海水浸泡對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜的影響及其機(jī)制

謝勝強(qiáng)，阿迪萊·阿卜杜熱西提，黑俊如，宋夢文，王翠，程崗,，劉志強(qiáng)，袁增強(qiáng)，張劍寧,*

1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；2解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)外科，北京 100048；3解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)外科醫(yī)學(xué)部，北京 100853；4軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850；5南華大學(xué)藥學(xué)院，湖南衡陽 421001

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是一種急性發(fā)展并可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆性損傷的全球性疾病，發(fā)病率約700/10萬，并呈逐年上升趨勢[1-3]。在海上作業(yè)及海戰(zhàn)條件下，TBI傷員可能面對海水浸泡的環(huán)境。由于海水的特殊作用，如低溫、高鹽(3.1%～3.4%)、 高pH(8.0～8.4) 及 高 滲 透 壓(1250～1350 mOsm/L)等，導(dǎo)致TBI 的病理生理過程更為復(fù)雜，使其防治面臨更多難題[4-7]。以往針對海水浸泡+TBI的研究顯示，細(xì)胞凋亡的發(fā)生可使神經(jīng)功能顯著下降[8-10]。本研究以神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的C57小鼠作為研究對象，觀察海水浸泡對TBI小鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)性、耐力以及腦神經(jīng)組織病理損傷的影響，并基于基因轉(zhuǎn)錄組圖譜的變化特征探討其潛在靶點(diǎn)與作用機(jī)制，為海上環(huán)境TBI的救治研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 轉(zhuǎn)棒儀(意大利Ugo Basile 公司)；控制性腦皮質(zhì)損傷(controlled cortical impact，CCI) 儀， KCl、 CaCl2、 NaCl、 MgSO4、 MgCl2、NaBr、NaHCO3(分析純)(美國Sigma Aldrich 公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組 51 只10 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 野生型小鼠，體重20～22 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：

SCXK(京)2019-0010]。隨機(jī)分為假手術(shù)組、TBI組和TBI+海水組，每組17 只。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于SPF 級動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)鼠籠架[蘇州猴皇動物實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技有限公司(規(guī)格：PEI)，SYXK(軍)：2019-0004]中。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)單位為軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，研究方案經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動物中心動物實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動物管理與使用委員會審查批準(zhǔn)(IACUC-DWZX-2022-566)。動物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程中均按照實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.3 動物模型制備與各組小鼠處置

1.3.1 人工海水的配制 按照國家海洋局第三海洋研究所提供的海水配方，配制的海水鹽濃度為3.00%～3.55%。實(shí)驗(yàn)所用海水的主要指標(biāo)：滲透壓(1250.00±11.52) mOsm/L， 鉀 離 子 濃 度(10.88±0.68) mmol/L，鈉離子濃度(630.00±5.33) mmol/L，氯離子濃度(658.80±5.25) mmol/L。主要成分(mmol/L)：NaCl 443.66，CaCl212.70，MgSO427.54，NaBr 0.81，MgCl225.76， KCl 9.73， NaHCO32.40。 pH 值 約為 8.2。

1.3.2 假手術(shù)組 小鼠按序號標(biāo)注，完全麻醉后進(jìn)行去骨瓣手術(shù)，在此過程中持續(xù)監(jiān)測其體溫，確保維持在37 ℃。若需要，將動物置于恒溫毯上以保持體溫穩(wěn)定。去骨瓣手術(shù)完成后，縫合頭皮切口，待生命體征平穩(wěn)后，將小鼠放回其所在動物房繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3.3 TBI 組 小鼠按順序編號，完全麻醉后實(shí)施去骨瓣手術(shù)，持續(xù)監(jiān)測體溫并使其維持在37 ℃。使小鼠呈俯臥位，頭部固定于小動物立體定向儀上，備皮后乙醇消毒，沿中線剪開1 cm頭皮，分離骨膜，暴露出人字縫、冠狀縫和矢狀縫。于冠狀縫后方2 mm、中線旁開左側(cè)2 mm 處用牙科鉆開出直徑5 mm的骨窗，注意勿傷及下方組織。然后轉(zhuǎn)移固定至CCI 儀中進(jìn)行TBI 損傷制備，以深度1 mm、速度3.5 m/s、滯留時間500 ms 進(jìn)行TBI 造模。需要時置小鼠于復(fù)溫毯上以保持體溫恒定。縫合頭皮切口，待生命體征平穩(wěn)后，放回動物房繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3.4 TBI+海水組 TBI+海水組小鼠在TBI 組處置的基礎(chǔ)上，暴露一側(cè)大腦半球皮質(zhì)，將輸液器導(dǎo)管末端部分用剪刀剪兩個側(cè)孔，側(cè)孔面向損傷區(qū)域腦組織，縫合皮膚切口中間部分，于腦表面形成兩端開放的皮下隧道，人工海水流經(jīng)隧道，使損傷區(qū)域腦組織持續(xù)浸泡30 min。余處置與TBI組相同。

