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    利用低聚半乳糖雙歧桿菌的篩選及益生特性研究

    2023-12-16 02:55:02肖利紅何明雪徐梓赫張峰瑞張莉麗韓建春
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2023年11期
    關(guān)鍵詞:膽鹽菌體雙歧

    孫 慧,肖利紅,何明雪,徐梓赫,譚 澤,張峰瑞,張莉麗*,韓建春

    (1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150030 2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030 3 黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院 哈爾濱150028)

    低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)是人乳中含量較多的低聚糖[1],由半乳糖殘基和末端葡萄糖通過(guò)β-糖苷鍵連接而成的低聚糖。目前的商業(yè)GOS 是含有大量單糖和雙糖的混合低聚糖;不同供應(yīng)商的GOS 的連接類型和聚合程度差異很大[2]。GOS 具有優(yōu)良的益生功能,抵抗近端胃腸道消化的能力極強(qiáng),能夠促進(jìn)雙歧桿菌的定殖。人體攝入一定量的GOS 可以提高腸道吸收鎂和鐵元素的能力,在改善兒童缺鐵性貧血方面具有積極作用[3]。此外,GOS 還具有降低齲齒發(fā)生率、促進(jìn)脂質(zhì)代謝、保護(hù)肝臟、預(yù)防結(jié)腸癌等功能[4-5]。

    大部分雙歧桿菌(Bifidobacterium)是從嬰兒糞便中分離得到的,它是一種對(duì)人體腸道極其重要的微生物[6]。雙歧桿菌不僅可以促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育,抑制腫瘤和衰老,還可以調(diào)節(jié)腸道動(dòng)態(tài)平衡,促進(jìn)腸道屏障的完整性,減輕結(jié)腸炎癥狀,增強(qiáng)機(jī)體免疫力[7-11]。雙歧桿菌可以分解各種飲食來(lái)源和宿主腸道內(nèi)的碳水化合物,從而顯著促進(jìn)宿主的新陳代謝,這一特征不僅保證其在腸道中的定殖,而且通過(guò)交叉喂養(yǎng)策略為宿主和其它腸道微生物提供營(yíng)養(yǎng)[12-13]。

    雙歧桿菌發(fā)酵GOS 的能力依賴于GOS 的聚合度和糖苷鍵類型。有研究證明雙歧桿菌更加傾向于分解利用高聚合度的GOS[14]。Taskwan 等[15]分析雙歧桿菌與乳酸菌利用的GOS 的情況,發(fā)現(xiàn)嬰兒雙歧桿菌M63 和嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697 能夠很好地利用短鏈低聚半乳糖(Short chain galacto-oligosaccharides,SC-GOS)。SC-GOS 可以調(diào)節(jié)腸道微生物組成,增加雙歧桿菌的豐度,改善乳糖不耐受癥[16]。Xiao 等[17]給小鼠喂食含2’-巖藻糖基乳糖、SC-GOS 和長(zhǎng)鏈低聚果糖(Long chain fructo-oligosaccharides,LC-FOS)的混合物,發(fā)現(xiàn)小鼠的腸道微生物區(qū)系組成發(fā)生變化,并且代謝功能和免疫系統(tǒng)功能得到改善。有研究證實(shí)給嬰兒食用SC-GOS、LC-FOS 與短雙歧桿菌M-16V的混合物,可使其糞便變軟,糞便中雙歧桿菌的數(shù)量大大增加[18]。嬰兒食用含有SC-GOS 和LC-FOS的嬰配粉可以降低腸絞痛的發(fā)生率[19],預(yù)防輪狀病毒引起的腹瀉癥狀[20],促進(jìn)嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育[21]。然而,目前有關(guān)利用SC-GOS 的雙歧桿菌研究較少,菌株資源較為有限。

    本課題組從嬰兒糞便中分離得到126 株雙歧桿菌,以SC-GOS 為唯一碳源,從中篩選高效利用SC-GOS 的雙歧桿菌,結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)確定其種屬。評(píng)價(jià)胞外多糖含量、菌體表面蛋白含量、表面疏水性和自聚集能力、模擬胃液耐受能力、膽鹽耐受能力以及上清液抑菌能力,以期獲得高效利用SC-GOS 且益生特性優(yōu)良的雙歧桿菌菌株,為開(kāi)發(fā)出含有GOS 和雙歧桿菌的產(chǎn)品提供菌株資源。

