• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用低聚半乳糖雙歧桿菌的篩選及益生特性研究

    2023-12-16 02:55:02肖利紅何明雪徐梓赫張峰瑞張莉麗韓建春
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2023年11期
    關(guān)鍵詞:膽鹽菌體雙歧

    孫 慧,肖利紅,何明雪,徐梓赫,譚 澤,張峰瑞,張莉麗*,韓建春

    (1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150030 2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030 3 黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院 哈爾濱150028)

    低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)是人乳中含量較多的低聚糖[1],由半乳糖殘基和末端葡萄糖通過(guò)β-糖苷鍵連接而成的低聚糖。目前的商業(yè)GOS 是含有大量單糖和雙糖的混合低聚糖;不同供應(yīng)商的GOS 的連接類型和聚合程度差異很大[2]。GOS 具有優(yōu)良的益生功能,抵抗近端胃腸道消化的能力極強(qiáng),能夠促進(jìn)雙歧桿菌的定殖。人體攝入一定量的GOS 可以提高腸道吸收鎂和鐵元素的能力,在改善兒童缺鐵性貧血方面具有積極作用[3]。此外,GOS 還具有降低齲齒發(fā)生率、促進(jìn)脂質(zhì)代謝、保護(hù)肝臟、預(yù)防結(jié)腸癌等功能[4-5]。

    大部分雙歧桿菌(Bifidobacterium)是從嬰兒糞便中分離得到的,它是一種對(duì)人體腸道極其重要的微生物[6]。雙歧桿菌不僅可以促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育,抑制腫瘤和衰老,還可以調(diào)節(jié)腸道動(dòng)態(tài)平衡,促進(jìn)腸道屏障的完整性,減輕結(jié)腸炎癥狀,增強(qiáng)機(jī)體免疫力[7-11]。雙歧桿菌可以分解各種飲食來(lái)源和宿主腸道內(nèi)的碳水化合物,從而顯著促進(jìn)宿主的新陳代謝,這一特征不僅保證其在腸道中的定殖,而且通過(guò)交叉喂養(yǎng)策略為宿主和其它腸道微生物提供營(yíng)養(yǎng)[12-13]。

    雙歧桿菌發(fā)酵GOS 的能力依賴于GOS 的聚合度和糖苷鍵類型。有研究證明雙歧桿菌更加傾向于分解利用高聚合度的GOS[14]。Taskwan 等[15]分析雙歧桿菌與乳酸菌利用的GOS 的情況,發(fā)現(xiàn)嬰兒雙歧桿菌M63 和嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697 能夠很好地利用短鏈低聚半乳糖(Short chain galacto-oligosaccharides,SC-GOS)。SC-GOS 可以調(diào)節(jié)腸道微生物組成,增加雙歧桿菌的豐度,改善乳糖不耐受癥[16]。Xiao 等[17]給小鼠喂食含2’-巖藻糖基乳糖、SC-GOS 和長(zhǎng)鏈低聚果糖(Long chain fructo-oligosaccharides,LC-FOS)的混合物,發(fā)現(xiàn)小鼠的腸道微生物區(qū)系組成發(fā)生變化,并且代謝功能和免疫系統(tǒng)功能得到改善。有研究證實(shí)給嬰兒食用SC-GOS、LC-FOS 與短雙歧桿菌M-16V的混合物,可使其糞便變軟,糞便中雙歧桿菌的數(shù)量大大增加[18]。嬰兒食用含有SC-GOS 和LC-FOS的嬰配粉可以降低腸絞痛的發(fā)生率[19],預(yù)防輪狀病毒引起的腹瀉癥狀[20],促進(jìn)嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育[21]。然而,目前有關(guān)利用SC-GOS 的雙歧桿菌研究較少,菌株資源較為有限。

    本課題組從嬰兒糞便中分離得到126 株雙歧桿菌,以SC-GOS 為唯一碳源,從中篩選高效利用SC-GOS 的雙歧桿菌,結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)確定其種屬。評(píng)價(jià)胞外多糖含量、菌體表面蛋白含量、表面疏水性和自聚集能力、模擬胃液耐受能力、膽鹽耐受能力以及上清液抑菌能力,以期獲得高效利用SC-GOS 且益生特性優(yōu)良的雙歧桿菌菌株,為開(kāi)發(fā)出含有GOS 和雙歧桿菌的產(chǎn)品提供菌株資源。

    1 材料與方法

    1.1 微生物菌株

    嬰兒雙歧桿菌M63(Bifidobacterium longum subsp.infantis M63,BI_M63)為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種,嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697(Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697,BI_15697)及大腸桿菌ATCC 25922(Escherichia coli ATCC 25922,EC_25922)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。

    1.2 主要材料與試劑

    低聚半乳糖(GOS)、葡萄糖、乳糖,上海源葉生物科技有限公司;MRS 肉湯培養(yǎng)基,青島海博生物公司;L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine HCl),德國(guó)BioFroxx 公司;豬膽鹽,上海瑞永生物科技有限公司;胃蛋白酶,天津阿爾法生物科技有限公司;DNA 提取試劑盒Omega D4015-01,Omega Bio-Tek 公司

