miR-642a-3p 對藻藍(lán)色素抑制非小細(xì)胞肺癌活性的調(diào)控作用

李前程，郝 帥，李 爽，劉媛璞，李凡念，楊 起，張文靜

（老年?duì)I養(yǎng)與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京工商大學(xué)）北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京 100048）

近年來，腫瘤對于人類健康的威脅越來越明顯[1]，其發(fā)病率和死亡率呈階梯式上升，特別是在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率居高不下[2]，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人們的健康生存。肺癌的治療主要抑制是癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，因此靶向治療成為研究熱點(diǎn)[3]。藻藍(lán)色素（Phycocyanin，PC）是存在于螺旋藻中的一種捕光色素蛋白復(fù)合體，也是一類重要的食品功能因子，具有抗癌[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]以及抗腫瘤[7]等多種生理活性的天然活性物質(zhì)，可以通過調(diào)節(jié)人體中多種酶的合成，抑制癌細(xì)胞的生長，被廣泛應(yīng)用于功能性食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域中。前期研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)色素具有抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（Non-small cell lung cancer，NSCLC）生長、增殖、遷移以及侵襲等作用[8-10]，然而具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。

microRNA（miRNA）是一類由22 bp 左右核苷酸組成的非編碼小分子RNA，對細(xì)胞的增殖、遷移和分化等生理過程起重要的調(diào)控作用[11]。狄奕成等[12]發(fā)現(xiàn)miR-195-5p 能夠促進(jìn)IL-17 誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程。萬啟飛等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3p 可靶向下游基因，從而抑制肺癌A549 細(xì)胞增殖。此外，有報(bào)道稱miR-642a-3p 在NSCLC 中具有重要的調(diào)控作用[14]。為進(jìn)一步探究miR-642a-3p 是否參與藻藍(lán)色素抑制NSCLC 的過程，本研究以4 種典型的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549、H1299、H460、LTEP-a2）為模型，通過干預(yù)miR-642a-3p 的表達(dá)水平，從細(xì)胞增殖、凋亡、遷移以及克隆形成等試驗(yàn)探索miR-642a-3p對細(xì)胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞株 人類非小細(xì)胞肺癌H1299 細(xì)胞系、H460 細(xì)胞系、LTEP-a2 細(xì)胞系（以下簡稱“A2”）、A549 細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室（北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心）保存。

1.1.2 試劑 胎牛血清，康源生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）相關(guān)試劑，廣州銳博生物技術(shù)有限公司、北京全式金生物技術(shù)有限公司；1%青霉素-鏈霉素，美國Corning公司；Entranster-R4000，英格恩生物公司；CCK-8試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；miRNA 模擬物（miR-642a-3p mimic），廣州銳博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Heraeus Eppendorf 公司；Spectra Max i3 多功能酶標(biāo)儀，美國MD 公司；超凈工作臺(tái)，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；漩渦振蕩器，德國IKA 公司；BSA224S 型數(shù)字電子天平，德國Sartorius 公司；CFX96 Touch qPCR 檢測系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將H460 細(xì)胞、H12999 細(xì)胞、A549 細(xì)胞、A2 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2的相對飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長。

1.3.2 細(xì)胞生長曲線測定 利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以5 000 個(gè)/100 μL 每孔的細(xì)胞量接入96 孔板中正常培養(yǎng)，37 ℃正常培養(yǎng)12 h 后用50 nmol/L的miR-642a-3p 模擬物培養(yǎng)液處理細(xì)胞，做4 個(gè)復(fù)孔，分別以不同的時(shí)間梯度進(jìn)行培養(yǎng)后，加入100 μL 配制好的CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2～4 h 后用酶標(biāo)儀于波長450 nm 處測各孔吸光度。連續(xù)測定5 d，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞生長情況。以橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為吸光度，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.3 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，37 ℃正常培養(yǎng)12 h 后加入終濃度為50 nmol/L 的miR-642a-3p 模擬物培養(yǎng)液分別處理細(xì)胞24，48 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.3.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 將處于對數(shù)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，底部預(yù)先用記號(hào)筆畫出3 條平行線作為參考坐標(biāo)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至幾乎100%匯合度。用吸頭快速垂直于培養(yǎng)皿底部劃出一道直線，用培養(yǎng)基輕輕沖洗除去細(xì)胞碎片，加入含有終濃度為50 nmol/L 的miR-642a-3p 模擬物培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別于0，24 h 和48 h 時(shí)在固定的劃痕位置進(jìn)行拍照，測量劃痕區(qū)的寬度（H）并計(jì)算細(xì)胞的遷移率（I），其中0 μmol/L 藻藍(lán)蛋白處理組為對照組，遷移率按式（1）計(jì)算。

