8 種單烷基酚類香料對大腸桿菌的抑制機理

韓 帥，孫潔雯，劉玉平，孫寶國

（北京工商大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院 北京 100048）

防腐抑菌是食品加工過程中需要面臨的一個重要問題，為此人們一直在尋找高效、安全的食品用防腐劑。目前研究的防腐劑有天然植物提取物[1-2]、動物提取物[3-4]、微生物提取物等[5-6]，其中天然植物提取物由于來源廣泛，使用歷史悠久，因此研究較多[7]。隨著分析技術(shù)的快速發(fā)展，提取物中的關(guān)鍵抑菌成分被分離與鑒定出來，有的被批準(zhǔn)用作食品防腐劑，如從肉桂油中分離出的肉桂醛是我國允許使用的防腐劑[8]。近年來香料化合物的防腐抑菌效果引起科研人員的關(guān)注。如許宇航等[9]研究了10 種硫醚類香料對2 種致病菌的抑制效果，周倩倩等[10]考察了9 種異硫氰酸酯類香料化合物對兩種革蘭氏陰性致病菌的抑制能力，梅佳林等[11]研究了芳樟醇對源于三文魚的莓實假單胞菌的抑制效果，耿一鳴等[12]評價了松油烯-4-醇對熒光假單胞菌的抑制效果。

酚類香料化合物廣泛存在于自然界植物中，如丁香酚存在于丁香葉油（含量在80%左右[13]），錫蘭肉桂油（含量在60%左右[14]）中，百里香酚存在于百里香油（含量在30%～50%[15]），墨西哥牛至油（含量在37%[16]）中。雖然酚類食用香料化合物的數(shù)量不多，但是它們大多具有防腐抑菌活性；如孫潔雯等[17]對23 種酚類香料化合物的抑菌活性進行了評價，結(jié)果表明它們具有一定的抑菌活性，且抑菌活性與酚的苯環(huán)上所連取代基有一定的關(guān)系。王江來等[18]評價了香芹酚和丁香酚對腐皮鐮刀菌的抑菌活性，并對它們的抑菌機理進行研究，結(jié)果表明它們能抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)，破壞細胞膜的完整性和通透性。通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)對酚類香料的防腐抑菌活性的研究主要集中在百里香酚、丁香酚及它們與其它香料化合物聯(lián)用的效果評價[18-19]。

在研究防腐劑的抑菌機理時多數(shù)是針對一種提取物[3]、單一抑菌劑[5]、一種或兩種香料化合物[11，18-19]。常采用的方法是通過測定防腐劑對供試菌生長曲線、細胞膜通透性、細胞膜完整性、形態(tài)等產(chǎn)生的影響[3，5，10，20]，進而判斷防腐劑的抑菌機理。目前尚未見研究系列酚類香料化合物的抑菌機理的文獻報道。本文通過測定受試菌經(jīng)酚類香料處理前后生長曲線、細胞膜的通透性和微觀結(jié)構(gòu)的變化，研究我國允許使用的8 種單烷基酚類香料的抑菌機理，為利用單烷基酚類香料化合物開發(fā)新的防腐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli），中國科學(xué)院普通微生物菌種保藏中心。

3 個甲基酚（鄰、間、對甲酚）、1，2-丙二醇、無水乙醇、叔丁醇、氯化鈉，北京伊諾凱科技有限公司；2 個乙基酚（2-乙基酚和4-乙基酚）、3 個丙基酚（2-丙基酚、2-異丙基酚、4-丙基酚）、4-苯基苯酚、乙萘酚，北京百靈威科技有限公司；戊二醛，SPI 試劑有限公司；PBS 緩沖液，賽默飛世爾生物制品有限公司；牛肉膏、蛋白胨（用于制備培養(yǎng)基），北京澳博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ALPHA1-4LD plus 型真空冷凍干燥機，Christ儀器有限公司；DDS-307 型電導(dǎo)率儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DL-CJ-1ND-Ⅱ型無菌超凈工作臺，東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；R9A 型高速離心機，HITACHI 儀器有限公司；S-4800 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；T-403 型電子分析天平，賽多力斯儀器有限公司；YX-280D 型手提蒸汽壓力滅菌鍋，合肥市華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；ZWY-100H 型恒溫搖床，上海智城分析儀器公司；752 型紫外分光光度計，上海恒平科學(xué)儀器公司。

