雷公藤紅素苷對(duì)子癇前期大鼠肝腎細(xì)胞凋亡的影響及其保護(hù)作用

門(mén)少杰，劉旭

1. 夏邑華光精神病醫(yī)院，河南 商丘 476400；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453002

子癇前期（PE）是一種以胎盤(pán)缺血、外周血管損傷和急性肝腎損傷等功能障礙為特征的異質(zhì)性多器官疾病[1]。PE 引起的肝腎損傷可導(dǎo)致患者預(yù)后不良，探索同時(shí)具有PE 治療作用及肝腎保護(hù)功能的藥物對(duì)控制PE 病情具有重要意義。雷公藤紅素苷（Cel）是一種從雷公藤根皮中提取的天然三萜類化合物[2]。Cel 通過(guò)抑制炎癥和氧化應(yīng)激來(lái)緩解高血壓[3]，還可抑制原代人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中熱休克蛋白90β 的表達(dá)，并抑制環(huán)氧合酶-2（COX-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)[4]。此外，負(fù)載Cel 的納米膠束能夠減少巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌[5]。這些研究提示Cel有可能成為治療PE 的新型藥物。另外，已有文獻(xiàn)報(bào)道了Cel 的肝腎保護(hù)作用，例如，Cel 能夠減輕二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化[6]，通過(guò)抑制IgA 腎病大鼠腎組織中Notch 信號(hào)通路減少蛋白尿的生成[7]。本研究觀察Cel 對(duì)PE 大鼠肝腎細(xì)胞凋亡的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50 只7～9 周齡雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量200～240 g，25 只7～9 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量240～300 g，均購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證：SCXK（吉）2020-0002。飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房12 h/12 h 的光暗周期下，給大鼠提供標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。將雌性和雄性大鼠按照2∶1 比例同籠飼養(yǎng)，觀察到雌性大鼠陰栓脫落為孕第1 天。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器脂多糖（LPS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Cel 購(gòu)自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司；干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；蛋白抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；流式抗體均購(gòu)自美國(guó)BD 公司；脫氧核糖苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自青旗（上海）生物技術(shù)發(fā)展有限公司。日立7600-020 全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本日立公司；BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3 動(dòng)物分組及給藥方法將50 只妊娠SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照（Control）組、PE 組、PE+低劑量Cel（PE+L-Cel）組、PE+中劑量Cel（PE+M-Cel）組、PE+高劑量Cel（PE+H-Cel）組5 組，每組10 只。參照參考文獻(xiàn)[8]，在孕第14 天時(shí)，將2 mL 的LPS（1 mg/kg）無(wú)菌生理鹽水溶液尾靜脈注射到PE 組、PE+L-Cel組、PE+M-Cel 組和PE+H-Cel 組大鼠體內(nèi)來(lái)誘導(dǎo)PE大鼠模型，Control 組注射2 mL 0.9%氯化鈉溶液。從孕第14 天到孕第20 天，PE+L-Cel 組、PE+M-Cel組和PE+H-Cel 組大鼠每天分別腹腔注射5、10、20 mg/（kg·d）的Cel。Control 組和PE 組注射等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.4 各觀察指標(biāo)檢測(cè)方法①收縮壓（SBP）和尿白蛋白。