高效液相色譜法測(cè)定椰汁中脫氫乙酸含量的不確定度評(píng)定

王攀峰

（山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心（山西省標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量技術(shù)研究院），山西太原 030012）

脫氫乙酸及其鈉鹽是聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）與世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）公認(rèn)的一種低毒、高效、廣譜的食品防腐劑，其對(duì)霉菌、酵母菌與細(xì)菌有著較強(qiáng)的抑制作用，在面包糕點(diǎn)、腌制蔬菜、果汁飲料及熟肉制品等食品加工與貯存過(guò)程中廣泛使用[1]。然而，部分食品生產(chǎn)企業(yè)超限量或超范圍使用脫氫乙酸，消費(fèi)者過(guò)量攝入后，會(huì)對(duì)其肝臟或腎臟造成影響，甚至存在致癌風(fēng)險(xiǎn)[2]?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[3]規(guī)定果蔬汁（漿）中脫氫乙酸及其鈉鹽的最大使用量為0.3 g·kg-1。為加強(qiáng)果汁飲料的日常監(jiān)管，準(zhǔn)確測(cè)定其中脫氫乙酸及其鈉鹽的含量，避免在測(cè)定結(jié)果接近臨界值時(shí)出現(xiàn)誤判情況，本研究依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[4]中規(guī)定的方法程序，對(duì)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）[5]中高效液相色譜法測(cè)定椰汁中脫氫乙酸含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定，分析影響測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵因素，以便提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，也為檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)在評(píng)估其他檢驗(yàn)項(xiàng)目測(cè)量不確定方面提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椰汁，購(gòu)自某超市；甲醇中脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 μg·mL-1），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇（色譜純），德國(guó)默克公司；甲酸（分析純），無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；硫酸鋅、氫氧化鈉（均為分析純），江蘇省亞泰集團(tuán)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器），美國(guó)賽默飛世爾公司；AL104電子天平（精度0.000 1 g），瑞士梅特勒-托利多公司；JL-SPE-12B固相萃取裝置，上海靳瀾儀器公司；C18固相萃取柱（500 mg/6 mL），常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）中第二法 液相色譜法進(jìn)行椰汁中脫氫乙酸含量的測(cè)定。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取1.0 mL甲醇中脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg·mL-1）置于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度為1 00 μg·mL-1的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確吸取1.0 mL脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水稀釋成10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別吸取0.10 mL、0.40 mL脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)中間液，0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL和1.0 mL脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于6個(gè)10 mL容量瓶中，用超純水定容，配制成濃度為0.1 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 試樣制備提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5 g（精確至0.000 1 g）椰汁試樣置于25 mL離心管中，加入10 mL超純水、5 mL硫酸鋅溶液（120 g·L-1），用氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）調(diào)節(jié)pH值至7.5，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，搖勻，置于離心管中，4 000 r·min-1離心10 min。移取20 mL上清液于25 mL容量瓶中，用10%的甲酸溶液調(diào)節(jié)pH值至5，用超純水定容至刻度。將C18固相萃取柱依次用5 mL甲醇、10 mL水活化，取5 mL試液過(guò)柱，再用5 mL水淋洗，2 mL 70%的甲醇溶液洗脫，收集2 mL洗脫液，渦旋混勻，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)測(cè)試。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：艾杰爾XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：10%甲醇+90% 0.02 mol·L-1乙酸銨（體積比）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；DAD檢測(cè)器：波長(zhǎng)293 nm。

1.4 數(shù)學(xué)模型建立

建立的數(shù)學(xué)模型見(jiàn)公式（1）。

式中：X為椰汁試樣中脫氫乙酸含量，g·kg-1；m為椰汁試樣稱(chēng)取質(zhì)量，g；V為試液總體積，mL；c1為待測(cè)試液中脫氫乙酸的濃度，μg·mL-1；c0為空白試液中脫氫乙酸的濃度，μg·mL-1；f為過(guò)固相萃取柱的換算系數(shù)，f=0.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源

從測(cè)定過(guò)程與數(shù)學(xué)模型來(lái)看，本試驗(yàn)中測(cè)量不確定度主要來(lái)源于試樣稱(chēng)量、試樣制備提取、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及測(cè)量重復(fù)性等過(guò)程。

2.2 測(cè)量不確定度分量評(píng)定

2.2.1 試樣稱(chēng)量過(guò)程引入的不確定度分量urel(m)

使用AL104電子天平稱(chēng)取2.500 0 g椰汁試樣，由檢定證書(shū)獲得示值誤差為±0.000 5 g，偏載誤差為±0.000 5 g，重復(fù)性誤差為±0.001 g，按正態(tài)分布考慮，則試樣稱(chēng)量過(guò)程引入的不確定度為