1.4 行為學(xué)測試 每組取8只小鼠進(jìn)行行為學(xué)測試。

1.4.1 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的耐力 在實(shí)驗(yàn)前3 d，先將轉(zhuǎn)棒儀以10 r/min 恒速運(yùn)行，對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，3次/d，每次間隔1 h，每次運(yùn)行300 s。訓(xùn)練起始時，小鼠易掉落，將小鼠再次放回轉(zhuǎn)棒儀上，直至訓(xùn)練結(jié)束。第3 天訓(xùn)練時，將可在轉(zhuǎn)棒儀上停留150 s 左右的小鼠入組。小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上停留的時間越長，提示其耐力越強(qiáng)。

1.4.2 平衡木實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)和平衡能力 取一根長1 m、直徑17 mm的圓柱狀平衡木，將小鼠置于平衡木起始段，其后放一強(qiáng)光束發(fā)射器，根據(jù)小鼠喜陰暗的特點(diǎn)，誘導(dǎo)其爬行至終點(diǎn)暗箱；之后讓其休息30 s，開始下一段訓(xùn)練。每天訓(xùn)練3次，直至小鼠可以0.2～0.3 m/s的速度自行無停頓地通過平衡木。TBI 傷后1 d、3 d 和7 d 驗(yàn)收結(jié)果，記錄小鼠從平衡木起始段到達(dá)終端所需的時間。耗時越短，提示小鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)能力越好。

1.5 小鼠腦組織病理學(xué)檢查

1.5.1 伊文思藍(lán)(Evans-blue，EB)染色檢測血腦屏障通透性 每組取3 只小鼠用于EB 染色，檢測損傷后12 h 及24 h 血腦屏障通透性的變化。于小鼠死亡前1 h尾靜脈注射100 μl EB染液，處死后取腦組織，采用Image J軟件分析損傷區(qū)域EB染料浸潤面積。

1.5.2 HE染色觀察小鼠腦組織病理形態(tài) 取損傷后24 h 小鼠腦組織，每組3 只，通過4%組織固定液固定、蔗糖梯度脫水、石蠟包埋等步驟制備石蠟切片，然后行HE染色，于全景掃描機(jī)下進(jìn)行掃描，觀察小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.6 Western blotting 檢測小鼠腦組織B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)表達(dá)水平 取損傷后24 h 小鼠，每組3 只，收集腦損傷區(qū)域組織(1 g 左右)，用裂解液裂解后置于勻漿機(jī)上勻漿，冰上靜置15 min，待反應(yīng)充分后離心，取蛋白上清液以BCA 法測定各蛋白總濃度，加6×上樣緩沖液，金屬浴10 min 變性。每條泳道上樣30 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，封閉1 h。用兔抗Bcl-2、Bax 和β-actin 一抗(1∶1000)4 °C 孵育過夜，次日用HRP 標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，采用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色。顯影后，對原始膠片進(jìn)行掃描，通過ImageJ 定量分析Bax、Bcl-2 的相對表達(dá)量，取Bax/Bcl-2的比值衡量樣本間的凋亡情況。