    1.3 主要儀器與設(shè)備

    CMax Plus 酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;SPL-150 生化培養(yǎng)箱,天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司;ZWY-A2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司;TGL-23 離心機(jī),四川蜀科儀器有限公司;BSC-1100-L ⅡA2生物安全柜,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

    1.4 培養(yǎng)基

    還原液配制方法如下:10 g/L 細(xì)菌蛋白胨,5 g/L 氯化鈉,0.5 g/L L-Cysteine HCl,1 mL/L 吐溫80。121 ℃滅菌15 min。RB 瓊脂培養(yǎng)基參照郭春峰[22]的方法配制,118 ℃滅菌15 min。MRSC 培養(yǎng)基配制方法如下:MRS 肉湯培養(yǎng)基添加0.5 g/L LCysteine HCl,加入15 g/L 瓊脂制成MRSC 固體培養(yǎng)基,118 ℃滅菌15 min。無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基配制方法如下:10 g/L 細(xì)菌蛋白胨、5 g/L 酵母浸粉、0.5 g/L L-Cysteine HCl、2 g/L 磷酸氫二鉀、5 g/L無(wú)水乙酸鈉、2 g/L 檸檬酸銨、0.2 g/L 七水硫酸鎂、0.05 g/L 一水硫酸錳、1 mL/L 吐溫80,118 ℃滅菌15 min。

    不同碳源培養(yǎng)基配制方法如下:在上述無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基中分別添加10 g/L 的P-GOS/GOS/葡萄糖/乳糖,118 ℃滅菌15 min。

    1.5 試驗(yàn)方法

    1.5.1 菌株活化 將課題組前期從嬰兒糞便中篩選分離得到的126 株雙歧桿菌菌株活化,即以1%接種量接種至MRSC 液體培養(yǎng)基,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,傳代18 h 備用。

    1.5.2 SC-GOS 的制備 根據(jù)Taksawan 等[15]的方法制備SC-GOS。即將0.15 mg/mL GOS 加樣到已裝填好Sephadex G-25 凝膠(Sigma-Aldrich)的XK 16/100 柱(GE Healthcare Life Science)中,洗脫收集。以乳糖為對(duì)照,應(yīng)用苯酚-硫酸法[23]確定GOS 和乳糖的出峰時(shí)間,收集GOS 和乳糖不重合部分,混合凍干得到SC-GOS,用于后續(xù)試驗(yàn)。利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析確定所得到SC-GOS 中不含有單糖和雙糖。

    1.5.3 可利用SC-GOS 的雙歧桿菌篩選 取1 mL 上述1.5.1 節(jié)菌液離心(10 000×g,5 min,4℃),水洗沉淀并重懸制備菌懸液。分別取200 μL SC-GOS-培養(yǎng)基、GOS-培養(yǎng)基、葡萄糖-培養(yǎng)基、乳糖-培養(yǎng)基至96 孔板中,以1%接種量接種菌懸液,設(shè)置對(duì)照組(無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基、SCGOS-培養(yǎng)基、GOS-培養(yǎng)基、葡萄糖-培養(yǎng)基、乳糖-培養(yǎng)基以及加菌的無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基)。37℃厭氧培養(yǎng),測(cè)定0,24,48 h 的OD595nm值以確定能利用SC-GOS 的雙歧桿菌。

    1.5.4 利用SC-GOS 雙歧桿菌的生物學(xué)鑒定 利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒Omega D4015-01提取細(xì)菌基因組DNA。根據(jù)鄭慧娟等[24]的研究用雙歧桿菌特異引物(Bif164-F:5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’;Pbi R2:5’-GACCATGCACCACCTGTGAA-3’)對(duì)菌株DNA 進(jìn)行擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳,送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序。序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析,確定菌株種屬。

    1.5.5 利用SC-GOS 雙歧桿菌形態(tài)觀察取1 mL 上述1.5.1 節(jié)菌液離心(10 000×g,5 min,4℃),PBS 洗滌,應(yīng)用孫明明等[25]方法處理。即用2.5%戊二醛處理12 h,乙醇系列脫水并冷凍干燥,應(yīng)用鎢燈絲掃描電子顯微鏡S-3400N 觀察菌體形態(tài)。

    1.5.6 益生特性分析

    1.5.6.1 胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定 取10 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心(6 000×g,10 min,4 ℃),將上清液與3倍體積乙醇混合,4 ℃沉淀16 h,用3.5 ku 透析袋透析,每8 h 換1 次水,透析48 h。用Alcian Blue法[26]測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量。

    1.5.6.2 菌體表面蛋白含量測(cè)定 取10 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心(6 000×g,10 min,4 ℃),PBS 洗2次,加入2 mL 5 mol/L LiCl,恒溫振蕩反應(yīng)(200 r/min,1 h,37 ℃),離心(6 000×g,10 min,4 ℃),將上清液與2 倍體積冰丙酮混合,-20 ℃放置過(guò)夜。應(yīng)用Bradford 法[27]測(cè)定菌體表面蛋白含量。

