醬醪葡萄球菌的篩選及其對高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵的影響

張 偉，王潔麗，林 琛，劉俊良，楊俊文，周 慧，2，周尚庭，蔣雪薇，2*

（1 長沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 長沙410114 2 湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心 長沙410600 3 加加食品集團(tuán)股份有限公司 長沙 410600）

醬油是歷史悠久且具備東方特色的傳統(tǒng)調(diào)味品，也是典型規(guī)模化生物制造的食品，主要由大豆、小麥經(jīng)微生物發(fā)酵釀造而成，具有咸鮮適口，醇香飽滿的特殊風(fēng)味[1-2]。醬油釀造是以微生物生命活動為基礎(chǔ)的復(fù)雜生物化學(xué)反應(yīng)過程，其中功能性微生物的相互協(xié)同作用決定了醬油的風(fēng)味與品質(zhì)[3]。2016 年起，我國規(guī)?；u油企業(yè)針對醬油產(chǎn)線開展了大規(guī)模的自動化甚至智能化的建設(shè)，封閉式、連續(xù)化的高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝取代了開放式、間歇化的曬露法和低鹽固態(tài)工藝[4]。該工藝雖較好地防控了開放式工藝帶來的有害微生物污染的風(fēng)險，但也減少了環(huán)境中功能性微生物的自然接種[5]，使醬香風(fēng)味形成緩慢，整體發(fā)酵周期較長，發(fā)酵鹽分高，嚴(yán)重影響了優(yōu)質(zhì)、健康醬油的產(chǎn)出[6-7]。因此，要在上述工藝條件下獲得風(fēng)味上乘的釀造醬油，從醬醪中篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的功能性風(fēng)味菌是提升醬油風(fēng)味及品質(zhì)的關(guān)鍵。

優(yōu)質(zhì)醬油的主體風(fēng)味特征表現(xiàn)為醬香濃郁、酯香醇香豐滿、滋味鮮美、酸感柔和且適口，其中酸感主要來源于醬油中以乳酸和乙酸為主的有機(jī)酸[8-9]，由產(chǎn)酸細(xì)菌代謝生成。耐鹽葡萄球菌是鹽漬發(fā)酵食品中常出現(xiàn)的產(chǎn)酸細(xì)菌，具有產(chǎn)酸、促進(jìn)游離氨基酸積累及護(hù)色增香等能力[10-11]。在中國傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)的腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）和木糖葡萄球菌（S.xylosus）能產(chǎn)生蛋白酶水解肌原蛋白，有助于可溶性蛋白和游離氨基酸的積累[12]。香腸發(fā)酵中分離的肉葡萄球菌（S.carnosus）可產(chǎn)生適量的硝鹽酸鹽還原酶，使香腸擁有更好的色澤[13]。由此可見，葡萄球菌能直接影響發(fā)酵肉制品的風(fēng)味及品質(zhì)。醬油發(fā)酵中也存在葡萄球菌[14]，而其分離篩選、菌種性能及在醬油發(fā)酵中的作用卻未見報告，亟待深入研究。本文從高鹽稀態(tài)醬醪中以產(chǎn)酸為指標(biāo)篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的葡萄球菌，并解析其對醬油的理化指標(biāo)、有機(jī)酸及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，為醬醪葡萄球菌在醬油釀造中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵15 d 的高鹽稀態(tài)醬醪，取自湖南某醬油廠，4 ℃保藏。

溴甲酚紫（分析純級），上海麥克林生化科技有限公司；草酸、乳酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸（均為色譜純級），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鋅、亞鐵氰化鉀（均為分析純級），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌16S rDNA PCR 試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

菌種分離培養(yǎng)基配方如下：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母膏3 g，檸檬酸氫二銨2 g，葡萄糖40 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂粉20 g，氯化鈉80 g，溴甲酚紫2 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5～6.8。