    1 材料與方法

    1.1 微生物菌株

    嬰兒雙歧桿菌M63(Bifidobacterium longum subsp.infantis M63,BI_M63)為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種,嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697(Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697,BI_15697)及大腸桿菌ATCC 25922(Escherichia coli ATCC 25922,EC_25922)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。

    1.2 主要材料與試劑

    低聚半乳糖(GOS)、葡萄糖、乳糖,上海源葉生物科技有限公司;MRS 肉湯培養(yǎng)基,青島海博生物公司;L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine HCl),德國(guó)BioFroxx 公司;豬膽鹽,上海瑞永生物科技有限公司;胃蛋白酶,天津阿爾法生物科技有限公司;DNA 提取試劑盒Omega D4015-01,Omega Bio-Tek 公司

    1.3 主要儀器與設(shè)備

    CMax Plus 酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;SPL-150 生化培養(yǎng)箱,天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司;ZWY-A2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司;TGL-23 離心機(jī),四川蜀科儀器有限公司;BSC-1100-L ⅡA2生物安全柜,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

    1.4 培養(yǎng)基

    還原液配制方法如下:10 g/L 細(xì)菌蛋白胨,5 g/L 氯化鈉,0.5 g/L L-Cysteine HCl,1 mL/L 吐溫80。121 ℃滅菌15 min。RB 瓊脂培養(yǎng)基參照郭春峰[22]的方法配制,118 ℃滅菌15 min。MRSC 培養(yǎng)基配制方法如下:MRS 肉湯培養(yǎng)基添加0.5 g/L LCysteine HCl,加入15 g/L 瓊脂制成MRSC 固體培養(yǎng)基,118 ℃滅菌15 min。無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基配制方法如下:10 g/L 細(xì)菌蛋白胨、5 g/L 酵母浸粉、0.5 g/L L-Cysteine HCl、2 g/L 磷酸氫二鉀、5 g/L無(wú)水乙酸鈉、2 g/L 檸檬酸銨、0.2 g/L 七水硫酸鎂、0.05 g/L 一水硫酸錳、1 mL/L 吐溫80,118 ℃滅菌15 min。

    不同碳源培養(yǎng)基配制方法如下:在上述無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基中分別添加10 g/L 的P-GOS/GOS/葡萄糖/乳糖,118 ℃滅菌15 min。

    1.5 試驗(yàn)方法

    1.5.1 菌株活化 將課題組前期從嬰兒糞便中篩選分離得到的126 株雙歧桿菌菌株活化,即以1%接種量接種至MRSC 液體培養(yǎng)基,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,傳代18 h 備用。

    1.5.2 SC-GOS 的制備 根據(jù)Taksawan 等[15]的方法制備SC-GOS。即將0.15 mg/mL GOS 加樣到已裝填好Sephadex G-25 凝膠(Sigma-Aldrich)的XK 16/100 柱(GE Healthcare Life Science)中,洗脫收集。以乳糖為對(duì)照,應(yīng)用苯酚-硫酸法[23]確定GOS 和乳糖的出峰時(shí)間,收集GOS 和乳糖不重合部分,混合凍干得到SC-GOS,用于后續(xù)試驗(yàn)。利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析確定所得到SC-GOS 中不含有單糖和雙糖。

    1.5.3 可利用SC-GOS 的雙歧桿菌篩選 取1 mL 上述1.5.1 節(jié)菌液離心(10 000×g,5 min,4℃),水洗沉淀并重懸制備菌懸液。分別取200 μL SC-GOS-培養(yǎng)基、GOS-培養(yǎng)基、葡萄糖-培養(yǎng)基、乳糖-培養(yǎng)基至96 孔板中,以1%接種量接種菌懸液,設(shè)置對(duì)照組(無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基、SCGOS-培養(yǎng)基、GOS-培養(yǎng)基、葡萄糖-培養(yǎng)基、乳糖-培養(yǎng)基以及加菌的無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基)。37℃厭氧培養(yǎng),測(cè)定0,24,48 h 的OD595nm值以確定能利用SC-GOS 的雙歧桿菌。

    1.5.4 利用SC-GOS 雙歧桿菌的生物學(xué)鑒定 利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒Omega D4015-01提取細(xì)菌基因組DNA。根據(jù)鄭慧娟等[24]的研究用雙歧桿菌特異引物(Bif164-F:5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’;Pbi R2:5’-GACCATGCACCACCTGTGAA-3’)對(duì)菌株DNA 進(jìn)行擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳,送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序。序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析,確定菌株種屬。

