面包乳桿菌ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌群體感應(yīng)的淬滅作用

呂欣然，溫 馨，王揚(yáng)蕊，白鳳翎，崔方超，檀茜倩，勵(lì)建榮，2*，郭曉華

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 遼寧錦州121013 2 大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連116034 3 山東美佳集團(tuán)有限公司 山東日照 276800）

熒光假單胞菌（Psdeuomnoda fluoerncnet）作為水產(chǎn)品中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，其自身分泌的蛋白酶、脂肪酶、嗜鐵素、生物膜等因子受N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯（N-Acyl-homoserine lactones，AHLs）介導(dǎo)的LuxI/R 型QS 系統(tǒng)調(diào)控[1-2]。常通過(guò)使用抗生素等化學(xué)制劑控制腐敗微生物對(duì)水產(chǎn)品的污染，然而長(zhǎng)期使用不僅使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，還危害人體健康。以細(xì)菌QS 系統(tǒng)為作用靶點(diǎn)，干擾其相關(guān)致腐因子的表達(dá)，為控制由熒光假單胞菌引發(fā)的食品腐敗提供新策略。

群體感應(yīng)淬滅（Quorum quenching，QQ）是以QS 系統(tǒng)為靶點(diǎn)，通過(guò)抑制AHLs 合成、干擾AHLs與受體蛋白結(jié)合或酶促降解AHLs 等途徑淬滅細(xì)菌群體感應(yīng)效應(yīng)的一種方式[3]。其中，降解AHLs信號(hào)分子，使其濃度低于臨界值，抑制細(xì)菌相關(guān)毒力因子表達(dá)的酶稱(chēng)之為群體感應(yīng)淬滅酶（Quorum quenching enzymes，QQE）。其具有專(zhuān)一性強(qiáng)、催化效率高、安全無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，是目前最為有效的群體感應(yīng)淬滅途徑。依據(jù)結(jié)構(gòu)特性，QQE 主要包括AHLs 內(nèi)酯酶、AHLs 酰基轉(zhuǎn)移酶、AHLs 氧化還原酶[4]，根據(jù)來(lái)源可分為植物源、動(dòng)物源、微生物源[5-7]。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作為國(guó)際公認(rèn)的安全菌株，已被廣泛應(yīng)用在食品工業(yè)領(lǐng)域。研究表明，乳酸菌來(lái)源的苯乳酸、細(xì)菌素和青霉素酰化酶等代謝產(chǎn)物具有良好的群體感應(yīng)淬滅活性[8-10]，而同種或不同種微生物分泌的淬滅酶結(jié)構(gòu)和催化特性的差異性，導(dǎo)致其淬滅機(jī)制也存在一定差異。本課題組前期獲得的面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum）ZHG2-1 具有QQ 活性，對(duì)C4-HSL、C8-HSL 和3-oxo-C12-HSL 等AHLs 信號(hào)分子均具有較強(qiáng)的降解作用，該活性物質(zhì)初步鑒定為AHLs-?；D(zhuǎn)移酶或氧化-還原酶[11]，然而，其對(duì)熒光假單胞菌群體感應(yīng)的淬滅機(jī)制尚不清楚。

鑒于上述問(wèn)題，本文以面包乳桿菌ZHG2-1為研究對(duì)象，利用雙層瓊脂擴(kuò)散法分析菌株ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌AHLs 的降解效果。通過(guò)測(cè)定生物膜、胞外蛋白酶、胞外多糖、生物胺等腐敗指標(biāo)，探究菌株ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌的細(xì)胞表型淬滅效應(yīng)。采用qRT-PCR 技術(shù)研究菌株ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌致腐因子基因水平的影響，闡明其淬滅機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)水產(chǎn)品新型生物防腐劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及培養(yǎng)條件 面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum）ZHG 2-1，分離自遼寧阜新彰武腌制酸黃瓜。熒光假單胞菌（Psdeuomnoda fluoerncnet）PF08，分離自腐敗大菱鲆。

紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026 為紫色桿菌ATCC 31532 的mini-Tn5 突變體，菌株自身不產(chǎn)生AHLs，僅當(dāng)外源AHLs 存在時(shí)，可產(chǎn)生特征性紫色菌素，檢測(cè)?；鶄?cè)鏈長(zhǎng)度為C4～C8 的信號(hào)分子。以上菌種均于本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 MRS 肉湯、LB 肉湯、LB 培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乙酸乙酯（分析純級(jí)），福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；AO/EB 雙熒光染色試劑盒，北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Imark 酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；MS105UD 電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；SS-4800 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；徠卡激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)徠卡儀器有限公司；Bioscerrn C 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司5804R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；DL-CJ-2N 超級(jí)潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-25 生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Multifuge1L-R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Heraeus 公司；SCIENTZ-10N/A 冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器GI80DS，致微（廈門(mén)）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株ZHG2-1 上清液與熒光假單胞菌AHLs 的制備

1.3.1.1 菌株ZHG2-1 上清液粗提物的制備 參照Lv 等[12]方法，將面包乳桿菌ZHG2-1 以2%的接種量在MRS 肉湯中活化至第3 代，離心過(guò)濾得乳酸菌無(wú)細(xì)胞上清液（Cell free supernatants，CFS），用乙酸乙酯萃取CFS 活性成分，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空冷凍干燥制成粉末狀固體，置于-80℃冰箱備用。

1.3.1.2 熒光假單胞菌AHLs 粗提物的制備 將熒光假單胞菌在LB 肉湯中培養(yǎng)，傳代2 次后于30 ℃培養(yǎng)16 h，離心過(guò)濾后用含0.01%冰醋酸的乙酸乙酯萃取，50 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以消除有機(jī)溶劑并用70%甲醇溶解。

1.3.2 菌株ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌AHLs 淬滅活性驗(yàn)證 參照Cui 等[11]方法制備AHLs 檢測(cè)平板，牛津杯打孔。將菌株ZHG2-1 CFS 調(diào)至中性，加入10 μL 熒光假單胞菌AHLs 粗提物，30 ℃培養(yǎng)24 h，離心后取上清，調(diào)pH 值至中性，取180 μL 加入打好的孔中，30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.3 熒光假單胞菌與紫色桿菌CV026 的最小抑菌濃度與亞抑制質(zhì)量濃度 將菌懸液濃度為106CFU/mL 的熒光假單胞菌與紫色桿菌CV026（100 μL）分別加入96 孔板中，依次加入10 μL 上清液粗提物至終質(zhì)量濃度分別為0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0 mg/mL，以不添加提取物的LB 肉湯作為陰性對(duì)照，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。在波長(zhǎng)595 nm 處每隔2 h 測(cè)OD 值。

1.3.4 菌株ZHG2-1 上清液粗提物對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)生物膜量的影響

1.3.4.1 生物膜抑制的定量分析 取200 μL 熒光假單胞菌懸液到96 孔板中，添加菌株ZHG2-1粗提物至終質(zhì)量濃度為1.0，2.0，3.0 mg/mL，以不添加提取物的LB 肉湯作為陰性對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)12 h，吸去多余懸浮液，用無(wú)菌PBS 洗滌，參照Shikha 等[9]方法結(jié)晶紫染色定量檢測(cè)生物模量。同時(shí)，參考Cui 等[11]方法測(cè)定浮游細(xì)胞存活率。

1.3.4.2 生物膜清除的定量分析 在96 孔板中加入熒光假單胞菌培養(yǎng)物（106CFU/mL），30 ℃培養(yǎng)12 h，移除懸浮液，PBS 洗滌后，向孔板中添加不同亞抑制質(zhì)量濃度的菌株ZHG2-1 粗提物，以不添加粗提物的LB 肉湯作為陰性對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)24 h，按上述方法定量檢測(cè)生物膜殘留量和浮游細(xì)胞存活率。

1.3.5 菌株ZHG2-1 上清液粗提物對(duì)熒光假單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響 在24 孔板中放入無(wú)菌硅片（1 cm×1 cm），取1 mL 熒光假單胞菌菌液浸沒(méi)，樣品處理如1.3.4 節(jié)方法。PBS 洗滌硅片，2.5%戊二醛固定12 h，無(wú)菌水洗滌3 次，40%，70%，90%，100%乙醇依次脫水處理15 min，待硅片干燥后噴金，掃描電鏡（SEM）觀察生物膜結(jié)構(gòu)。