MRS 培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[15]配制。

1.3 儀器與設(shè)備

E200 顯微成像系統(tǒng)，尼康映像儀器（中國）有限公司；VERITI 梯度PCR 擴(kuò)增儀，美國應(yīng)用生物有限公司；DYY-12 電泳儀，北京市六一儀器廠；Champ Gel 5000 Plus 凝膠成像系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；ZWY-2102C 恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；PE28 pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Waters 2695型液相色譜儀，美國沃特世有限公司；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色譜柱，安捷倫科技（中國）有限公司；436GC/EVOQ TQ/PAL 氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Bruker Daltonics 公司；DB-5MS 色譜柱，美國Agilent 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取針，美國Supelco 公司。

1.4 方法

1.4.1 醬醪葡萄球菌的分離 取發(fā)酵15 d 的高鹽稀態(tài)醬醪，用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋制成菌懸液，吸取0.1 mL 菌懸液涂布于菌種分離培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2～5 d，挑選菌落周圍變黃色的菌落進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，挑出革蘭氏染色陽性的球菌，在高鹽MRS 培養(yǎng)基（160 g/L NaCl）上多次分離純化，獲得純種菌株。

1.4.2 醬醪葡萄球菌的篩選 將分離純化后耐鹽生長良好的菌株接種至含160 g/L NaCl 的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)60 h，取5 mL 發(fā)酵液離心取上清測定pH 值，初步篩選出發(fā)酵液pH<4.5 的菌株。取初篩菌株的發(fā)酵液2 mL，利用0.22 μm 水系膜進(jìn)行過濾，液相色譜分析其乳酸含量，篩選出產(chǎn)乳酸含量大于2 g/L 的菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。液相色譜條件：流動相為0.1%磷酸水溶液-甲醇（19 ∶1，體積比），流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 L，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為210 nm，柱溫30 ℃。

1.4.3 醬醪葡萄球菌的鑒定

1.4.3.1 16S rDNA 序列分析 采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取耐鹽葡萄球菌的模板DNA，并進(jìn)行PCR；PCR 體系如下：葡萄球菌DNA 模板2 μL，細(xì)菌通用引物1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）和27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）各2 μL，Taq 聚合酶1 μL，dNTP 4 μL，MgCl2溶液3 μL，10×PCR Buffer 5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR 條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃最終延伸10 min，4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠檢測。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司長沙分公司完成。測序結(jié)果在NCBI 庫進(jìn)行同源性比對，并通過MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.3.2 生理生化特性 將篩選得到的菌株參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]進(jìn)行糖發(fā)酵以及精氨酸雙水解酶試驗(yàn)。

1.4.4 菌種高鹽稀態(tài)發(fā)酵 將成品曲與230 g/L的鹽水按料液比1∶2 混合制成鹽質(zhì)量濃度為160 g/L 的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪，28 ℃下進(jìn)行為期60 d的發(fā)酵。將篩得的菌株制成107CFU/mL 的菌懸液，于發(fā)酵第15 天添加至高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪中，添加量為5%，以不添菌的醬醪為對照組。發(fā)酵結(jié)束后，利用300 目濾布壓榨醬醪獲得醬油。

1.4.5 醬油還原糖、氨態(tài)氮及總酸的測定 還原糖含量測定參照GB 5009.7-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中的還原糖測定》[17]；總酸、氨態(tài)氮含量測定參照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[18]。

1.4.6 醬油有機(jī)酸的測定 取2 mL 發(fā)酵液，5 mL 硫酸鋅溶液（30 g/L），5 mL 亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）混合定容至100 mL，靜置30 min 后離心，取上清液用0.22 μm 水系膜過濾，液相色譜分析其6 種有機(jī)酸含量，液相色譜條件同1.4.2 節(jié)。

1.4.7 醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定 參考張偉等[19]的GC-MS 方法進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性和定量檢測。

1.4.8 醬油感官評分 參考張偉等[19]關(guān)于釀造醬油感官評價的方法對發(fā)酵后的醬油進(jìn)行感官評分。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26 軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析（P<0.05）；利用Excel 2019 及Origin 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬醪葡萄球菌的篩選