1.3 培養(yǎng)基、菌懸液和酚類食用香料溶液的制備

參照文獻[17]的方法制備液體培養(yǎng)基和菌懸液，配置8 種酚類食用香料溶液，測定酚類香料的最小抑菌濃度（MIC）。

1.4 方法

1.4.1 8 種單烷基酚類食用香料對大腸桿菌生長曲線的影響 將受試菌進行活化，接入液體培養(yǎng)基，在恒溫條件下振蕩培養(yǎng)，使受試菌處于對數(shù)期，用該時期的菌液作為試驗中的原菌液。用經(jīng)過無菌處理的生理鹽水把1 mL 的原菌液稀釋成104～105CFU/mL 的菌懸液備用。首先把菌懸液加入到營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，然后再加入單烷基酚類香料稀釋液，使其質(zhì)量濃度達到MIC，在37℃、168～172 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，間隔1 h 取樣品，用紫外分光光度計在波長600 nm 處測其OD 值，繪制生長曲線，另設(shè)以含菌液體培養(yǎng)基中添加GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中允許使用的酚類香料防腐劑稀釋液（乙萘酚、4-苯基苯酚）為對比組，不添加酚類香料的含菌培養(yǎng)基為對照組，研究單烷基酚類香料對受試菌生長曲線的影響程度。

1.4.2 8 種單烷基酚類食用香料對大腸桿菌細胞膜的影響

1.4.2.1 8 種單烷基酚類食用香料對大腸桿菌胞內(nèi)離子外泄的影響 將活化后的供試菌接入到100 mL 的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，離心后棄上清液，收集菌體，用無菌生理鹽水進行清洗，重復(fù)3 次。將收集到的菌體重懸于100 mL 0.1 mol/L 的PBS 緩沖液中，稀釋成104～105CFU/mL 的菌懸液。向菌懸液中加入單烷基酚類香料使其質(zhì)量濃度達到MIC，混勻后立即取3 mL 離心，用電導(dǎo)率儀測定上清液的電導(dǎo)率。剩余菌懸液繼續(xù)培養(yǎng)14 h，期間每隔2 h 取樣、離心、測定上清液電導(dǎo)率。同時設(shè)不加入單烷基酚類香料的對照組，測定其電導(dǎo)率，考察受試菌內(nèi)部金屬離子滲出情況隨單烷基酚類香料處理時間的變化趨勢。

1.4.2.2 細胞溶出物的測定 將活化后的菌種接入到100 mL 的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，離心后棄上清液，收集菌體，用無菌生理鹽水重復(fù)清洗 3 次。將收集的菌體重懸于100 mL 0.1 mol/L 的PBS 緩沖液中，稀釋成濃度為104～105CFU/mL 的菌懸液。向菌懸液中加入單烷基酚類食用香料至不同的質(zhì)量濃度（0，MIC，2MIC），37 ℃下振蕩培養(yǎng)8 h 后取樣5 mL，在9 000 r/min 下離心8 min，取4 mL 上清液在波長260 nm 處測定吸收值，另設(shè)2 組平行試驗組，所得結(jié)果為3 次平均值。分別用含有相同質(zhì)量濃度單烷基酚類香料的0.1 mol/L PBS 緩沖液接觸菌體2 min，離心取上清液測定OD260nm校正試驗組；同時用0.1 mol/L PBS緩沖液接觸菌體2 min，離心取上清液測定OD260nm校正對照組。

1.4.3 大腸桿菌經(jīng)單烷基酚類食用香料處理前、后菌體超微結(jié)構(gòu)的變化 采用掃描電鏡，對大腸桿菌經(jīng)過酚類香料處理前后的超微結(jié)構(gòu)進行對比，具體方法如下：

1）取樣 將大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，用營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基稀釋成104～105CFU/mL 的菌懸液。向培養(yǎng)基中加入酚類食用香料至MIC，制成含藥培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)7～8 h 后，取200 mL 樣品4℃下6 000 r/min 離心10 min 收集菌體，用PBS 緩沖液重復(fù)清洗3 次。取等量菌懸液添加到不含藥的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中作為對照組。