    1.5.6.3 表面疏水性的測(cè)定 取3 mL 上述1.5.1節(jié)菌液,加入等體積二甲苯,恒溫振蕩反應(yīng)(250 r/min,10 min,37 ℃),靜置1 h。吸取水相測(cè)定波長(zhǎng)595 nm 處的吸光度。重復(fù)進(jìn)行3 次,取平均值。疏水性(H)計(jì)算公式:

    式中,A0——0 h 吸光度;A1——不同時(shí)間吸光度。

    1.5.6.4 自聚集能力的測(cè)定 取5 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心(4 500×g,15 min,4 ℃),PBS 緩沖液洗滌并重懸制備菌懸液,測(cè)定0,2,4,6 h 上述菌懸液在595 nm 下的吸光度。自聚集率(A)計(jì)算公式:

    式中,A0——0 h 吸光度;At——不同時(shí)間吸光度。

    1.5.6.5 模擬胃液耐受能力分析 取上述1.5.1節(jié)菌液按體積比1∶5 接種至pH 值為2.0 的人工胃液(胃蛋白酶10 g/L,加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值)中,37 ℃靜置培養(yǎng),分別在0 h、30 min、3 h 時(shí)菌落計(jì)數(shù)。1.5.6.6 膽鹽耐受能力分析 取1 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心(10 000×g,5 min,4 ℃),洗滌菌體2次,重懸于含0.2%豬膽鹽的MRSC 培養(yǎng)液中,37℃厭氧培養(yǎng),分別在0 h 和30 min 時(shí)菌落計(jì)數(shù)。1.5.6.7 無(wú)細(xì)胞上清液抑菌能力測(cè)定 取5 mL上述1.5.1 節(jié)菌液離心(10 000×g,5 min,4 ℃),將上清液通過(guò)0.22 μm 的微孔濾膜。以EC_25922 為指示菌,應(yīng)用牛津杯法[28]評(píng)估各菌株抑菌能力。

    1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 利用SC-GOS 的雙歧桿菌篩選及16S rDNA 鑒定結(jié)果

    Thomson 等[29]發(fā)現(xiàn)BI_15697 在0.5% GOS 上生長(zhǎng)48 h 的OD595nm在0.3 左右,本研究發(fā)現(xiàn)BI_15697 在1% SC-GOS 和GOS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48 h 的OD595nm分別為0.25 和0.63,故以BI_15697和BI_M63 作為對(duì)照菌株,SC-GOS、GOS 作為篩選的標(biāo)志物,共54 株利用SC-GOS 效果優(yōu)于BI_15697。根據(jù)菌落形態(tài)、來(lái)源、鏡檢結(jié)果等,最終選擇7 株利用SC-GOS 能力(OD595nm﹥0.80)遠(yuǎn)強(qiáng)于BI_15697(P<0.05)的雙歧桿菌進(jìn)行16S rDNA鑒定。鑒定結(jié)果顯示,1 株長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種BI_Y46,2 株兩歧雙歧桿菌(BB_Y22、BB_S7),2株假小鏈雙歧桿菌(BP_Y43、BP_YA)以及2 株長(zhǎng)雙歧桿菌(BL_S34、BL_H26)。雙歧桿菌利用SCGOS 情況及發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1,序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 NCBI BLAST 比對(duì)結(jié)果Table 1 NCBI BLAST comparison results

    表2 各試驗(yàn)菌株自聚集能力(,n=3)Table 2 The self-aggregation ability of each experimental strain(,n=3)

    表2 各試驗(yàn)菌株自聚集能力(,n=3)Table 2 The self-aggregation ability of each experimental strain(,n=3)

    注:不同大寫(xiě)字母為同一菌株不同時(shí)間差異顯著(P<0.05),不同小寫(xiě)字母為不同菌株同一時(shí)間差異顯著(P<0.05)。

    圖1 碳源利用情況及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Utilization of carbon sources and phylogenetic tree

    2.2 掃描電鏡觀察雙歧桿菌形態(tài)

    掃描電鏡觀察菌株形態(tài)如圖2 所示,BL_S34(f)和BL_H26(g)呈勺狀;BP_YA(d)中含分叉結(jié)構(gòu);BB_Y22(a)為彎桿狀、BP_Y43(b)和BB_S7(e)為長(zhǎng)桿狀,表面均較為光滑。值得注意的是,BI_Y46(c)具有獨(dú)特的菌毛結(jié)構(gòu),F(xiàn)rancesca 等[30]發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌PRL2010 具有的菌毛結(jié)構(gòu)有助于其黏附,并且具有免疫調(diào)節(jié)活性。短雙歧桿菌UCC2003 中也存在菌毛結(jié)構(gòu),雖然短雙歧桿菌UCC2003 不能單獨(dú)利用3’-唾液酸乳糖或部分巖藻糖,但可以與兩歧雙歧桿菌PRL2010 共培養(yǎng)形成交叉喂養(yǎng),發(fā)揮益生作用[31-32]。因此推斷菌體表面存在菌毛的BI_Y46 可能具有較強(qiáng)黏附能力,同時(shí)具有抑制病原菌等功能,未來(lái)將通過(guò)更多試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