    1.5.5 利用SC-GOS 雙歧桿菌形態(tài)觀察取1 mL 上述1.5.1 節(jié)菌液離心(10 000×g,5 min,4℃),PBS 洗滌,應(yīng)用孫明明等[25]方法處理。即用2.5%戊二醛處理12 h,乙醇系列脫水并冷凍干燥,應(yīng)用鎢燈絲掃描電子顯微鏡S-3400N 觀察菌體形態(tài)。

    1.5.6 益生特性分析

    1.5.6.1 胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定 取10 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心(6 000×g,10 min,4 ℃),將上清液與3倍體積乙醇混合,4 ℃沉淀16 h,用3.5 ku 透析袋透析,每8 h 換1 次水,透析48 h。用Alcian Blue法[26]測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量。

    1.5.6.2 菌體表面蛋白含量測(cè)定 取10 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心(6 000×g,10 min,4 ℃),PBS 洗2次,加入2 mL 5 mol/L LiCl,恒溫振蕩反應(yīng)(200 r/min,1 h,37 ℃),離心(6 000×g,10 min,4 ℃),將上清液與2 倍體積冰丙酮混合,-20 ℃放置過(guò)夜。應(yīng)用Bradford 法[27]測(cè)定菌體表面蛋白含量。

    1.5.6.3 表面疏水性的測(cè)定 取3 mL 上述1.5.1節(jié)菌液,加入等體積二甲苯,恒溫振蕩反應(yīng)(250 r/min,10 min,37 ℃),靜置1 h。吸取水相測(cè)定波長(zhǎng)595 nm 處的吸光度。重復(fù)進(jìn)行3 次,取平均值。疏水性(H)計(jì)算公式:

    式中,A0——0 h 吸光度;A1——不同時(shí)間吸光度。

    1.5.6.4 自聚集能力的測(cè)定 取5 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心(4 500×g,15 min,4 ℃),PBS 緩沖液洗滌并重懸制備菌懸液,測(cè)定0,2,4,6 h 上述菌懸液在595 nm 下的吸光度。自聚集率(A)計(jì)算公式:

    式中,A0——0 h 吸光度;At——不同時(shí)間吸光度。

    1.5.6.5 模擬胃液耐受能力分析 取上述1.5.1節(jié)菌液按體積比1∶5 接種至pH 值為2.0 的人工胃液(胃蛋白酶10 g/L,加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值)中,37 ℃靜置培養(yǎng),分別在0 h、30 min、3 h 時(shí)菌落計(jì)數(shù)。1.5.6.6 膽鹽耐受能力分析 取1 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心(10 000×g,5 min,4 ℃),洗滌菌體2次,重懸于含0.2%豬膽鹽的MRSC 培養(yǎng)液中,37℃厭氧培養(yǎng),分別在0 h 和30 min 時(shí)菌落計(jì)數(shù)。1.5.6.7 無(wú)細(xì)胞上清液抑菌能力測(cè)定 取5 mL上述1.5.1 節(jié)菌液離心(10 000×g,5 min,4 ℃),將上清液通過(guò)0.22 μm 的微孔濾膜。以EC_25922 為指示菌,應(yīng)用牛津杯法[28]評(píng)估各菌株抑菌能力。

    1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 利用SC-GOS 的雙歧桿菌篩選及16S rDNA 鑒定結(jié)果

    Thomson 等[29]發(fā)現(xiàn)BI_15697 在0.5% GOS 上生長(zhǎng)48 h 的OD595nm在0.3 左右,本研究發(fā)現(xiàn)BI_15697 在1% SC-GOS 和GOS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48 h 的OD595nm分別為0.25 和0.63,故以BI_15697和BI_M63 作為對(duì)照菌株,SC-GOS、GOS 作為篩選的標(biāo)志物,共54 株利用SC-GOS 效果優(yōu)于BI_15697。根據(jù)菌落形態(tài)、來(lái)源、鏡檢結(jié)果等,最終選擇7 株利用SC-GOS 能力(OD595nm﹥0.80)遠(yuǎn)強(qiáng)于BI_15697(P<0.05)的雙歧桿菌進(jìn)行16S rDNA鑒定。鑒定結(jié)果顯示,1 株長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種BI_Y46,2 株兩歧雙歧桿菌(BB_Y22、BB_S7),2株假小鏈雙歧桿菌(BP_Y43、BP_YA)以及2 株長(zhǎng)雙歧桿菌(BL_S34、BL_H26)。雙歧桿菌利用SCGOS 情況及發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1,序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 NCBI BLAST 比對(duì)結(jié)果Table 1 NCBI BLAST comparison results