治療結(jié)束后，使用美國(guó)KENT 公司CODA 系列動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定大鼠SBP。收集大鼠尿液樣本，室溫2 000 ×g離心15 min，取上清液。使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿蛋白濃度。②血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）水平。使用放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）裂解液裂解胎盤(pán)組織并分離總蛋白。通過(guò)蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA）測(cè)定總蛋白。將蛋白在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。使用5%的牛血清白蛋白封閉膜1 h后，將膜與VEGF、MMP-2、MMP-9、β-actin 一抗在4 ℃孵育過(guò)夜。第2 天與羊抗小鼠（IgG-HRP）二抗室溫孵育2 h?？贵w稀釋濃度均為1∶2 000。使用BeyoECL Plus 顯色。以β-actin 作為內(nèi)參。③肝、腎組織細(xì)胞凋亡情況。采用TUNEL 法檢測(cè)各組大鼠肝、腎組織中的凋亡細(xì)胞。大鼠肝、腎組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，按照TUNEL 試劑盒的說(shuō)明對(duì)組織切片進(jìn)行染色。在放大200 倍的光學(xué)顯微鏡下觀察切片，并隨機(jī)選擇5 個(gè)視野計(jì)算TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞百分比。④免疫組織化學(xué)檢測(cè)。斷頭處死大鼠，取肝、腎，用4%多聚甲醛固定，制作肝腎組織切片（4 μm）。用二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇（100%乙醇10 min、95%乙醇10 min、80%乙醇5 min、75%乙醇5 min、蒸餾水5 min）水化。切片在室溫下用0.5%的過(guò)氧化氫（H2O2）處理10 min 封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用冷水清洗。切片與一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。一抗為1∶1 000 稀釋的B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcl-2）、活化半胱胺酸蛋白酶蛋白-9 抗體（Caspase-9）。然后使用鏈霉親和素-生物素化二抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育1 h。在放大400 倍的光學(xué)顯微鏡下觀察切片。⑤血清IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 水平。大鼠眼眶靜脈叢采血，室溫2 000×g離心15 min，分離血清。采用ELISA 法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。⑥外周血輔助性T 細(xì)胞1/輔助性T 細(xì)胞2（Th1/Th2）、輔助性T 細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Th17/Treg）。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th1/Th2、Th17/Treg 比例。檢測(cè)方法參照參考文獻(xiàn)[9]。所用抗體包括CD3（Percp）、CD4（FITC）、CD8（APC）、CD25（APC）、FoxP3（PE）、Th17（PE）、IFN-γ（FITC）、IL-4（PE）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用單因素方差分析及LSD 事后檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠SBP、尿白蛋白水平比較見(jiàn)圖1。與Control 組比較，PE 組SBP、尿白蛋白水平均升高（P＜0.05）；與PE 組比較，PE+L-Cel 組、PE+MCel 組、PE+H-Cel 組SBP、尿白蛋白水平均降低（P＜0.05）；與PE+L-Cel 組比較，PE+M-Cel 組、PE+H-Cel 組SBP、尿白蛋白水平均降低（P＜0.05）；與PE+M-Cel 組比較，PE+H-Cel 組SBP、尿白蛋白水平降低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠SBP、尿白蛋白水平比較