    圖2 SEM 觀察利用SC-GOS 的雙歧桿菌形態(tài)圖Fig.2 Observation of Bifidobacterium morphology using SC-GOS by SEM

    2.3 利用SC-GOS 的雙歧桿菌胞外多糖產(chǎn)量

    利用SC-GOS 的雙歧桿菌胞外多糖產(chǎn)量見(jiàn)圖3。其中,BB_Y22 胞外多糖產(chǎn)量最高,為(0.49±0.04)mg/mL,BI_Y46 以及BL_H26 胞外多糖產(chǎn)量在0.4~0.45 mg/mL 之間。目前針對(duì)高產(chǎn)胞外多糖的雙歧桿菌研究較少,一般胞外多糖產(chǎn)量在幾十到幾百毫克每升不等,蔡靜靜等[33]分離得到雙歧桿菌胞外多糖產(chǎn)量在0.4 mg/mL 左右,故BB_Y22、BP_Y43 屬于產(chǎn)胞外多糖能力較強(qiáng)的菌株,為未來(lái)應(yīng)用提供一定參考。

    圖3 利用SC-GOS 雙歧桿菌的胞外多糖產(chǎn)量(,n=3)Fig.3 The exopolysaccharide yield of Bifidobacteria able to utilize SC-GOS(,n=3)

    2.4 利用SC-GOS 的雙歧桿菌菌體表面蛋白含量分析

    表面蛋白可以延長(zhǎng)益生菌在腸道發(fā)揮作用的時(shí)間[34],本試驗(yàn)測(cè)定菌體表面蛋白,為后續(xù)分析其具體成分或探討其黏附功能及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。各試驗(yàn)菌株菌體表面蛋白含量見(jiàn)圖4。結(jié)果表明,BL_H26 菌體表面蛋白含量較高,為(0.74±0.07)mg/mL(P<0.05),而B(niǎo)B_Y22、BB_S7、BL_S34 含量接近,均在0.35~0.45 mg/mL 范圍;所有菌株表面蛋白含量均超過(guò)BI_15697。目前有關(guān)雙歧桿菌菌體表面蛋白的報(bào)道不多,后續(xù)將對(duì)雙歧桿菌的表面蛋白進(jìn)一步分離,以探討其的功能特性。

    圖4 利用SC-GOS 雙歧桿菌菌體表面蛋白含量(,n=3)Fig.4 Surface protein content of Bifidobacteria able to utilize SC-GOS(,n=3)

    2.5 表面疏水性和自聚集能力

    表面疏水性和自聚集能力與黏附能力密切相關(guān),具有良好黏附能力的益生菌株可以抑制致病菌的侵襲[35]。以BI_M63 和BI_15697 作為對(duì)照,各試驗(yàn)菌株表面疏水性如圖5 所示。結(jié)果表明,BP_Y43、BP_YA 表面疏水性為24.96%,24.90%,與BI_15697、BI_M63 的表面疏水性差異較小,而顯著高于BI_Y46 和BL_H26(P<0.05);其余菌株如BB_Y22、BB_S7、BB_S34 表面疏水能力處于中等水平,均在15%左右,低于陳美瑄[36]篩選得到的雙歧桿菌Probio-M9(50%),可能是由于處理?xiàng)l件不同導(dǎo)致的。

    圖5 各試驗(yàn)菌株表面疏水性(,n=3)Fig.5 Surface hydrophobicity of each experimental strain(,n=3)

    自聚集試驗(yàn)表明,BB_Y22 和BP_Y43 整體自聚集能力較強(qiáng),BL_H26 較弱。在2 h 時(shí),BB_Y22和BP_Y43 的自聚集百分比分別為(51.08±4.02)%和(55.27±5.94)%,明顯高于其它菌株(P<0.05),其余菌株與趙笑笑等[37]的研究基本一致,在10%~30%范圍。在4 h 時(shí),BB_Y22 高達(dá)(73.16±4.06)%,提高了20%左右,同時(shí)BP_Y43、BI_Y46、BP_YA、BB_S7 以及BL_S34 都有顯著提升,而B(niǎo)I_M63 和BI_15697 變化較小,在4 h 時(shí)分別為(27.37±1.89)%和(32.80±3.82)%;在6 h 時(shí),BB_Y22 和BP_Y43 達(dá)到了80%以上,遠(yuǎn)高于其它菌株(P<0.05),同時(shí)超過(guò)陳美瑄[36]篩選得到的雙歧桿菌Probio-M8(58%)和Probio-M9(78%)。