2）固定 加入2.5%的戊二醛固定液，在0～4℃的條件下靜置固定6 h，離心后棄上清液，用PBS 緩沖液清洗2 次，再用高純水清洗3 次，每次15 min。

3）梯度脫水 配制質(zhì)量分數(shù)梯度為30%，50%，70%，80%，90%和95%的乙醇水溶液，對菌體進行梯度脫水，每個梯度脫水1 次，每次15 min，再用100%乙醇脫水2 次，每次15 min；再用乙醇和叔丁醇體積比為1∶1 的混合液對樣品進行脫水15 min；最后用叔丁醇對樣品脫水2 次，每次15 min。在整個過程中，每進行一步后均需7 000 r/min 離心8 min，棄上清液后收集菌體再加入下一種試劑。

4）冷凍干燥 將處理好的樣品放在-80 ℃的冰箱中預(yù)凍30 min，之后再放入真空冷凍干燥機中繼續(xù)進行冷凍干燥3 h。

5）噴金 用離子濺射鍍膜機對已經(jīng)處理好的干燥測試樣品噴金，使用場發(fā)射掃描電鏡進行觀察。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，對所得數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單烷基酚類食用香料對大腸桿菌生長曲線的影響

參照文獻[17]的方法，測得8 種單烷基酚類香料的MIC 分別為鄰甲酚和間甲酚的MIC 是0.781 mg/mL，對甲酚、2-乙基酚和4-乙基酚的MIC 是0.391 mg/mL，2-丙基酚、2-異丙基酚和4-丙基酚的MIC 是0.195 mg/mL，4-苯基苯酚、乙萘酚的MIC 是0.391 mg/mL。將8 種單烷基酚類食用香料分別配制成質(zhì)量濃度為MIC 的培養(yǎng)基，加入菌懸液后進行培養(yǎng)，考察單烷基酚類香料對受試菌生長曲線的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 單烷基酚類食用香料對受試菌生長曲線的影響Fig.1 The effects of monoalkylphenol edible flavor on growth curves of Escherichia coli

從圖1 可知，在1～3 h 時，經(jīng)單烷基酚類香料處理后的受試菌生長曲線與對照組相比雖有細微變化，但無明顯差異，表明此段時間，單烷基酚類香料對受試菌的生長無明顯影響。3～5 h 后，可以看出經(jīng)不同單烷基酚類香料處理過的受試菌的生長曲線有了明顯的變化：其中經(jīng)4-丙基苯酚、4-乙基苯酚、2-異丙基苯酚、間甲酚處理的試驗組OD600nm吸收值與對照組相比明顯減小，且4-丙基苯酚對大腸桿菌的影響程度最大。進入6～9 h，之前抑菌效果較好的間甲酚對大腸桿菌生長曲線的影響減弱，而4-丙基苯酚、2-異丙基苯酚、4-乙基苯酚對大腸桿菌生長曲線的影響作用仍較大。9 h以后，與對照組相比試驗組進入穩(wěn)定期的時間均有不同程度的縮短。此外，4-丙基苯酚試驗組OD600nm最大吸收值大約為對照組的一半（與乙萘酚的接近），說明4-丙基苯酚對其生長曲線的影響顯著。從整圖來看，GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中允許適用的防腐劑乙萘酚對大腸桿菌生長曲線影響優(yōu)于單烷基酚，而4-苯基苯酚則對大腸桿菌生長曲線影響較弱。

對比所得結(jié)果還可以發(fā)現(xiàn)單烷基酚類香料對受試菌生長曲線的影響與單烷基酚類食用香料的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系；3 種甲酚對大腸桿菌生長曲線的影響接近；而乙基酚和丙基酚中乙基和丙基在4 位時對大腸桿菌生長曲線的影響要大于乙基和丙基在2 位時的影響；烷基的位置相同時，丙基的效果要大于乙基的效果。

2.2 單烷基酚類食用香料對大腸桿菌細胞膜的影響

2.2.1 單烷基酚類食用香料對大腸桿菌胞內(nèi)離子外泄的影響 通過電導(dǎo)率儀測定8 種單烷基酚類食用香料處理大腸桿菌后其菌懸液上清液的電導(dǎo)率，來確定大腸桿菌胞內(nèi)離子外泄的程度，所得結(jié)果如圖2 所示。