2.2 各組大鼠胎盤(pán)組織VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較見(jiàn)圖2。與Control 組比較，PE組胎盤(pán)組織VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；與PE 組比較，PE+L-Cel 組、PE+M-Cel 組、PE+H-Cel 組胎盤(pán)組織VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與PE+LCel 組比較，PE+M-Cel 組、PE+H-Cel 組胎盤(pán)組織VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與PE+M-Cel 組比較，PE+H-Cel 組胎盤(pán)組織VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠胎盤(pán)組織VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平比較

2.3 各組大鼠肝、腎組織細(xì)胞凋亡比較見(jiàn)圖3、圖4。TUNEL 染色顯示，與Control 組比較，PE 組肝、腎組織細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.05）。與PE 組比較，PE+L-Cel 組、PE+M-Cel 組、PE+H-Cel 組肝、腎組織細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05）；與PE+LCel 組比較，PE+M-Cel 組、PE+H-Cel 組肝、腎組織細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05）；與PE+M-Cel 組比較，PE+H-Cel 組肝、腎組織細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠肝、腎組織細(xì)胞凋亡比較（×200）

圖4 各組大鼠肝、腎組織細(xì)胞凋亡比較

2.4 各組大鼠肝、腎組織Caspase-9、Bcl-2 相對(duì)表達(dá)水平比較見(jiàn)表1、圖5。免疫組織化學(xué)染色顯示，與Control 組比較，PE 組肝、腎組織Caspase-9表達(dá)均升高（P＜0.05）、Bcl-2 表達(dá)均降低（P＜0.05）；與PE 組比較，PE+L-Cel 組、PE+M-Cel 組、PE+H-Cel 組Caspase-9 表達(dá)均降低（P＜0.05），Bcl-2 表達(dá)均逐漸升高（P＜0.05）；與PE+L-Cel 組比較，PE+M-Cel 組、PE+H-Cel 組肝、腎組織Caspase-9 表達(dá)均升高（P＜0.05），Bcl-2 表達(dá)均降低（P＜0.05）；與PE+M-Cel 組比較，PE+H-Cel 組肝、腎組織Caspase-9 表達(dá)均升高（P＜0.05），Bcl-2表達(dá)均降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠肝、腎組織Caspase-9、Bcl-2 相對(duì)表達(dá)水平比較

圖5 各組大鼠肝、腎組織Caspase-9、Bcl-2 表達(dá)比較（×400）

2.5 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 水平比較見(jiàn)圖6。與Control 組比較，PE 組血清IFNγ、IL-17 水平均升高（P＜0.05），IL-4、IL-10 水平均降低（P＜0.05）；與PE 組比較，PE+L-Cel 組、PE+M-Cel 組、PE+H-Cel 組血清IFN-γ、IL-17 水平均降低（P＜0.05），IL-4、IL-10 水平均升高（P＜0.05）；與PE+L-Cel 組比較，PE+M-Cel 組、PE+HCel 組血清IFN-γ、IL-17 水平均降低（P＜0.05），IL-4、IL-10 水平均升高（P＜0.05）；與PE+M-Cel 組比較，PE+H-Cel 組血清IFN-γ、IL-17 水平均降低（P＜0.05），IL-4、IL-10 水平均升高（P＜0.05）。

圖6 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 水平比較

2.6 各組大鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg 占CD4+百分比比較見(jiàn)圖7。與Control 組比較，PE 組外周血Th1、Th17 占CD4+的百分比均升高（P＜0.05），Th2、Treg 占CD4+的百分比均降低（P＜0.05）。與PE 組比較，PE+L-Cel 組、PE+M-Cel 組、PE+H-Cel 組外周血Th1、Th17 占CD4+的百分比均降低（P＜0.05），Th2、Treg 占CD4+的百分比均升高（P＜0.05）。與PE+L-Cel 組比較，PE+M-Cel 組、PE+H-Cel 組外周血Th1、Th17 占CD4+的百分比均降低（P＜0.05），Th2、Treg 占CD4+的百分比均升高（P＜0.05）。與PE+M-Cel 組比較，PE+H-Cel 組外周血Th1、Th17 占CD4+的百分比降低（P＜0.05），Th2、Treg 占CD4+的百分比升高（P＜0.05）。

圖7 各組大鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg 占CD4+百分比比較

3 討論

PE 是妊娠期最常見(jiàn)、最危險(xiǎn)、最不可預(yù)測(cè)的并發(fā)癥之一。由于PE 的確切機(jī)制尚不清楚，PE 可增加產(chǎn)婦和嬰兒的死亡率，并且增加相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率[10]，如胎盤(pán)早剝、新生兒腦室間出血、缺氧缺血性腦病等[11]。研究報(bào)道，Cel 可降低L-NAME 誘導(dǎo)的PE 大鼠總尿蛋白、尿量和血壓，從而減輕PE 癥狀[12]。本研究中，Cel 以劑量依賴性方式降低了PE大鼠SBP 和尿白蛋白，證實(shí)了Cel 在治療PE 中的潛在應(yīng)用價(jià)值。此外，本研究還表明Cel 以劑量依賴性方式上調(diào)了PE 大鼠胎盤(pán)組織中VEGF、MMP-2和MMP-9 的蛋白表達(dá)水平。VEGF 是重要的血管生成因子，PE 患者胎盤(pán)組織中VEGF 水平明顯降低[13]。MMP-2 和MMP-9 在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲中起著重要的作用，可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲[14]。本研究結(jié)果提示Cel 促進(jìn)了PE 大鼠胎盤(pán)血管生成和滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲。