    2.6 利用SC-GOS 的雙歧桿菌模擬胃液耐受情況分析

    雙歧桿菌為到達(dá)并穩(wěn)定地定居在大腸,必須應(yīng)對(duì)胃腸道上發(fā)生的大量氧化、滲透、膽鹽或胃液應(yīng)激挑戰(zhàn)[38]。以BI_M63 和BI_15697 作為對(duì)照,各試驗(yàn)菌株在模擬胃液pH 2.0 時(shí)的耐受情況如表3 所示。處理30 min 與0 h 相比,BI_M63、BP_YA、BB_S7 菌落數(shù)量略微增長(zhǎng)或持平,而其余菌株菌落數(shù)量減少,BI_15697 相對(duì)減少菌落數(shù)量最多(P<0.05);處理3 h 與0 h 相比,BI_15697 的存活率最低(P<0.05),BI_M63 菌落數(shù)量增加,這可能與應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)相關(guān),即受到刺激后產(chǎn)生促進(jìn)自身生長(zhǎng)的物質(zhì)。其余菌株存活率接近100%,說(shuō)明菌株具有較強(qiáng)的胃液耐受性,所有篩選得到菌株在pH 2.0 模擬胃液刺激下的存活率高于胡鵬鈺等[39]分離得到的兩株雙歧桿菌在pH 2.5 模擬胃液刺激下的存活率(73%,75%),較強(qiáng)胃液耐受菌株在今后產(chǎn)品中的應(yīng)用具有廣闊前景。

    表3 菌株在模擬胃液(pH 2.0)耐受情況(,n=3)Table 3 Simulated gastric juice tolerance of srtains at pH 2.0(,n=3)

    表3 菌株在模擬胃液(pH 2.0)耐受情況(,n=3)Table 3 Simulated gastric juice tolerance of srtains at pH 2.0(,n=3)

    注:大寫(xiě)字母不同為同一菌株不同時(shí)間生長(zhǎng)情況差異顯著(P<0.05),小寫(xiě)字母不同為不同菌株同一時(shí)間以及3 h 存活率的差異顯著(P<0.05)。

    2.7 利用SC-GOS 的雙歧桿菌膽鹽耐受情況分析

    潛在的益生菌要有較強(qiáng)的膽鹽耐受能力,各試驗(yàn)菌株在0.2%豬膽鹽處理30 min 時(shí)相較0 h的細(xì)菌數(shù)量減少情況如圖6 所示。結(jié)果表明,在膽鹽存在的條件下,所有菌株存活能力受到不同程度的影響,BP_Y43 的菌落數(shù)量減少5.5×108CFU/mL,其余菌株菌落數(shù)量減少1.0×107CFU/mL 左右(P<0.05)。這個(gè)結(jié)果表明除BP_Y43 外,其余試驗(yàn)菌株膽鹽耐受性強(qiáng)(P<0.05)。黃巧芬[40]分離的長(zhǎng)雙歧桿菌NCU712 在0.3%豬膽鹽刺激下,菌數(shù)減少了3.9×107CFU/mL,可能是由于菌株不同和所用的膽鹽不同,未來(lái)將進(jìn)一步探討0.3%膽鹽下的耐受情況。

    圖6 膽鹽耐受情況(,n=3)Fig.6 Bile salt tolerance(,n=3)

    2.8 利用SC-GOS 的雙歧桿菌上清液抑菌能力評(píng)價(jià)

    Delcaru 等[41]證實(shí)了雙歧桿菌對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生拮抗作用,目前已經(jīng)提出了部分益生菌對(duì)致病菌產(chǎn)生拮抗作用的機(jī)制,如競(jìng)爭(zhēng)排斥、宿主免疫調(diào)節(jié)等[42]。以無(wú)菌的MRSC 培養(yǎng)基作為對(duì)照,各試驗(yàn)菌株的上清液抑制EC_25922 能力見(jiàn)表4。結(jié)果表明,BI_15697 上清液沒(méi)有抑菌效果;BP_Y43、BP_YA 抑菌效果較強(qiáng),抑菌環(huán)直徑分別為10.33 mm 和10.17 mm;BB_Y22、BL_S34、BL_H26 菌 株上清液抑菌能力強(qiáng),抑菌環(huán)直徑在11~12.5 mm 之間,而B(niǎo)I_M63、BI_Y46 以及BB_S7 上清液對(duì)大腸桿菌抑制作用更加明顯,抑菌環(huán)直徑可以達(dá)到12.5 mm 以上。

    表4 菌株上清液對(duì)EC_25922 抑制作用(,n=3)Table 4 Inhibitory effect of strain supernatant on EC_25922(,n=3)

    表4 菌株上清液對(duì)EC_25922 抑制作用(,n=3)Table 4 Inhibitory effect of strain supernatant on EC_25922(,n=3)

    注:牛津杯外徑8 mm。-.沒(méi)有抑菌作用;+.抑菌環(huán)直徑8~9.5 mm;++.抑菌環(huán)直徑9.5~11 mm;+++.抑菌環(huán)直徑11~12.5 mm;++++.抑菌環(huán)直徑>12.5 mm。

    3 結(jié)論

    從糞便樣品中分離得到7 株高效利用SCGOS 的雙歧桿菌,分別為兩歧雙歧桿菌BB_Y22和BB_S7、假小鏈雙歧桿菌BP_Y43 和BP_YA、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種BI_Y46 以及長(zhǎng)雙歧桿菌BL_S34、BL_H26。