圖2 單烷基酚類食用香料對大腸桿菌胞內(nèi)離子外泄的影響Fig.2 The effects of monoalkylphenol edible flavors on intracellular ion leakage of Escherichia coli

由圖2 可知，受試菌經(jīng)過單烷基酚類香料處理后胞內(nèi)離子外泄程度均高于對照組，且電導(dǎo)率雖均成上升趨勢，但也有不同程度的差異：鄰甲酚和間甲酚作用后的大腸桿菌上清液的電導(dǎo)率上升趨勢較其它單烷基酚類緩慢，與對照組無明顯差異；對甲酚和2-乙基苯酚電導(dǎo)率變化數(shù)值和變化趨勢均相近，且高于鄰甲酚和間甲酚；試驗所考查的時間范圍內(nèi)的前期，2-異丙基苯酚處理后的大腸桿菌胞內(nèi)離子外泄略高于4-乙基苯酚和4-丙基苯酚，而4-乙基苯酚和4-丙基苯酚的增長速度快于2-異丙基苯酚，使得后期，兩者處理后的菌種上清液的電導(dǎo)率高于2-異丙基苯酚，且其中的4-乙基苯酚在8 種單烷基酚類食用香料中，作用大腸桿菌后的上清液電導(dǎo)率最大；而經(jīng)比較組乙萘酚和4-苯基苯酚處理后的大腸桿菌上清液的電導(dǎo)率處于中間位置，其菌種上清液電導(dǎo)率最終數(shù)值低于4-乙基苯酚、4-丙基苯酚和2-異丙基苯酚。從整體上來看，隨著單烷基酚類化合物作用時間延長，與對照組電導(dǎo)率間的差異也愈大。

單烷基酚類食用香料對大腸桿菌的最小抑菌濃度不同，所以試驗中添加的量不同；如果將這個因素考慮進去就會發(fā)現(xiàn)，添加單烷基苯酚后大腸桿菌的菌懸液上清液的電導(dǎo)率的大小順序與單烷基苯酚的結(jié)構(gòu)有關(guān)，其中丙基苯酚>乙基苯酚>甲基苯酚。在烷基相同的條件下，4-烷基苯酚>2-烷基苯酚。

2.2.2 細胞溶出物的測定 如果細胞膜受到防腐劑的破壞后，Na+、K+等離子會泄漏出來，RNA 和DNA 等大分子物質(zhì)也會泄漏出來，采用紫外分光光度計測定時大分子物質(zhì)在波長260 nm 處有吸收，因此可利用測定OD260nm吸收值得方來判斷細胞內(nèi)大分子物質(zhì)的外泄程度，進一步確定細胞膜受防腐劑的損壞程度。采用不同質(zhì)量濃度的單烷基酚類香料分別處理大腸桿菌，然后測定菌體培養(yǎng)基上清液在波長260 nm 處的吸收值，進而判斷細胞內(nèi)容物的泄漏程度，所的結(jié)果見表1。

表1 單烷基酚類香料對大腸桿菌細胞溶出物釋放量的影響Table 1 The effects of monoalkylphenol edible flavors on cell constituents' release of Escherichia coli

由表1 可知，隨著單烷基酚類香料質(zhì)量濃度增大，細胞溶出物的釋放量雖都呈現(xiàn)上升趨勢，但上升幅度有所差別。細胞溶出物的釋放量依次為甲基酚<乙基苯酚<丙基苯酚，而甲基酚中，經(jīng)對甲酚處理后細胞溶出物釋放量大于鄰甲酚和間甲酚。乙基苯酚中，經(jīng)4-乙基苯酚處理的細胞溶出物釋放量大于2-乙基苯酚。經(jīng)丙基苯酚處理后的細胞溶出物釋放量依次為2-丙基苯酚<4-丙基苯酚<2-異丙基苯酚，且大腸桿菌經(jīng)2-異丙基苯酚處理后細胞溶出物釋放量大于作為對比參照的乙萘酚。大腸桿菌經(jīng)另一作為參照的4-苯基苯酚處理后，細胞溶出物釋放量小于大多數(shù)單烷基酚類香料處理后的釋放量。