    表2 各試驗(yàn)菌株自聚集能力(,n=3)Table 2 The self-aggregation ability of each experimental strain(,n=3)

    表2 各試驗(yàn)菌株自聚集能力(,n=3)Table 2 The self-aggregation ability of each experimental strain(,n=3)

    注:不同大寫(xiě)字母為同一菌株不同時(shí)間差異顯著(P<0.05),不同小寫(xiě)字母為不同菌株同一時(shí)間差異顯著(P<0.05)。

    圖1 碳源利用情況及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Utilization of carbon sources and phylogenetic tree

    2.2 掃描電鏡觀察雙歧桿菌形態(tài)

    掃描電鏡觀察菌株形態(tài)如圖2 所示,BL_S34(f)和BL_H26(g)呈勺狀;BP_YA(d)中含分叉結(jié)構(gòu);BB_Y22(a)為彎桿狀、BP_Y43(b)和BB_S7(e)為長(zhǎng)桿狀,表面均較為光滑。值得注意的是,BI_Y46(c)具有獨(dú)特的菌毛結(jié)構(gòu),F(xiàn)rancesca 等[30]發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌PRL2010 具有的菌毛結(jié)構(gòu)有助于其黏附,并且具有免疫調(diào)節(jié)活性。短雙歧桿菌UCC2003 中也存在菌毛結(jié)構(gòu),雖然短雙歧桿菌UCC2003 不能單獨(dú)利用3’-唾液酸乳糖或部分巖藻糖,但可以與兩歧雙歧桿菌PRL2010 共培養(yǎng)形成交叉喂養(yǎng),發(fā)揮益生作用[31-32]。因此推斷菌體表面存在菌毛的BI_Y46 可能具有較強(qiáng)黏附能力,同時(shí)具有抑制病原菌等功能,未來(lái)將通過(guò)更多試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

    圖2 SEM 觀察利用SC-GOS 的雙歧桿菌形態(tài)圖Fig.2 Observation of Bifidobacterium morphology using SC-GOS by SEM

    2.3 利用SC-GOS 的雙歧桿菌胞外多糖產(chǎn)量

    利用SC-GOS 的雙歧桿菌胞外多糖產(chǎn)量見(jiàn)圖3。其中,BB_Y22 胞外多糖產(chǎn)量最高,為(0.49±0.04)mg/mL,BI_Y46 以及BL_H26 胞外多糖產(chǎn)量在0.4~0.45 mg/mL 之間。目前針對(duì)高產(chǎn)胞外多糖的雙歧桿菌研究較少,一般胞外多糖產(chǎn)量在幾十到幾百毫克每升不等,蔡靜靜等[33]分離得到雙歧桿菌胞外多糖產(chǎn)量在0.4 mg/mL 左右,故BB_Y22、BP_Y43 屬于產(chǎn)胞外多糖能力較強(qiáng)的菌株,為未來(lái)應(yīng)用提供一定參考。

    圖3 利用SC-GOS 雙歧桿菌的胞外多糖產(chǎn)量(,n=3)Fig.3 The exopolysaccharide yield of Bifidobacteria able to utilize SC-GOS(,n=3)

    2.4 利用SC-GOS 的雙歧桿菌菌體表面蛋白含量分析

    表面蛋白可以延長(zhǎng)益生菌在腸道發(fā)揮作用的時(shí)間[34],本試驗(yàn)測(cè)定菌體表面蛋白,為后續(xù)分析其具體成分或探討其黏附功能及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。各試驗(yàn)菌株菌體表面蛋白含量見(jiàn)圖4。結(jié)果表明,BL_H26 菌體表面蛋白含量較高,為(0.74±0.07)mg/mL(P<0.05),而B(niǎo)B_Y22、BB_S7、BL_S34 含量接近,均在0.35~0.45 mg/mL 范圍;所有菌株表面蛋白含量均超過(guò)BI_15697。目前有關(guān)雙歧桿菌菌體表面蛋白的報(bào)道不多,后續(xù)將對(duì)雙歧桿菌的表面蛋白進(jìn)一步分離,以探討其的功能特性。

    圖4 利用SC-GOS 雙歧桿菌菌體表面蛋白含量(,n=3)Fig.4 Surface protein content of Bifidobacteria able to utilize SC-GOS(,n=3)