    觀察形態(tài)并分析益生特性,發(fā)現(xiàn)BI_Y46 具有菌毛結(jié)構(gòu),蛋白含量較高,為(0.31±0.02)mg/mL,同時(shí)BI_Y46 上清液對(duì)EC_25922 的抑菌效果較強(qiáng)(P<0.05);BB_Y22 的胞外多糖產(chǎn)量最高,為(0.49±0.04)mg/mL,菌體表面蛋白含量為(0.37±0.06)mg/mL,具有較強(qiáng)表面疏水性和自聚集能力,還具有較強(qiáng)的胃液耐受性(P<0.05);BP_Y43 也同樣具有較高胞外多糖產(chǎn)量和高菌體蛋白含量,表面疏水性與自聚集能力也較強(qiáng),同時(shí)具有較強(qiáng)膽鹽耐受能力,有利于其在腸道中的定殖(P<0.05)。

    綜上,本試驗(yàn)分離高效利用短鏈低聚半乳糖的雙歧桿菌中,長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種BI_Y46、兩歧雙歧桿菌BB_Y22 以及假小鏈雙歧桿菌BP_Y43 具有較好的益生潛力,為開(kāi)發(fā)益生菌產(chǎn)品、嬰兒配方乳粉提供一定的參考,也為后續(xù)研究提供菌株資源。