醬醪葡萄球菌是高鹽稀態(tài)醬醪中可代謝糖類生成有機(jī)酸的一類產(chǎn)酸細(xì)菌，其代謝生成的有機(jī)酸可賦予醬油酸感，抑制醬醪發(fā)酵污染菌的生長，還可作為醬油酯類物質(zhì)的前體物[20]，影響著醬油的風(fēng)味和品質(zhì)。獲得葡萄球菌的純培養(yǎng)菌株是其應(yīng)用于高鹽發(fā)酵食品的基礎(chǔ)。對發(fā)酵前期的高鹽稀態(tài)醬醪采樣分離醬醪葡萄球菌，獲得了34 株形態(tài)與葡萄球菌屬相似的菌株，將其命名為JL04～JL37。利用高鹽MRS 培養(yǎng)基（160 g/L NaCl）多次傳代培養(yǎng)，獲得了14 株耐鹽生長穩(wěn)定的菌株。

葡萄球菌能利用可發(fā)酵糖生成乳酸、乙酸、琥珀酸等有機(jī)酸[21]。有機(jī)酸解離出氫離子，致使發(fā)酵液pH 值降低，可以通過測定發(fā)酵液pH 值初步判斷葡萄球菌的產(chǎn)酸能力。從圖1a 可以看出，14 株菌發(fā)酵60 h 后發(fā)酵液pH 值降低至4.5 以下的菌株有7 株，其中pH 值最低的菌株為JL04，其發(fā)酵液pH<4.0；pH 在4.0～4.5 的菌株有6 株，分別為JL05、JL10、JL11、JL15、JL16、JL17。醬油發(fā)酵對氧的需求不高，產(chǎn)酸細(xì)菌在醬醪局部厭氧環(huán)境中易積累酸感柔和的乳酸，能使醬油口感更加爽朗、綿長，對醬油的風(fēng)味有增益作用，因此，以乳酸積累能力為指標(biāo)，對上述7 株菌進(jìn)行復(fù)篩，獲得3 株乳酸積累大于2 g/L 的菌株JL04、JL15、JL17 進(jìn)入后續(xù)鑒定，其乳酸含量分別為2.04，2.02 g/L 和2.42 g/L（圖1b）。

圖1 醬醪葡萄球菌的篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of Staphylococcus in moromi

2.2 菌種鑒定

3 株菌鏡檢為革蘭氏陽性球菌，其菌體形態(tài)主要呈現(xiàn)葡萄串狀聚集（圖2a）。16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2b）顯示3 株菌均屬于葡萄球菌屬。同時為了更加準(zhǔn)確地判斷3 株醬醪葡萄球菌的種屬，以葡萄球菌屬模式種金黃色葡萄球菌（S.aureus）為對照，選擇特異性的生理生化試驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充鑒定，結(jié)果見表1。從表1 可以看出，JL04 只能利用果糖、半乳糖和甘露醇；JL15 和JL17 均可利用蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、海藻糖和甘露醇，但JL15 對半乳糖的利用較弱。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中葡萄球菌屬的生理生化特性[22]，結(jié)合NCBI 比對結(jié)果最終鑒定JL04 為香料葡萄球菌（S.comdimenti）、JL15 為魚發(fā)酵葡萄球菌（S.piscifermentans）、JL17 為肉葡萄球菌（S.carnosus）。

表1 3 株菌的生理生化特性Table 1 Biochemical properties of the three strains

圖2 3 株菌的鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of the three strains