對比以上結(jié)果可知，單烷基酚類食用香料使大腸桿菌內(nèi)溶物外泄量的多少與酚的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，即丙基苯酚的作用后外泄量大于乙基苯酚的效果，乙基苯酚的效果優(yōu)于甲基苯酚的效果；在烷基相同的條件下，烷基在酚羥基對位的效果優(yōu)于在間位的效果，烷基在間位的效果優(yōu)于在鄰位的效果。

2.3 大腸桿菌經(jīng)單烷基酚類香料處理前、后菌體超微結(jié)構(gòu)的變化情況

大腸桿菌經(jīng)單烷基酚類香料處理前、后菌體形態(tài)和結(jié)構(gòu)如圖3 所示。

圖3 大腸桿菌掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron micrographs of Escherichia coli cell

由圖3 可見，未經(jīng)香料處理的大腸桿菌菌體形態(tài)飽滿、未變形。而經(jīng)香料處理后的大腸桿菌菌體形態(tài)發(fā)生了不同程度的改變，如菌體發(fā)生萎縮、表面有裂痕、且桿狀兩端位置出現(xiàn)明顯凹陷等。由圖可看出，甲基酚中，鄰甲酚處理后的菌體端處有輕微凹陷，間甲酚處理后的菌體中部有較為明顯的凹陷，而對甲酚處理后的菌體端處凹陷程度較大。乙基苯酚中，4-乙基苯酚處理后的菌體中部已萎縮變形，2-乙基苯酚處理后的菌體中部有較為明顯的斷裂凹陷。丙基苯酚中，2-丙基苯酚處理后的菌體有較為明顯的萎縮、凹陷，菌體失去飽滿形態(tài)，而2-異丙基苯酚和4-丙基苯酚處理后的大腸桿菌菌體萎縮、凹陷最為嚴(yán)重。作為對比物的乙萘酚和4-苯基苯酚處理后的菌體也出現(xiàn)端處凹陷、萎縮等現(xiàn)象，與4-乙基苯酚和4-丙基苯酚處理后的菌體形態(tài)相比，作用相對較弱。

對比所得掃描電鏡結(jié)果可知，經(jīng)過單烷基酚類食用香料處理后大腸桿菌變形大小程度依次為丙基苯酚>乙基苯酚>甲基苯酚。

通過對單烷基酚類食用香料對大腸桿菌抑制機理進行研究發(fā)現(xiàn)單烷基酚類的結(jié)構(gòu)與其抑菌效果有一定的關(guān)系，為充分利用酚類食用香料開發(fā)新的防腐劑提供理論依據(jù)，也對研究其它食用香料的防腐抑菌具有一定指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

1）單烷基酚類食用香料對大腸桿菌的生長曲線均有不同程度的影響，整體上看，丙基苯酚>乙基苯酚>甲基酚；其中，4-丙基苯酚、4-乙基苯酚和2-異丙基苯酚對大腸桿菌生長曲線影響較大。單烷基酚類香料可以有效抑制大腸桿菌生長繁殖，縮短對數(shù)期，提前進入穩(wěn)定期，達到抑菌作用。

2）經(jīng)單烷基酚類食用香料處理后的菌懸液上清液的電導(dǎo)率均成上升趨勢；且隨著酚類食用香料質(zhì)量濃度增大，細胞內(nèi)溶物釋放量也隨之增大。這表明經(jīng)單烷基酚類食用香料處理后的大腸桿菌細胞膜的選擇透過性增大，導(dǎo)致原生質(zhì)外滲。上清液電導(dǎo)率的大小和細胞溶出物釋放量與單烷基苯酚的結(jié)構(gòu)有一定關(guān)系，其中丙基苯酚>乙基苯酚>甲基苯酚。

3）經(jīng)單烷基酚類食用香料處理后大腸桿菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)均發(fā)生了不同程度變化，主要表現(xiàn)為菌體發(fā)生萎縮、干癟，表面有裂痕，且桿狀兩端位置出現(xiàn)凹陷。

4）單烷基酚類食用香料中取代基不同，對大腸桿菌的抑制作用強弱也有明顯差異，抑制效果大小順序為丙基苯酚>乙基苯酚>甲基苯酚；并且烷基相同時，烷基在4 位時的抑菌效果更佳。