1.3.5 細(xì)胞克隆試驗(yàn) 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按照2×102/孔密度鋪于六孔板中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁以后，將終濃度為50 nmol/L 的miR-642a-3p 模擬物培養(yǎng)液加入孔板中，處理細(xì)胞10～15 d，對照組不做處理。當(dāng)六孔板中細(xì)胞的克隆集落肉眼可見時(shí)，用吉姆薩染色，將染色后的細(xì)胞集落拍照保存并進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)。

1.3.6 qPCR 檢測miR-642a-3p 基因表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種在六孔板中培養(yǎng)24 h，加入終濃度為50 nmol/L 的miR-642a-3p 模擬物培養(yǎng)液處理48 h，用RNA 提取試劑盒提取總RNA，測定RNA 濃度。參照試劑盒說明進(jìn)行cDNA 合成如表1 所示。

表1 RT 反應(yīng)體系Table 1 RT reaction condition

以上體系混勻后，瞬時(shí)離心，RT 反應(yīng)程序：42℃60 min，70 ℃10 min。參照試劑盒說明進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系如表2 所示。

表2 miRNA PCR 反應(yīng)體系Table 2 miRNA PCR reaction condition

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理軟件采用Microsoft Excel 2010，作圖軟件為Origin 8.5，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。顯著性差異分析采用Student t-test 雙尾檢驗(yàn)分析，其中P<0.05 為顯著性差異，P<0.01 為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍(lán)色素對miR-642a-3p 表達(dá)的影響

藻藍(lán)色素處理細(xì)胞后，對4 種細(xì)胞內(nèi)miR-642a-3p 的表達(dá)水平進(jìn)行了定量PCR 的檢測，結(jié)果如圖1 所示，細(xì)胞中的miR-642a-3p 均出現(xiàn)不同程度的顯著性上調(diào)，這表明藻藍(lán)色素具有調(diào)控NSCLC 中內(nèi)源性miR-642a-3p 表達(dá)水平的作用。

圖1 藻藍(lán)色素對miR-642a-3p 表達(dá)水平的影響Fig.1 Effects of phycocyanin on the expression level of miR-642a-3p

2.2 miR-642a-3p 過表達(dá)效果在細(xì)胞中的驗(yàn)證

為進(jìn)一步探究miR-642a-3p 表達(dá)水平的干預(yù)是否會(huì)對細(xì)胞表型造成影響，將miR-642a-3p的模擬物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中進(jìn)行熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA 模擬物之后，miR-642a-3p 的表達(dá)顯著上調(diào)（圖2），結(jié)果表明miR-642a-3p 在4 種細(xì)胞中被成功干預(yù)。

圖2 miR-642a-3p 模擬物作用4 種細(xì)胞48 h 后miR-642a-3p 的qPCR 表達(dá)情況Fig.2 qPCR expression of miR-642a-3p in four types of cells treated with miR-642a-3p mimic for 48 hours

2.3 miR-642a-3p 過表達(dá)對細(xì)胞活性的影響

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)的摸索，終濃度為50 nmol/L的miR-642a-3p 模擬物即可達(dá)到預(yù)期的過表達(dá)效果，因此將細(xì)胞轉(zhuǎn)染終濃度設(shè)置在50 nmol/L。將miR-642a-3p mimic 轉(zhuǎn)染后的4 種細(xì)胞進(jìn)行體外增殖能力檢測，如圖3 所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-642a-3p mimic 后細(xì)胞的體外增殖能力出現(xiàn)顯著降低，表明miR-642a-3p 的過表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞生長。

圖3 miR-642a-3p 模擬物對4 種細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effects of miR-642a-3p mimics on the proliferation ability of four types of cells