2.3 3 株醬醪葡萄球菌對醬油發(fā)酵的影響

2.3.1 3 株醬醪葡萄球菌對醬油理化指標(biāo)的影響

醬油發(fā)酵過程中還原糖、氨態(tài)氮和總酸含量的變化反映了醬油基礎(chǔ)風(fēng)味的變化，是釀造醬油重要的質(zhì)量指標(biāo)[23]。醬油發(fā)酵前期米曲霉產(chǎn)生的淀粉酶活力較高，促使淀粉質(zhì)原料快速水解，此時還原糖的積累速率大于醬醪微生物的消耗速率，使得醬油中還原糖的含量呈現(xiàn)先升高的趨勢，較高的還原糖含量有利于醬醪微生物的生長和代謝，莊婉菁等[24]研究表明醬油釀造過程中還原糖含量在10～20 d 之間達(dá)到峰值，故選擇在發(fā)酵15 d 的高鹽稀態(tài)醬醪中分別添加3 株葡萄球菌進(jìn)行為期60 d 的短周期發(fā)酵，考察3 株葡萄球菌在醬油發(fā)酵中的作用，以不加菌發(fā)酵的醬油為對照組，測定醬油發(fā)酵過程中理化指標(biāo)，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵過程中醬醪理化指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of physicochemical indicators during the moromi fermentation

由圖3 可知，發(fā)酵0～15 d，由于還未添加葡萄球菌，4 個醬油樣品的還原糖、總酸及氨態(tài)氮含量與對照組含量相近，變化趨勢一致。在發(fā)酵第15天分別添加了3 株葡萄球菌后，15～30 d 內(nèi)添加了3 株葡萄球菌發(fā)酵的醬油還原糖降低速率明顯大于對照組，可見添加葡萄球菌發(fā)酵加速了醬油中還原糖的利用，同時其總酸積累速率也均大于對照組，說明葡萄球菌的添加有利于促進(jìn)醬油中還原糖向有機(jī)酸轉(zhuǎn)化；此外，醬油的氨態(tài)氮積累速率也明顯高于對照組，這是由于葡萄球菌能分泌少量的蛋白酶可促進(jìn)蛋白質(zhì)原料水解，進(jìn)而促進(jìn)了醬油中氨態(tài)氮的積累，此時間段內(nèi)添加JL17 發(fā)酵的醬油氨態(tài)氮積累速率最快，相比另外2 株葡萄球菌在促進(jìn)醬油氨態(tài)氮積累上更具優(yōu)勢。發(fā)酵30～60 d 內(nèi)，有機(jī)酸的持續(xù)積累使得醬醪pH 值逐漸降低，抑制了米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶和淀粉酶的酶活性，使得還原糖的消耗速率大于產(chǎn)生速率，還原糖含量減少呈下降趨勢，且總酸和氨態(tài)氮的積累速率也逐漸變緩。發(fā)酵60 d 結(jié)束時，添加了菌株JL04、JL15、JL17 發(fā)酵的醬油中還原糖含量雖與對照組無顯著差異，但總酸和氨態(tài)氮的含量均高于對照組，其總酸含量分別為15.61，15.10，15.42 g/L，相比對照組提升了8.40%，4.86%，7.08%；氨態(tài)氮含量分別為9.12，9.02 g/L 及9.31 g/L，較對照組提升了1.90%，0.78%，4.02%，可見添加3 株葡萄球菌的添加發(fā)酵有助于提升醬油總酸及氨態(tài)氮的含量，進(jìn)而有助于增進(jìn)醬油酸感和鮮味。

2.3.2 3 株醬醪葡萄球菌對醬油主要有機(jī)酸的影響 醬油中主體有機(jī)酸的構(gòu)成為乳酸和乙酸，還存在少量的琥珀酸、富馬酸、檸檬酸等，除了賦予醬油爽口的酸感，還是醬油中乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸高級醇酯、乳酸高級醇酯等酯類物質(zhì)的前體物，是醬油獨(dú)特滋味與香氣形成的重要組成成分，因此其含量是影響醬油風(fēng)味及品質(zhì)的重要因素[25]。為考察葡萄球菌對醬油重要有機(jī)酸的影響，利用高效液相色譜對醬油中的L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和富馬酸6 種常見的有機(jī)酸進(jìn)行分析[26]，其結(jié)果見圖4。由圖4 可知，添加JL04、JL15、JL17 發(fā)酵的醬油中6 種有機(jī)酸的總含量分別為9.78，8.83 g/L 及8.96 g/L，相比對照組分別提升了37.53%，24.06%及25.90%。添加3 株菌發(fā)酵主要影響了醬油中乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸的含量。添加JL04 和JL15 發(fā)酵能顯著提升醬油中乳酸、乙酸、琥珀酸含量。添加JL04 發(fā)酵的醬油中乳酸、乙酸和琥珀酸的含量分別比對照組提高了32.64%，44.70%和202.99%，而JL15 對乳酸、乙酸、琥珀酸的提升弱于JL04，相比對照組分別提高了22.28%，6.91%及191.04%。與JL04 和JL15相比，JL17 雖不能促進(jìn)醬油中琥珀酸的積累，但能促進(jìn)醬油中檸檬酸的積累，其添加發(fā)酵的醬油中檸檬酸含量較對組組提升了39.17%。綜合而言，3株葡萄球菌均有促進(jìn)醬油中有機(jī)酸積累的作用。