    2.5 表面疏水性和自聚集能力

    表面疏水性和自聚集能力與黏附能力密切相關(guān),具有良好黏附能力的益生菌株可以抑制致病菌的侵襲[35]。以BI_M63 和BI_15697 作為對(duì)照,各試驗(yàn)菌株表面疏水性如圖5 所示。結(jié)果表明,BP_Y43、BP_YA 表面疏水性為24.96%,24.90%,與BI_15697、BI_M63 的表面疏水性差異較小,而顯著高于BI_Y46 和BL_H26(P<0.05);其余菌株如BB_Y22、BB_S7、BB_S34 表面疏水能力處于中等水平,均在15%左右,低于陳美瑄[36]篩選得到的雙歧桿菌Probio-M9(50%),可能是由于處理?xiàng)l件不同導(dǎo)致的。

    圖5 各試驗(yàn)菌株表面疏水性(,n=3)Fig.5 Surface hydrophobicity of each experimental strain(,n=3)

    自聚集試驗(yàn)表明,BB_Y22 和BP_Y43 整體自聚集能力較強(qiáng),BL_H26 較弱。在2 h 時(shí),BB_Y22和BP_Y43 的自聚集百分比分別為(51.08±4.02)%和(55.27±5.94)%,明顯高于其它菌株(P<0.05),其余菌株與趙笑笑等[37]的研究基本一致,在10%~30%范圍。在4 h 時(shí),BB_Y22 高達(dá)(73.16±4.06)%,提高了20%左右,同時(shí)BP_Y43、BI_Y46、BP_YA、BB_S7 以及BL_S34 都有顯著提升,而B(niǎo)I_M63 和BI_15697 變化較小,在4 h 時(shí)分別為(27.37±1.89)%和(32.80±3.82)%;在6 h 時(shí),BB_Y22 和BP_Y43 達(dá)到了80%以上,遠(yuǎn)高于其它菌株(P<0.05),同時(shí)超過(guò)陳美瑄[36]篩選得到的雙歧桿菌Probio-M8(58%)和Probio-M9(78%)。

    2.6 利用SC-GOS 的雙歧桿菌模擬胃液耐受情況分析

    雙歧桿菌為到達(dá)并穩(wěn)定地定居在大腸,必須應(yīng)對(duì)胃腸道上發(fā)生的大量氧化、滲透、膽鹽或胃液應(yīng)激挑戰(zhàn)[38]。以BI_M63 和BI_15697 作為對(duì)照,各試驗(yàn)菌株在模擬胃液pH 2.0 時(shí)的耐受情況如表3 所示。處理30 min 與0 h 相比,BI_M63、BP_YA、BB_S7 菌落數(shù)量略微增長(zhǎng)或持平,而其余菌株菌落數(shù)量減少,BI_15697 相對(duì)減少菌落數(shù)量最多(P<0.05);處理3 h 與0 h 相比,BI_15697 的存活率最低(P<0.05),BI_M63 菌落數(shù)量增加,這可能與應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)相關(guān),即受到刺激后產(chǎn)生促進(jìn)自身生長(zhǎng)的物質(zhì)。其余菌株存活率接近100%,說(shuō)明菌株具有較強(qiáng)的胃液耐受性,所有篩選得到菌株在pH 2.0 模擬胃液刺激下的存活率高于胡鵬鈺等[39]分離得到的兩株雙歧桿菌在pH 2.5 模擬胃液刺激下的存活率(73%,75%),較強(qiáng)胃液耐受菌株在今后產(chǎn)品中的應(yīng)用具有廣闊前景。

    表3 菌株在模擬胃液(pH 2.0)耐受情況(,n=3)Table 3 Simulated gastric juice tolerance of srtains at pH 2.0(,n=3)

    表3 菌株在模擬胃液(pH 2.0)耐受情況(,n=3)Table 3 Simulated gastric juice tolerance of srtains at pH 2.0(,n=3)

    注:大寫(xiě)字母不同為同一菌株不同時(shí)間生長(zhǎng)情況差異顯著(P<0.05),小寫(xiě)字母不同為不同菌株同一時(shí)間以及3 h 存活率的差異顯著(P<0.05)。