PE 可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，從而引起肝、腎及其他器官功能障礙[15-16]。PE 引起的多種類型的細(xì)胞凋亡與發(fā)病期間伴隨的全身異常的炎癥反應(yīng)有關(guān)，PE發(fā)生后白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的激活，免疫系統(tǒng)失調(diào)，炎癥加劇，從而引起細(xì)胞凋亡[17]。因此，抗炎治療是PE 的一種有效治療措施。例如，抗炎治療可使高血壓大鼠在妊娠期的血壓和尿蛋白排泄恢復(fù)正常[18]。過(guò)往研究已經(jīng)報(bào)道了Cel 的抗炎作用[4]，Cel 可通過(guò)誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1 的表達(dá)減輕高血壓引起的血管平滑肌細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激，從而降低高血壓大鼠的SBP和舒張壓，改善胰島素敏感性[3]。本研究發(fā)現(xiàn)Cel 以劑量依賴性方式減輕了PE 大鼠肝、腎組織細(xì)胞凋亡，說(shuō)明Cel 對(duì)肝、腎具有保護(hù)作用，而這種作用可能與其抗炎特性有關(guān)。

適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和先天免疫系統(tǒng)在PE 的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[19]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究報(bào)道了PE 中不同T 淋巴細(xì)胞亞型的紊亂及T 細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的失調(diào)[20]。淋巴細(xì)胞是蛻膜化子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)的最大的常駐免疫細(xì)胞群，包括子宮或蛻膜自然殺傷（NK）細(xì)胞和T 細(xì)胞亞群，即TH1、Th2、Treg 和Th17 細(xì)胞。T 淋巴細(xì)胞位于蛻膜間質(zhì)和腺上皮，在建立良好的妊娠環(huán)境中起著關(guān)鍵作用[21]。Th1/Th2 和Th17/Treg 細(xì)胞平衡在建立有利妊娠環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用。在圍著床期，Th1 反應(yīng)參與免疫監(jiān)視，避免滋養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)度侵襲[22]。胎盤(pán)植入后，Th2 轉(zhuǎn)化對(duì)于正常胚胎的發(fā)育、抑制Th17 和Th1 細(xì)胞是必不可少的[23]。此外，Treg 細(xì)胞是免疫耐受和胚胎植入的主要因素，外周和蛻膜Treg 細(xì)胞在正常妊娠期間增加[24]。Th1 細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-α 等細(xì)胞因子[19]。Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4 細(xì)胞因子并介導(dǎo)體液免疫[20]。IL-17 細(xì)胞主要分泌Th17 細(xì)胞因子，Treg細(xì)胞主要分泌IL-10 細(xì)胞因子[18]。大量的文獻(xiàn)表明Th2 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可減輕炎癥。IL-17 是中性粒細(xì)胞炎癥的關(guān)鍵啟動(dòng)子，可募集Th17 細(xì)胞并激活Th1 細(xì)胞[22]。IL-10 通過(guò)抑制核因子κB 的表達(dá)來(lái)抑制Th1 細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α 和IFN-γ[23]。IL-10 可降低妊娠期高血壓大鼠血壓和尿蛋白[18]。因此，抑制IFN-γ和IL-17 的表達(dá)并增加IL-4 和IL-10 的表達(dá)可抑制炎癥。本研究結(jié)果顯示，Cel 降低了PE 大鼠血清IFN-γ、IL-17 水平，升高了IL-4、IL-10 水平。并且降低了PE 大鼠外周血Th1 和Th17 占CD4+的百分比，升高了Th2 和Treg 占CD4+的百分比。提示Cel可能通過(guò)促進(jìn)PE 大鼠Th1 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞漂移和Th17 細(xì)胞向Treg 細(xì)胞漂移，從而抑制了Th1/Th2 及Th17/Treg 細(xì)胞失衡，進(jìn)而改善了PE 大鼠體內(nèi)免疫狀態(tài)。

綜上所述，本研究表明Cel 可減輕PE 大鼠癥狀并抑制肝腎細(xì)胞凋亡，Cel 可能通過(guò)糾正PE 大鼠Th1/Th2 及Th17/Treg 細(xì)胞失衡來(lái)發(fā)揮治療作用。