2.2.2 試樣制備提取引入的不確定度分量urel(V)

由數(shù)學(xué)模型可知，試樣制備提取引入的不確定度來(lái)自試液定容的總體積，定容過(guò)程使用25 mL單標(biāo)線容量瓶（A級(jí)），根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[6]獲得容量允差為±0.03 mL，20 ℃時(shí)容量校正引入的不確定度按矩形分布，依據(jù)公式（2）計(jì)算；實(shí)驗(yàn)溫差為±3 ℃，水膨脹系數(shù)為2.10×10-4℃-1，由實(shí)驗(yàn)室溫差產(chǎn)生的不確定度按矩形分布，依據(jù)公式（3）計(jì)算。由玻璃量器引入的相對(duì)不確定度依據(jù)公式（4）計(jì)算，求得urel(V)=0.000 78。

式中：ΔS表示玻璃量器的容量允差；V表示玻璃量器移取或定容試液的體積，mL。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度分量urel(c)

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液賦值。甲醇中脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液編號(hào)為91351A，批號(hào)為A22050324，標(biāo)準(zhǔn)溶液證書(shū)顯示相對(duì)擴(kuò)展不確定度為U=kurel(cb)=2%（k=2），則urel(cb)=2%/2=0.010 0。

（2）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制。吸取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液使用的1 mL分度吸量管（A級(jí)）的容量允差為±0.008 mL，定容使用的10 mL單標(biāo)線容量瓶（A級(jí)）的容量允差為±0.020 mL，依據(jù)公式（2）、（3）、（4）求得urel(V1)=0.004 63，urel(V10)=0.001 21，則該過(guò)程引入的相對(duì)不確定度為

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。標(biāo)準(zhǔn)中間液配制與儲(chǔ)備液配制過(guò)程所用玻璃量器相同，引入的相對(duì)不確定度urel(c2)=urel(c1)=0.004 79。標(biāo)準(zhǔn)工作液配制時(shí)6次使用1 mL分度吸量管（A級(jí)），6次使用10 mL單標(biāo)線容量瓶（A級(jí)），該過(guò)程引入的相對(duì)不確定度為

由此，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度分量urel(q)

將1.3.1中配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)試，測(cè)得峰面積分別為0.025 481、0.131 380、0.334 300、0.818 980、2.294 000和4.674 600。以脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程為Y=0.474 7c-0.084 0，其中b=0.474 7，a=-0.084 0。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度根據(jù)以下公式計(jì)算。

式中：n為標(biāo)準(zhǔn)工作液測(cè)試次數(shù)，n=6；p為椰汁試樣測(cè)試次數(shù)，p=6；測(cè)得椰汁試樣平均值為0.049 4 g·kg-1，代入數(shù)學(xué)模型中求得c=9.88 μg·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)工作液各濃度點(diǎn)的平均值=3.083 3 μg·mL-1。

計(jì)算得sR=0.049 96，u(q)=0.103 39 μg·mL-1，則

2.2.5 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度分量urel(s)

將椰汁試樣在期間精密度測(cè)量條件下測(cè)試6次，結(jié)果分別為0.049 5 g·kg-1、0.048 8 g·kg-1、0.049 8 g·kg-1、0.049 1 g·kg-1、0.049 7 g·kg-1和0.049 6 g·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.000 387，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 合成與擴(kuò)展不確定度

將各個(gè)相對(duì)不確定度分量進(jìn)行合成得

則標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度為u=0.049 4×0.020 1=0.000 99 g·kg-1。取包含因子k=2，置信概率p=95%，則測(cè)量擴(kuò)展不確定度U=ku=0.002 0 g·kg-1。因此，測(cè)量不確定度結(jié)果報(bào)告為（0.049 4±0.002 0）g·kg-1（k=2，p=95%）。

3 結(jié)論

通過(guò)分析評(píng)定高效液相色譜法測(cè)定椰汁中脫氫乙酸含量的測(cè)量不確定度，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程對(duì)測(cè)量結(jié)果影響較大，其次為測(cè)量重復(fù)性、試樣制備提取體積及試樣稱(chēng)量過(guò)程。因此，檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)相關(guān)部門(mén)要重視玻璃量器與大型儀器的計(jì)量檢定工作，并督促實(shí)驗(yàn)室做好標(biāo)準(zhǔn)溶液與儀器設(shè)備的期間核查工作。此外，還應(yīng)重視實(shí)驗(yàn)人員的職業(yè)水平培訓(xùn)，提升其實(shí)驗(yàn)操作水平技能與對(duì)大型儀器設(shè)備的維護(hù)能力，盡可能地降低測(cè)量不確定度，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。