    2.7 利用SC-GOS 的雙歧桿菌膽鹽耐受情況分析

    潛在的益生菌要有較強(qiáng)的膽鹽耐受能力,各試驗(yàn)菌株在0.2%豬膽鹽處理30 min 時(shí)相較0 h的細(xì)菌數(shù)量減少情況如圖6 所示。結(jié)果表明,在膽鹽存在的條件下,所有菌株存活能力受到不同程度的影響,BP_Y43 的菌落數(shù)量減少5.5×108CFU/mL,其余菌株菌落數(shù)量減少1.0×107CFU/mL 左右(P<0.05)。這個(gè)結(jié)果表明除BP_Y43 外,其余試驗(yàn)菌株膽鹽耐受性強(qiáng)(P<0.05)。黃巧芬[40]分離的長(zhǎng)雙歧桿菌NCU712 在0.3%豬膽鹽刺激下,菌數(shù)減少了3.9×107CFU/mL,可能是由于菌株不同和所用的膽鹽不同,未來(lái)將進(jìn)一步探討0.3%膽鹽下的耐受情況。

    圖6 膽鹽耐受情況(,n=3)Fig.6 Bile salt tolerance(,n=3)

    2.8 利用SC-GOS 的雙歧桿菌上清液抑菌能力評(píng)價(jià)

    Delcaru 等[41]證實(shí)了雙歧桿菌對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生拮抗作用,目前已經(jīng)提出了部分益生菌對(duì)致病菌產(chǎn)生拮抗作用的機(jī)制,如競(jìng)爭(zhēng)排斥、宿主免疫調(diào)節(jié)等[42]。以無(wú)菌的MRSC 培養(yǎng)基作為對(duì)照,各試驗(yàn)菌株的上清液抑制EC_25922 能力見(jiàn)表4。結(jié)果表明,BI_15697 上清液沒(méi)有抑菌效果;BP_Y43、BP_YA 抑菌效果較強(qiáng),抑菌環(huán)直徑分別為10.33 mm 和10.17 mm;BB_Y22、BL_S34、BL_H26 菌 株上清液抑菌能力強(qiáng),抑菌環(huán)直徑在11~12.5 mm 之間,而B(niǎo)I_M63、BI_Y46 以及BB_S7 上清液對(duì)大腸桿菌抑制作用更加明顯,抑菌環(huán)直徑可以達(dá)到12.5 mm 以上。

    表4 菌株上清液對(duì)EC_25922 抑制作用(,n=3)Table 4 Inhibitory effect of strain supernatant on EC_25922(,n=3)

    表4 菌株上清液對(duì)EC_25922 抑制作用(,n=3)Table 4 Inhibitory effect of strain supernatant on EC_25922(,n=3)

    注:牛津杯外徑8 mm。-.沒(méi)有抑菌作用;+.抑菌環(huán)直徑8~9.5 mm;++.抑菌環(huán)直徑9.5~11 mm;+++.抑菌環(huán)直徑11~12.5 mm;++++.抑菌環(huán)直徑>12.5 mm。

    3 結(jié)論

    從糞便樣品中分離得到7 株高效利用SCGOS 的雙歧桿菌,分別為兩歧雙歧桿菌BB_Y22和BB_S7、假小鏈雙歧桿菌BP_Y43 和BP_YA、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種BI_Y46 以及長(zhǎng)雙歧桿菌BL_S34、BL_H26。

    觀察形態(tài)并分析益生特性,發(fā)現(xiàn)BI_Y46 具有菌毛結(jié)構(gòu),蛋白含量較高,為(0.31±0.02)mg/mL,同時(shí)BI_Y46 上清液對(duì)EC_25922 的抑菌效果較強(qiáng)(P<0.05);BB_Y22 的胞外多糖產(chǎn)量最高,為(0.49±0.04)mg/mL,菌體表面蛋白含量為(0.37±0.06)mg/mL,具有較強(qiáng)表面疏水性和自聚集能力,還具有較強(qiáng)的胃液耐受性(P<0.05);BP_Y43 也同樣具有較高胞外多糖產(chǎn)量和高菌體蛋白含量,表面疏水性與自聚集能力也較強(qiáng),同時(shí)具有較強(qiáng)膽鹽耐受能力,有利于其在腸道中的定殖(P<0.05)。

    綜上,本試驗(yàn)分離高效利用短鏈低聚半乳糖的雙歧桿菌中,長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種BI_Y46、兩歧雙歧桿菌BB_Y22 以及假小鏈雙歧桿菌BP_Y43 具有較好的益生潛力,為開(kāi)發(fā)益生菌產(chǎn)品、嬰兒配方乳粉提供一定的參考,也為后續(xù)研究提供菌株資源。

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