1.3.6 菌株ZHG2-1 上清液粗提物對(duì)熒光假單胞菌致腐因子的影響

1.3.6.1 胞外多糖 參照Mohammed 等[13]方法，將熒光假單胞菌與不同亞抑制質(zhì)量濃度的菌株ZHG2-1 粗提物30 ℃共培養(yǎng)16 h，離心，將沉淀重懸于0.85% NaCl 溶液中，離心30 min，將上清液與冷乙醇按體積比1∶3 混合，4 ℃過(guò)夜沉淀，移除上清液后，苯酚硫酸法定量檢測(cè)胞外多糖含量。

1.3.6.2 胞外蛋白酶 參照Vijayaraghavan 等[14]方法制備脫脂牛奶平板，牛津杯打孔。將不同質(zhì)量濃度的菌株ZHG2-1 粗提物與熒光假單胞菌30 ℃共培養(yǎng)24 h，離心過(guò)濾后取180 μL 上清液加入打好的孔中，30 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量孔徑周?chē)该魅Φ拇笮?，?jì)算抑制率。

1.3.6.3 生物胺 根據(jù)張黎明等[15]的方法制備生物胺檢測(cè)培養(yǎng)基，牛津杯打孔。取180 μL 菌株ZHG2-1 粗提物與熒光假單胞菌共培養(yǎng)物上清液加入孔中，30 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量孔徑周?chē){(lán)紫色圈的大小，計(jì)算抑制率。

1.3.6.4 脂肪酶 根據(jù)Leelatulasi 等[16]方法并稍作修改。50 mL 沸水將3 mL 三丁甘油酸酯和1 g聚乙烯醇-2000 混合乳化，調(diào)pH 值至中性，取4 mL 乳化液與100 mL LB 瓊脂混合，制備脂肪酶瓊脂平板。取180 μL 共培養(yǎng)物上清液加入孔中，30℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量孔徑周?chē)该魅Φ拇笮?，?jì)算抑制率。

1.3.7 菌株ZHG2-1 上清液粗提物對(duì)熒光假單胞菌QS、生物膜及致腐基因表達(dá)的影響 將過(guò)夜活化的熒光假單胞菌菌液稀釋至106CFU/mL，加入3.0 mg/mL 菌株ZHG2-1 粗提物，30 ℃培養(yǎng)24 h，離心，棄上清，無(wú)菌PBS（pH 7.2）洗滌沉淀，再次離心收集菌體。將菌體送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心進(jìn)行qRT-PCR 測(cè)試。qRT-PCR 用Gene 9600 定量PCR 儀進(jìn)行，引物序列見(jiàn)表1，熒光假單胞菌的16S rRNA 為內(nèi)參基因，引物由上海Sangon Biotech 公司設(shè)計(jì)并合成。

表1 熒光假單胞菌qRT-PCR 引物序列Table 1 The qRT-PCR primer sequences of Pseudomonas fluorescens

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行，用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，Origin 8.5 軟件進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌AHLs 的降解活性

采用雙層瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)面包乳桿菌ZHG2-1 CFS 對(duì)熒光假單胞菌AHLs 的降解活性。由圖1 可知，菌株ZHG2-1 CFS 對(duì)熒光假單胞菌AHLs 的降解活性為100%。

圖1 菌株ZHG2-1 CFS 對(duì)熒光假單胞菌AHLs淬滅活性Fig.1 The quenching activity of strain ZHG2-1 CFS on Pseudomonas fluorescens AHLs

2.2 熒光假單胞菌和紫色桿菌CV026 的最小抑菌濃度與亞抑制質(zhì)量濃度

面包乳桿菌ZHG2-1 上清液粗提物對(duì)熒光假單胞菌和紫色桿菌的最小抑菌濃度分別為8.0 mg/mL 和4.0 mg/mL。為確認(rèn)菌株ZHG2-1 粗提物的降解活性是出自群體感應(yīng)淬滅作用，還是抑菌作用，研究不同亞抑制質(zhì)量濃度對(duì)熒光假單胞菌和紫色桿菌生長(zhǎng)的影響。由圖2 可知，1.0，2.0，3.0 mg/mL 的菌株ZHG2-1 粗提物對(duì)熒光假單胞菌和紫色桿菌的生長(zhǎng)均無(wú)影響，選取這3 個(gè)質(zhì)量濃度作后續(xù)研究。