    猜你喜歡
    膽鹽菌體雙歧
    乳桿菌在膽鹽 MRS 培養(yǎng)基中的傳代穩(wěn)定性
    Ligilactobacillus sp.BD7642關(guān)鍵膽鹽水解酶的發(fā)掘
    菌體蛋白精養(yǎng)花鰱高產(chǎn)技術(shù)探析
    東北酸菜發(fā)酵過(guò)程中菌體的分離與鑒定
    提高乳酸菌耐膽鹽能力的研究
    生物化工(2020年3期)2020-01-07 23:51:31
    菌體蛋白水解液應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵的研究
    黃芩苷對(duì)一株產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌體內(nèi)外抗菌作用的研究
    雙歧桿菌三聯(lián)活菌聯(lián)合多潘立酮治療新生兒喂養(yǎng)不耐受40例
    產(chǎn)細(xì)菌素雙歧桿菌的篩選及其分泌條件研究
    抗性淀粉在雙歧桿菌作用下的體外降解
    天天影视国产精品| 欧美 日韩 精品 国产| 我要看黄色一级片免费的| 免费在线观看日本一区| 日韩制服骚丝袜av| 国产欧美亚洲国产| 欧美另类一区| 在线精品无人区一区二区三| 一级黄色大片毛片| 99久久国产精品久久久| 久久久久精品人妻al黑| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲精品第二区| 99久久综合免费| 丰满迷人的少妇在线观看| 人妻久久中文字幕网| 1024香蕉在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美激情久久久久久爽电影 | av电影中文网址| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品二区激情视频| 日本五十路高清| 欧美激情 高清一区二区三区| 美女视频免费永久观看网站| 日韩一区二区三区影片| 99久久综合免费| 欧美国产精品一级二级三级| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 男女下面插进去视频免费观看| a级片在线免费高清观看视频| 在线观看www视频免费| 午夜91福利影院| 精品国内亚洲2022精品成人 | www.精华液| 国产一区二区三区av在线| 一区二区三区精品91| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲精品国产区一区二| 丝袜脚勾引网站| av国产精品久久久久影院| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美一级毛片孕妇| 国产麻豆69| 99香蕉大伊视频| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 久久天堂一区二区三区四区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 老汉色∧v一级毛片| 窝窝影院91人妻| 久久国产精品人妻蜜桃| 免费人妻精品一区二区三区视频| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 欧美97在线视频| 99国产精品一区二区三区| 午夜久久久在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产伦理片在线播放av一区| 黄色 视频免费看| 国产精品1区2区在线观看. | 国产淫语在线视频| 妹子高潮喷水视频| 水蜜桃什么品种好| 日韩免费高清中文字幕av| 无限看片的www在线观看| 亚洲国产欧美网| 热re99久久国产66热| av在线播放精品| 日本av手机在线免费观看| 久久综合国产亚洲精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久久国产一区二区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产片内射在线| 一区二区av电影网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲九九香蕉| 一个人免费在线观看的高清视频 | 电影成人av| 俄罗斯特黄特色一大片| av天堂在线播放| 99久久人妻综合| 欧美日韩黄片免| 国产老妇伦熟女老妇高清| 超碰成人久久| 各种免费的搞黄视频| 亚洲国产av新网站| 国产成人av教育| 国产97色在线日韩免费| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲人成电影观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产免费现黄频在线看| 日韩视频在线欧美| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲色图综合在线观看| 午夜91福利影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久久久国内视频| 亚洲国产日韩一区二区| 大陆偷拍与自拍| 国产在线免费精品| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品国产av在线观看| 国产欧美日韩一区二区三 | 国产成人精品无人区| 大香蕉久久成人网| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲一码二码三码区别大吗| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 99国产精品免费福利视频| 国产一卡二卡三卡精品| 自线自在国产av| 老司机靠b影院| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲熟女精品中文字幕| 一区二区三区精品91| 久久精品成人免费网站| 在线看a的网站| 男女之事视频高清在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 午夜福利在线免费观看网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久中文字幕一级| 免费观看av网站的网址| 另类亚洲欧美激情| 97在线人人人人妻| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产男女超爽视频在线观看| 桃花免费在线播放| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产有黄有色有爽视频| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | avwww免费| 99精品欧美一区二区三区四区| 色94色欧美一区二区| 国产精品偷伦视频观看了| 成年女人毛片免费观看观看9 | 岛国在线观看网站| 国产99久久九九免费精品| 在线观看免费高清a一片| 久久ye,这里只有精品| 亚洲专区字幕在线| 老熟女久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 在线天堂中文资源库| 成年美女黄网站色视频大全免费| 久久国产精品大桥未久av| 久久99一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 天堂8中文在线网| 精品一区在线观看国产| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 多毛熟女@视频| 高清欧美精品videossex| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 成年人午夜在线观看视频| 国产免费视频播放在线视频| 国产精品熟女久久久久浪| 一级黄色大片毛片| 久热爱精品视频在线9| 岛国在线观看网站| 999久久久精品免费观看国产| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产主播在线观看一区二区| 国产av精品麻豆| 成人免费观看视频高清| 一级片免费观看大全| 一级片'在线观看视频| www.精华液| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产一级毛片在线| av视频免费观看在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| a级片在线免费高清观看视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 亚洲人成77777在线视频| 国产免费福利视频在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 考比视频在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 一本综合久久免费| 一级毛片电影观看| 日日爽夜夜爽网站| 精品福利观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲,欧美精品.| 亚洲欧美精品自产自拍| 性少妇av在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品人妻1区二区| 国产精品九九99| 国产色视频综合| 亚洲情色 制服丝袜| 老司机深夜福利视频在线观看 | 黄色视频,在线免费观看| 男女之事视频高清在线观看| 日韩有码中文字幕| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产高清国产精品国产三级| 99国产精品99久久久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 黄色 视频免费看| 国产欧美日韩一区二区三 | 欧美激情高清一区二区三区| 日本wwww免费看| 亚洲精品av麻豆狂野| 妹子高潮喷水视频| 自线自在国产av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产91精品成人一区二区三区 | 一二三四社区在线视频社区8| 久久久久国内视频| av片东京热男人的天堂| 欧美大码av| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 日本五十路高清| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 黄频高清免费视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 狂野欧美激情性xxxx| 午夜91福利影院| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产片内射在线| 9热在线视频观看99| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品.久久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲免费av在线视频| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美日韩av久久| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲中文av在线| 99精品久久久久人妻精品| 久久久久久久精品精品| 激情视频va一区二区三区| 一区福利在线观看| 成在线人永久免费视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 老熟女久久久| 午夜福利在线免费观看网站| 成人黄色视频免费在线看| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 黑丝袜美女国产一区| 嫁个100分男人电影在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 激情视频va一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 视频在线观看一区二区三区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品第一国产精品| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲国产欧美网| 老熟女久久久| 亚洲人成77777在线视频| 女人精品久久久久毛片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 精品第一国产精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 国产成人系列免费观看| 免费高清在线观看日韩| 成人手机av| 精品一区在线观看国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产在线视频一区二区| 视频在线观看一区二区三区| 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品1区2区在线观看. | 国产欧美日韩一区二区三 | 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产成人av激情在线播放| 国产视频一区二区在线看| 精品人妻在线不人妻| 国产有黄有色有爽视频| 国产97色在线日韩免费| 99九九在线精品视频| 午夜激情av网站| 国产成人系列免费观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 女性被躁到高潮视频| 免费少妇av软件| 最近最新中文字幕大全免费视频| 2018国产大陆天天弄谢| 国产亚洲精品一区二区www | 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品av麻豆狂野| 丝袜在线中文字幕| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产av又大| av国产精品久久久久影院| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 考比视频在线观看| 在线看a的网站| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 91国产中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 999久久久精品免费观看国产| av视频免费观看在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 青春草亚洲视频在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 在线精品无人区一区二区三| 欧美日韩一级在线毛片| 操美女的视频在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 成人国产一区最新在线观看| 美女大奶头黄色视频| 欧美中文综合在线视频| 中文字幕制服av| 欧美在线一区亚洲| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品久久久av美女十八| 十八禁人妻一区二区| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品免费视频内射| 久久人妻福利社区极品人妻图片| xxxhd国产人妻xxx| 久久久国产欧美日韩av| 男女边摸边吃奶| 国产1区2区3区精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲精品中文字幕在线视频| 香蕉丝袜av| 国产99久久九九免费精品| 日本欧美视频一区| 69精品国产乱码久久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 老司机影院毛片| 久久久久久久久免费视频了| 成人av一区二区三区在线看 | 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲 欧美一区二区三区| 老司机靠b影院| 久久av网站| 亚洲中文av在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| av免费在线观看网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 日本a在线网址| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩欧美免费精品| 欧美国产精品一级二级三级| 日本五十路高清| 久9热在线精品视频| 水蜜桃什么品种好| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 青春草亚洲视频在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 欧美日韩精品网址| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲国产日韩一区二区| www.精华液| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久免费观看电影| 亚洲色图综合在线观看| 日本91视频免费播放| 国产三级黄色录像| 亚洲免费av在线视频| 热re99久久精品国产66热6| videosex国产| www.熟女人妻精品国产| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 午夜福利在线观看吧| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产野战对白在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久午夜综合久久蜜桃| 悠悠久久av| 不卡一级毛片| 国产福利在线免费观看视频| av电影中文网址| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 少妇人妻久久综合中文| 脱女人内裤的视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 永久免费av网站大全| 黄色怎么调成土黄色| 男人添女人高潮全过程视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品国内亚洲2022精品成人 | 精品免费久久久久久久清纯 | 国产一区二区三区av在线| 下体分泌物呈黄色| 国产男女超爽视频在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久毛片免费看一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| av在线老鸭窝| 亚洲人成电影观看| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲av美国av| 亚洲av国产av综合av卡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久久久国产精品人妻一区二区| 最近中文字幕2019免费版| 一级片'在线观看视频| 国产野战对白在线观看| bbb黄色大片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 一级黄色大片毛片| 岛国毛片在线播放| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产日韩欧美视频二区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 中文字幕制服av| 交换朋友夫妻互换小说| 在线观看免费高清a一片| 悠悠久久av| 后天国语完整版免费观看| 美女福利国产在线| 1024香蕉在线观看| 国产区一区二久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 成年人免费黄色播放视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久久久久久国产电影| 亚洲人成电影观看| 在线 av 中文字幕| 国产精品二区激情视频| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲五月色婷婷综合| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久精品免费免费高清| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 91字幕亚洲| 午夜福利在线观看吧| 亚洲专区字幕在线| 岛国毛片在线播放| 青青草视频在线视频观看| 国产淫语在线视频| 国产麻豆69| 午夜视频精品福利| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 在线看a的网站| 9191精品国产免费久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 99久久人妻综合| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成人免费无遮挡视频| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲专区中文字幕在线| 视频在线观看一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲,欧美精品.| 国产成人啪精品午夜网站| av在线老鸭窝| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久久免费高清国产稀缺| 母亲3免费完整高清在线观看| 脱女人内裤的视频| 亚洲男人天堂网一区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 99国产极品粉嫩在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 下体分泌物呈黄色| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 免费在线观看日本一区| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲国产av影院在线观看| 婷婷成人精品国产| av网站免费在线观看视频| 欧美性长视频在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 色视频在线一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 激情视频va一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 曰老女人黄片| 在线看a的网站| 又黄又粗又硬又大视频| 久久中文字幕一级| 久久青草综合色| 丝袜喷水一区| 老司机午夜福利在线观看视频 | 天堂8中文在线网| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久精品亚洲av国产电影网| 中文字幕高清在线视频| 国产三级黄色录像| 国产黄频视频在线观看| 午夜两性在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 欧美日韩成人在线一区二区| 一二三四在线观看免费中文在| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美乱码精品一区二区三区| 天天添夜夜摸| 老司机亚洲免费影院| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲中文av在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 两个人看的免费小视频| 久久av网站| 我的亚洲天堂| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 中国国产av一级| 午夜福利,免费看| 国产一区二区 视频在线| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产97色在线日韩免费| 亚洲少妇的诱惑av| 久久这里只有精品19| 国产精品影院久久| 日韩制服骚丝袜av| 国产深夜福利视频在线观看| 18在线观看网站| 老司机亚洲免费影院| 亚洲av欧美aⅴ国产| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲熟女毛片儿| 国产成人影院久久av| 国产视频一区二区在线看| 黄片大片在线免费观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 成人手机av| 999精品在线视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 999精品在线视频| 美女主播在线视频| 嫩草影视91久久| 两人在一起打扑克的视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产欧美日韩一区二区三 | 久久久久网色| 色精品久久人妻99蜜桃| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲 国产 在线| 国产麻豆69| 免费黄频网站在线观看国产| 中文字幕色久视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美97在线视频| 国产精品 欧美亚洲| 国产真人三级小视频在线观看| 各种免费的搞黄视频| 国产在线观看jvid| 精品欧美一区二区三区在线| 国产主播在线观看一区二区| 久久久精品94久久精品| 国产精品国产av在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品一区二区三卡| e午夜精品久久久久久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 777米奇影视久久| 国产av一区二区精品久久| 国产精品免费大片| 18禁国产床啪视频网站| 人人澡人人妻人| 国产精品九九99| 国产精品熟女久久久久浪| 又大又爽又粗| 不卡一级毛片|