細(xì)胞劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-642a-3p 后，對照組與過表達(dá)組的細(xì)胞遷移能力有著顯著差異，過表達(dá)組細(xì)胞的遷移率隨時(shí)間延長逐漸降低，遷移能力受到明顯抑制（圖4），表明miR-642a-3p 對NSCLC 細(xì)胞的體外遷移能力也有抑制效果。

圖4 miR-642a-3p 模擬物對4 種細(xì)胞遷移率的影響Fig.4 The effects of miR-642a-3p mimics on the migration rates of four types of cells

細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)?zāi)軌驕y定細(xì)胞的體外非錨定生長能力，如圖5 結(jié)果所示，過表達(dá)miR-642a-3p 后，4 種細(xì)胞的克隆集落形成數(shù)量均明顯少于對照組，表明miR-642a-3p 對NSCLC 細(xì)胞的體外非錨定生長能力具有顯著抑制效果。

圖5 miR-642a-3p 模擬物對4 種細(xì)胞克隆數(shù)的影響Fig.5 Effects of miR-642a-3p mimics on the number of colonies of four types of cells

綜上所述，過表達(dá)miR-642a-3p 會(huì)對細(xì)胞活性產(chǎn)生一定影響，細(xì)胞的增殖、遷移、克隆形成能力均受到抑制，這些結(jié)果與藻藍(lán)色素對細(xì)胞的影響趨勢一致，初步表明藻藍(lán)色素能夠通過上調(diào)miR-642a-3p 的表達(dá)而抑制NSCLC 細(xì)胞的活性。

2.4 miR-642a-3p 表達(dá)水平的抑制對細(xì)胞活性的影響

為了進(jìn)一步探究miR-642a-3p 是否對細(xì)胞的增殖水平產(chǎn)生影響，將50 nmol/L 終濃度的miR-642a-3p 抑制劑在4 種細(xì)胞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)染并測定細(xì)胞生長曲線，結(jié)果如圖6 所示，除A549 細(xì)胞外，H460、H1299 和A2 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染3～4 d 時(shí)生長速率出現(xiàn)了顯著增加，這一現(xiàn)象與過表達(dá)miR-642a-3p 的結(jié)果呈現(xiàn)相反趨勢，進(jìn)一步表明miR-642a-3p 確實(shí)對NSCLC 細(xì)胞的生長具有明顯調(diào)控作用。

圖6 miR-642a-3p 抑制劑對4 種細(xì)胞生長的影響Fig.6 Effects of miR-642a-3p inhibitors on the proliferation of four types of cells

同樣地，本文對抑制miR-642a-3p 表達(dá)后的細(xì)胞遷移能力也進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，A549 和H1299 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-642a-3p 抑制劑后，細(xì)胞的遷移能力出現(xiàn)了顯著提高，然而H460 和A2 細(xì)胞卻依然表現(xiàn)出遷移能力降低的現(xiàn)象（圖7），推測在不同的非小細(xì)胞肺癌亞型細(xì)胞中，miR-642a-3p可能調(diào)控了不同的靶基因，因此對細(xì)胞遷移能力的影響會(huì)有差異。A549 和H1299 的結(jié)果雖與miR-642a-3p 過表達(dá)的趨勢相反，但也在一定程度上驗(yàn)證了miR-642a-3p 會(huì)對NSCOC 細(xì)胞的遷移產(chǎn)生調(diào)控作用。

圖7 miR-642a-3p 抑制劑對4 種細(xì)胞遷移率的影響Fig.7 Effects of miR-642a-3p inhibitor on migration rate of four cell migration rates

對細(xì)胞的非錨定生長能力檢測顯示（圖8），抑制miR-642a-3p 的表達(dá)后，A549、H1299 和A2細(xì)胞的集落形成數(shù)量出現(xiàn)了顯著增加，而H460細(xì)胞的克隆數(shù)量雖有一定增加，但沒有顯著差異。這一結(jié)果也進(jìn)一步說明miR-642a-3p 對NSCLC細(xì)胞的體外非錨定生長能力具有明顯的調(diào)控效應(yīng)。

圖8 miR-642a-3p 抑制劑對4 種細(xì)胞克隆數(shù)的影響Fig.8 Effects of miR-642a-3p inhibitor on the number of colonies of four types of cells