圖2 亞抑制質(zhì)量濃度下菌株ZHG2-1 粗提物對(duì)熒光假單胞菌（a）和紫色桿菌（b）生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of strain ZHG2-1 crude extract on the growth of Pseudomonas fluorescens（a）and Chromobacterium violaceum（b）at sub-inhibitory mass concentrations

2.3 面包乳桿菌ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)生物膜量的影響

生物膜指黏附在物體表面的細(xì)菌與其分泌的胞外基質(zhì)聚集形成的群落組織，其對(duì)外界環(huán)境變化的抵抗力遠(yuǎn)高于浮游細(xì)胞[17]。在食品加工中，細(xì)菌能快速附著在設(shè)備及食品表面形成生物膜，并難以清除，給食品工業(yè)帶來(lái)嚴(yán)峻考驗(yàn)[18]。圖3 所示，在不影響熒光假單胞菌生長(zhǎng)的前提下，質(zhì)量濃度為1.0，2.0，3.0 mg/mL 的菌株ZHG2-1 粗提物對(duì)熒光假單胞菌生物膜抑制率分別為（9.66±2.92）%，（20.46±3.72）%，（31.32±3.39）%，清除率分別為（28.62±3.20）%，（37.07±3.82）%，（62.82±5.84）%，且呈質(zhì)量濃度依賴(lài)性。Shikha 等[9]研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）上清液對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制率為35.01%，對(duì)成熟生物膜的清除率約為75%，本研究結(jié)果與其相近。上述結(jié)果說(shuō)明菌株ZHG2-1 粗提物通過(guò)群體感應(yīng)有效抑制和清除熒光假單胞菌生物膜。

圖3 菌株ZHG2-1 粗提物對(duì)熒光假單胞菌生物膜量及浮游細(xì)胞數(shù)目的影響Fig.3 The effects of strain ZHG2-1 crude extract on the Pseudomonas fluorescens biofilm biomass and number of planktonic cells

2.4 面包乳桿菌ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響

利用掃描電鏡觀察亞抑制質(zhì)量濃度菌株ZHG2-1 粗提物對(duì)熒光假單胞菌生物膜二維結(jié)構(gòu)的影響，如圖4 所示，未經(jīng)處理的熒光假單胞菌生物膜厚實(shí)緊密，隨著菌株ZHG2-1 粗提物質(zhì)量濃度的不斷增大，致密的膜結(jié)構(gòu)逐漸被解體。當(dāng)用3.0 mg/mL 的菌株ZHG2-1 粗提物處理時(shí)，細(xì)菌胞外聚合物顯著減少，細(xì)菌菌落處于分散狀態(tài)。結(jié)果表明，菌株ZHG2-1 粗提物可通過(guò)抑制熒光假單胞菌胞外基質(zhì)的形成，減弱細(xì)菌生物膜形成能力。圖4b 顯示經(jīng)菌株ZHG2-1 粗提取處理、預(yù)先形成生物膜后，生物膜結(jié)構(gòu)疏松分散，抑制效果沒(méi)有清除效果顯著，表明菌株ZHG2-1 粗提物可破壞熒光假單胞菌成熟生物膜結(jié)構(gòu)。Lv 等[12]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CY 1-1 粗提物處理的溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）數(shù)量減少且黏附性差，3.0 mg/mL 粗提物處理幾乎沒(méi)有形成生物膜。1.0，2.0 mg/mL 和3.0 mg/mL CY1-1 粗提物處理后的成熟生物膜結(jié)構(gòu)稀疏，形成量顯著低于對(duì)照組，本研究結(jié)果與其一致。

圖4 菌株ZHG2-1 粗提物對(duì)熒光假單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of strain ZHG2-1 crude extract on Pseudomonas fluorescens biofilm structure