圖4 醬油6 種有機(jī)酸含量熱圖Fig.4 Heat map of six organic acid content in soy sauce

2.3.3 3 株醬醪葡萄球菌對醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響 為了解析醬醪葡萄球菌對釀造醬油香氣的影響，利用GC-MS 分析3 組添菌發(fā)酵60 d 的醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量，以未添菌醬油為對照組，結(jié)果見表2。所有醬油中共檢測出53 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，3 株菌對醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量均有一定的提升作用，以酯類和醇類物質(zhì)提升最為顯著。

酯類物質(zhì)是醬油中關(guān)鍵的主體香氣物質(zhì)。從表2 可以看出，添加JL04、JL15 及JL17 發(fā)酵的醬油中檢出的酯類物質(zhì)分別為15，16 種及14 種，較對照組分別增加了3，4 種及2 種，其酯類物質(zhì)含量比對照組提升了116.09%，95.60%及111.03%，表明3 株菌的添加能促進(jìn)酯類物質(zhì)的生成，增加了醬油酯類風(fēng)味物質(zhì)的含量及豐富度。高鹽稀態(tài)醬油中酯類風(fēng)味物質(zhì)的合成主要是微生物利用醬醪中的有機(jī)酸和醇類物質(zhì)酯化作用的結(jié)果[27]，3株菌在高鹽稀態(tài)發(fā)酵中良好的有機(jī)酸積累能力是促進(jìn)酯類風(fēng)味物質(zhì)形成的重要因素。3 株菌代謝的有機(jī)酸主要為乙酸和乳酸，乳酸和乙酸含量的提升使得醬油中乙酸酯類和乳酸酯類物質(zhì)均有明顯提升，其中乙酸酯類物質(zhì)為乙酸乙酯（水果香）和乙酸苯乙酯（花香）。乙酸乙酯的含量相比對照組分別增加了169.60%，64.12%及160.17%，而乙酸苯乙酯在對照組中未檢出，可見葡萄球菌的加入促進(jìn)了乙酸和苯乙醇的酯化，進(jìn)而促進(jìn)了乙酸苯乙酯的生成；檢出的乳酸酯類物質(zhì)為甜奶油香的乳酸乙酯和乳酸異丙酯，相比對照組均有一定的提升。可見添加葡萄球菌發(fā)酵的醬油中小分子酯類物質(zhì)含量明顯增加，有利于提升醬油的酯香，促進(jìn)醬油形成花果香為特征的前香和主體香。此外，從添加3 株菌發(fā)酵的醬油中還檢出了十一酸乙酯、十五酸乙酯等高級脂肪酸乙酯，這些物質(zhì)并未在對照組中檢出，表明葡萄球菌可能存在促進(jìn)高級脂肪酸生成的能力，進(jìn)而促進(jìn)高級脂肪酸酯的形成。

