高于新紅星（圖6D）。富士蘋果的抗病性與它總的抗氧化能力高有關(guān)。

4 結(jié)論

新紅星蘋果的感病性與其乙烯釋放速率高有關(guān)。 富士對虎皮病的抗性與其低乙烯釋放速率和低α-法尼烯及代謝產(chǎn)物含量有關(guān)，尤其是共軛三烯、MHO 一直維持低水平， 并且在冷藏過程中保持了較高的抗氧化能力。

針對不同蘋果品種的果實(shí)虎皮病與乙烯釋放速率、抗氧化能力和α-法尼烯及代謝產(chǎn)物的相關(guān)性，仍需進(jìn)一步研究。