綜上所述，采用抑制miR-642a-3p 的表達(dá)能夠在一定程度上顯著增加多種NSCLC 細(xì)胞的體外生長、遷移和非錨定生長能力，這些結(jié)果與miR-642a-3p 的過表達(dá)結(jié)果趨勢相反，是對miR-642a-3p 結(jié)果的進(jìn)一步證實(shí)，也表明藻藍(lán)色素是能夠通過上調(diào)miR-642a-3p 的表達(dá)而抑制NSCLC 細(xì)胞的活性。

3 討論與結(jié)論

腫瘤是一種基因疾病，單核苷酸突變、拷貝數(shù)變異、插入/缺失等均會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)DNA 序列的改變從而引發(fā)腫瘤，因此腫瘤發(fā)生、發(fā)展跟基因的改變息息相關(guān)。腫瘤的發(fā)生與死亡率與日俱增，嚴(yán)重威脅到人類健康，近年來，隨著醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的改進(jìn)，高通量測序成為搜尋腫瘤標(biāo)志物的有力工具。通過細(xì)胞測序可以獲得大量信息，從而揭示腫瘤細(xì)胞與基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)之間的特殊關(guān)系，成為腫瘤治療中新方向[15]。肺癌在我國癌癥中的發(fā)病率和死亡率居高不下，非小細(xì)胞肺癌占比約85%，對于已經(jīng)進(jìn)入肺癌中晚期的患者來說傳統(tǒng)的手術(shù)和化療并不能有效提高生存率，因此靶向治療非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞就成了突破口，探索NSCLC 進(jìn)展的潛在機(jī)制，尋找潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)勢在必行[16]。

microRNA 是一種不編碼蛋白質(zhì)的微小RNA，在腫瘤細(xì)胞中起到關(guān)鍵調(diào)控功能，在具有廣泛配對互補(bǔ)的位點(diǎn)上，microRNA 可以通過與其靶向的mRNA 直接結(jié)合，催化mRNA 的裂解從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程[17]。許多microRNA 通過靶向mRNA 參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，如增殖分化等，這一發(fā)現(xiàn)可能成為癌癥治療干預(yù)的研究新方向[18]。microRNA 的這一機(jī)制現(xiàn)已在胃癌[19]、甲狀腺癌[20]、肝癌[21]、肺癌[22]等多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)其對腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在調(diào)控作用。

前期的研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選出一個(gè)潛在的調(diào)控因子miR-642a-5p，藻藍(lán)色素能夠上調(diào)miR-642a-5p 的表達(dá)從而抑制NSCLC 細(xì)胞的生長和遷移[23]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-642a-3p 同樣介導(dǎo)了藻藍(lán)色素的調(diào)控過程。miR-642a-5p 和miR-642a-3p是miRNA-642a 前體上2 個(gè)臂分別產(chǎn)生的2 條成熟miRNA，它們的堿基序列和細(xì)胞中的靶位點(diǎn)是不同的，因此具有不同的調(diào)控功能和機(jī)制。本研究的結(jié)果證實(shí)miR-642a-3p 和miR-642a-5p 都能夠參與藻藍(lán)色素抑制NSCLC 細(xì)胞活性的過程，這也是對藻藍(lán)色素調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步補(bǔ)充和完善。

綜上所述，本研究首先在4 種NSCLC 細(xì)胞（A549、H460、H1299 以 及A2）中驗(yàn)證了miR-642a-3p 的表達(dá)水平受到藻藍(lán)色素的調(diào)控，并通過在4 種細(xì)胞中過表達(dá)miR-642a-3p，測定細(xì)胞增殖能力、遷移以及體外非錨定生長能力，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-642a-3p 的表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞的活性，與藻藍(lán)色素的作用結(jié)果一致；相反，抑制miR-642a-3p 的表達(dá)也能在一定程度上增強(qiáng)細(xì)胞的活性。本研究表明藻藍(lán)色素能夠通過上調(diào)miR-642a-3p 的表達(dá)進(jìn)而抑制NSCLC 細(xì)胞的活性，這為食品功能因子藻藍(lán)色素的深度研究和利用提供了重要的理論依據(jù)。