添加3 株葡萄球菌的發(fā)酵醬油中檢出的醇類物質(zhì)種類分別為12，11 種和10 種，含量分別為2 126.84，2 011.91，1 988.20 μg/L，相比對照組在種類（10 種）和總含量（2 064.58 μg/L）上并無明顯差異，而不同的醇類物質(zhì)間存在顯著差異。檢出的醇類物質(zhì)主要為乙醇和苯乙醇，其含量相比對照組有明顯的減少，且與乙酸乙酯和乙酸苯乙酯的生成呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明添加葡萄球菌發(fā)酵促進(jìn)了乙酸與乙醇及苯乙醇的酯化。此外，異丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醇、2，3-丁二醇、3-甲硫基丙醇相比對照組有明顯增加，這些醇類具備果香、麥芽香等香氣特性，彌補(bǔ)了乙醇和苯乙醇含量減少而損失的香氣。添加3 株菌發(fā)酵的醬油雖在酮類物質(zhì)種類上均無明顯差異，但添加JL04 發(fā)酵的醬油酮類物質(zhì)含量較對照組提升了5.18 倍，其主體的酮類物質(zhì)為煙熏香的4-羥基-3-甲氧基苯乙酮（香草酮）和油脂香的3-庚酮。4 種發(fā)酵醬油中檢出的揮發(fā)性酸類物質(zhì)較少，含量最高的揮發(fā)性酸為乙酸，相比對照組雖有一定程度地提升，但檢出的含量為微克每升級別，這是由于檢測方式造成的差異，乙酸含量應(yīng)以上述液相色譜定量為準(zhǔn)。醛類、酚類及雜環(huán)類物質(zhì)在添菌醬油中檢出的種類和含量與對照無明顯差異，表明3 株葡萄球菌對這幾類揮發(fā)性物質(zhì)的影響較小。

2.3.4 感官評分 為了進(jìn)一步明確3 株葡萄球菌對醬油風(fēng)味及品質(zhì)的影響，對其添加發(fā)酵后的醬油進(jìn)行感官評分，結(jié)果見圖5。添加3 株菌發(fā)酵的醬油在香氣和滋味較對照組均有明顯提升，添加JL04 發(fā)酵的作用最明顯，其發(fā)酵的醬油香氣和滋味評分相比對照組分別提升了19.19%和26.92%，醬油的感官特征為酯香濃郁、酸鮮適口、口感清爽。4 組醬油在顏色和體態(tài)方面沒有明顯差異。感官評價的結(jié)果表明3 株葡萄球菌對醬油的香氣、滋味及整體風(fēng)味有著明顯的增益效果。

圖5 添加3 株葡萄球菌發(fā)酵醬油的感官評分Fig.5 Sensory evaluation of soy sauce added with the three Staphylococcus

3 結(jié)論

本研究從高鹽稀態(tài)醬醪中篩選獲得了3 株產(chǎn)酸性能優(yōu)良葡萄球菌JL04（S.comdimenti）、JL15（S.piscifermentans）、JL17（S.carnosus）。將3 株葡萄球菌添加至高鹽稀態(tài)醬醪中進(jìn)行發(fā)酵研究，與未添加葡萄球菌對照組進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)添加葡萄球菌發(fā)酵可明顯提高高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的氨態(tài)氮、總酸，對醬油的鮮味及酸感有良好的貢獻(xiàn)；醬油中常見的6 種有機(jī)酸定量分析結(jié)果顯示添加JL04、JL15、JL17 發(fā)酵的醬油中其總含量分別為9.78，8.83 g/L 及8.96 g/L，相比對照組分別提高了37.53%，24.06%及25.90%；含量增加的有機(jī)酸主要是乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，其與醬油中乙醇、苯乙醇等醇類物質(zhì)成酯，進(jìn)而促進(jìn)了醬油酯類風(fēng)味物質(zhì)的形成，其含量相比對照組分別提高了116.09%，95.60%及111.03%，其中乙酸酯類、乳酸酯類及琥珀酸酯類的提升較為明顯，與相應(yīng)的有機(jī)酸含量增加呈正相關(guān)；此外，感官評分的結(jié)果也顯示3 株葡萄球菌對醬油的香氣、滋味有明顯的增益作用。綜上，醬醪中篩選的3 株葡萄球菌可以通過增加醬油發(fā)酵中有機(jī)酸的積累而增加酯類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，具有作為風(fēng)味菌在醬油釀造中應(yīng)用的良好潛力。