2.5 面包乳桿菌ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)胞外多糖的影響

胞外多糖是組成細(xì)菌生物膜的重要基質(zhì)，主要由藻酸鹽、生物被膜胞外基質(zhì)多聚糖以及在菌膜和生物被膜的形成過(guò)程中起作用的胞外多糖（Pel）等構(gòu)成[19]。與如圖5a 所示，菌株ZHG2-1 粗提物可顯著降低熒光假單胞菌菌胞外多糖分泌，并顯示質(zhì)量濃度依賴(lài)性。與對(duì)照組相比，當(dāng)用3.0 mg/mL 菌株ZHG2-1 粗提物處理細(xì)菌時(shí)，抑制率達(dá)（64.08±4.47）%。Yeon 等[20]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母無(wú)細(xì)胞上清液對(duì)單增李斯特菌胞外多糖的抑制率為65.1%～86.02%，本研究結(jié)果與其相似。

圖5 菌株ZHG2-1 粗提物對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)胞外多糖（a）、胞外蛋白酶（b）、生物胺（c）、脂肪酶（d）影響Fig.5 Effects of strain ZHG2-1 crude extract on Pseudomonas fluorescens production of extracellular polysaccharides（a），extracellular proteases（b），biogenic amines（c），and lipases（d）

2.6 面包乳桿菌ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)胞外蛋白酶的影響

熒光假單胞菌可分泌胞外蛋白酶，能將水產(chǎn)品中富含的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、游離氨基酸等成分降解，產(chǎn)生致腐代謝物，使水產(chǎn)品喪失原有風(fēng)味和品質(zhì)[21]。由圖5b 可知，隨著菌株ZHG2-1 粗提物質(zhì)量濃度的增大，熒光假單胞菌分解蛋白能力不斷被減弱，3.0 mg/mL 時(shí)抑制率達(dá)100%，結(jié)果表明，菌株ZHG2-1 上清液提取物能顯著抑制熒光假單胞菌的胞外蛋白酶的產(chǎn)生。Chu 等[22]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌上清液對(duì)嗜水氣單胞菌YJ-1 蛋白酶抑制率為83.9%，本研究結(jié)果與其相似。

2.7 面包乳桿菌ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)生物胺影響

生物胺是一類(lèi)低分子堿性含氮化合物，主要由微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶分解游離氨基酸形成。水產(chǎn)品腐敗會(huì)產(chǎn)生大量生物胺，過(guò)量積累會(huì)對(duì)人體造成毒害作用[23]。生物胺平板的原理是細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中游離氨基酸，溴甲酚紫可與產(chǎn)生的堿性生物胺呈藍(lán)紫色反應(yīng)，藍(lán)紫色圈直徑越大，細(xì)菌產(chǎn)生物胺能力越強(qiáng)。如圖5c 所示，對(duì)照組中，熒光假單胞菌有很強(qiáng)的產(chǎn)胺能力，而1.0 mg/mL 菌株ZHG2-1 粗提物可完全抑制生物胺的產(chǎn)生，結(jié)果表明，較低質(zhì)量濃度的菌株ZHG2-1 粗提物可顯著抑制熒光假單胞菌生物胺的產(chǎn)生。馮杰等[24]研究發(fā)現(xiàn)2.0 mg/mL 藍(lán)莓花色苷對(duì)波羅的海希瓦氏菌（Shewanella balticia）腐胺含量的抑制率為94.4%，本研究結(jié)果與其相似。

2.8 面包乳桿菌ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)生脂肪酶的影響

脂肪酶被定義為甘油三酯?；饷?。假單胞菌屬通過(guò)分泌脂肪酶催化甘油三酯分解為脂肪酸、甘油等物質(zhì)，會(huì)改變?nèi)庵破芳∪饨M織，從而使肉制品變黏、變色、產(chǎn)生異味，導(dǎo)致腐敗發(fā)生[25-26]。本文采用三丁酸甘油酯平板透明圈法研究不同質(zhì)量濃度菌株ZHG2-1 粗提物對(duì)熒光假單胞菌脂肪酶活性的影響。如圖5d 所示，1.0 mg/mL 菌株ZHG2-1 粗提物抑制率為（44.09±3.95）%，隨著質(zhì)量濃度的增大，抑制活性可達(dá)100%。Shen 等[27]研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于熒光假單胞菌的AHLs-酰基轉(zhuǎn)移酶PF-1240 可干擾蜂房哈夫尼亞菌脂肪酶的形成，本研究結(jié)果與其相似。

2.9 面包乳桿菌ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌QS、生物膜及致腐基因表達(dá)的影響

為了探究ZHG2-1 的群體感應(yīng)淬滅機(jī)制，通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)ZHG2-1 對(duì)熒光假單胞菌QS、生物膜及致腐基因的表達(dá)水平。在熒光假單胞菌QS 系統(tǒng)中，rhlI 編碼的是AHLs 合成酶，rhlR 編碼的是AHLs 受體蛋白，兩者組成的rhlI/R 系統(tǒng)共同調(diào)控?zé)晒饧賳伟鶴S 現(xiàn)象[28]。aprX 是熒光假單胞菌胞外蛋白酶基因[29]。algA 編碼的藻酸鹽合成蛋白是構(gòu)成胞外多糖的重要組分，不僅利于細(xì)菌的黏附和定殖，在生物膜成熟后期還可以幫助細(xì)菌攝取和利用環(huán)境中的微量元素[30]。orm 是嗜鐵素合成基因，有助于細(xì)菌絡(luò)合食品基質(zhì)中的Fe3+[31]。flgA編碼與生物膜形成以及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的鞭毛合成蛋白[32]。ldcA 編碼賴(lài)氨酸脫羧酶，細(xì)菌通過(guò)酶解食品中的游離氨基酸，進(jìn)而形成生物胺[33]。

由圖6 可知，3.0 mg/mL ZHG2-1 處理下，rhlI和rhlR 的基因表達(dá)被顯著下調(diào)0.93 和0.99，與熒光假單胞菌生物膜及腐敗特性相關(guān)的aprX、algA、orm、flgA、ldcA 等基因的表達(dá)水平也被顯著抑制，分別下調(diào)0.91，0.79，0.90，0.94，0.93，這與前期腐敗表型的結(jié)果一致。Toushik 等[34]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌J.27 和M.21 可以下調(diào)致病菌生物膜形成及QS 相關(guān)基因表達(dá)，qRT-PCR 結(jié)果與其相似。乳酸菌分泌的群體感應(yīng)猝滅活性物質(zhì)可以下調(diào)QS（luxS、lasB、rhlR、pfs）相關(guān)基因的表達(dá)，從而使食源性致病菌致病性下降[35]。由此推測(cè)面包乳桿菌ZHG2-1 可通過(guò)干擾QS 基因表達(dá)，進(jìn)而影響熒光假單胞菌生物膜和腐敗因子的產(chǎn)生。

圖6 3.0 mg/mL 菌株ZHG2-1 粗提物對(duì)熒光假單胞菌QS、生物膜及致腐基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of 3.0 mg/mL strain ZHG2-1 crude extract on the expression of QS，biofilm and putrefaction genes of Pseudomonas fluorescens

3 結(jié)論

面包乳桿菌ZHG2-1 具有較強(qiáng)的群體感應(yīng)淬滅活性，其乙酸乙酯提取物可顯著抑制熒光假單胞菌生物膜及相關(guān)致腐因子的產(chǎn)生。菌株ZHG2-1 粗提物對(duì)熒光假單胞菌生物膜形成量及預(yù)先形成的成熟生物模量均有顯著的抑制作用。掃描電鏡進(jìn)一步顯示菌株ZHG2-1 粗提物處理使其生物膜量顯著減少，細(xì)菌菌落處于分散狀態(tài)。在亞抑制質(zhì)量濃度的菌株ZHG2-1 粗提物處理下，熒光假單胞菌胞外多糖、生物胺、蛋白酶、脂肪酶等致腐因子均被顯著抑制，與細(xì)菌QS、生物膜、腐敗因子相關(guān)的基因表達(dá)水平也被顯著下調(diào)。綜上所述，面包乳桿菌ZHG2-1 作為天然安全的生物防腐劑，通過(guò)干擾細(xì)菌QS 系統(tǒng)，調(diào)控生物膜和致腐基因表達(dá)，進(jìn)而影響生物膜及相關(guān)腐敗因子的產(chǎn)生，其具體機(jī)制可通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步研究。