1.7 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析小鼠腦組織差異表達(dá)基因和信號通路 損傷后24 h，取4只TBI組小鼠和5只TBI+海水組小鼠的腦組織于液氮中保存，送至北京青蓮百奧生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測。獲取結(jié)果后，通過R-package DEseq2以P<0.05和|log2變化倍數(shù)|>1 為標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行差異性分析。隨后使用ClusterProfiler 對差異基因進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，篩選出差異明顯(P<0.05)的信號通路?；蚣患治?Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)采用Broad Institute 開發(fā)的GSEA軟件完成，nPerm=1000。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并制圖。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用Turkey檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 海水浸泡對小鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)能力和耐力的影響平衡木實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組和TBI 組比較，損傷后1、3、7 d，TBI+海水組小鼠通過平衡木的時間均明顯延長(P<0.001，圖1A)，在轉(zhuǎn)棒儀上停留的時間均明顯縮短(P<0.001，圖1B)。

圖1 海水浸泡對TBI小鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)能力和耐力的影響Fig.1 Effects of seawater immersion on motor coordination and endurance of TBI mice

2.2 海水浸泡對小鼠神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blotting 檢測結(jié)果顯示，與TBI 組比較，損傷后24 h，TBI+海水組小鼠腦組織中促凋亡蛋白Bax 與抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 表達(dá)量的比值明顯升高(P<0.05，圖2)。

圖2 海水浸泡對TBI小鼠神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響(n=3)Fig.2 Effects of seawater immersion on the expression of neuronal apoptosis related proteins (Bcl-2 and Bax) in TBI mice (n=3)

2.3 海水浸泡對小鼠腦組織病理損傷的影響 EB染色結(jié)果顯示，TBI+海水組EB 滲透面積明顯大于TBI組(P<0.05)；兩組組內(nèi)比較，損傷后24 h EB 滲透區(qū)域的面積均明顯小于損傷后12 h(P<0.05，圖3A)。

圖3 海水浸泡對TBI小鼠腦組織病理損傷的影響Fig.3 Effects of seawater immersion on the pathological damage of brain tissue in TBI mice

HE 染色結(jié)果顯示，損傷后24 h，TBI 組和TBI+海水組小鼠損傷區(qū)域腦組織缺損，蛛網(wǎng)膜和皮質(zhì)連續(xù)性破壞；與TBI組比較，TBI+海水組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)損傷明顯加重，壞死面積明顯增大，胞周出現(xiàn)大量空泡，呈彌漫性分布，伴有嚴(yán)重的神經(jīng)元死亡缺失和反應(yīng)性膠質(zhì)化，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)排列紊亂，血管周圍間隙明顯擴(kuò)大(圖3B)。

2.4 海水浸泡后小鼠腦組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異表達(dá)基因分析 比較TBI 組和TBI+海水組小鼠腦組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜的差異，得到625 個差異表達(dá)基因(312 個基因上調(diào)，313 個基因下調(diào)，P<0.05)，其中所標(biāo)注的基因參與了細(xì)胞凋亡或自身免疫調(diào)節(jié)(圖4A)?；蚓垲惤Y(jié)果有明顯差異(P<0.05，圖4B)。GO富集結(jié)果顯示，自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡及淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)等免疫功能相關(guān)的通路顯著上調(diào)，基因絲組裝、微管運(yùn)動調(diào)節(jié)及纖毛運(yùn)動調(diào)節(jié)等與細(xì)胞增殖相關(guān)的通路顯著下調(diào)(P<0.05，圖5A)。KEGG富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要參與了補(bǔ)體與凝血級聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體結(jié)合和神經(jīng)激活配體-受體結(jié)合等通路，且這些通路之間有著共同的基因差異表達(dá)，發(fā)生相互作用(圖5B)。

圖4 海水浸泡后TBI小鼠腦組織差異表達(dá)基因Fig.4 Differential gene expression in brain tissues of TBI mice caused by seawater immersion

圖5 海水浸泡TBI小鼠腦組織差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析Fig.5 GO and KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in brain tissues of TBI mice caused by seawater immersion

2.5 p53家族介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡參與海水加重TBI小鼠神經(jīng)元損傷的過程 采用GSEA軟件(Broad Institude)進(jìn)行基因組學(xué)分析顯示，海水浸泡后TBI 小鼠的腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程受p53 家族調(diào)控(圖6A)。對其相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，TBI+海水組的腦神經(jīng)組織p53相關(guān)基因表達(dá)明顯增高(P<0.05，圖6B)。

圖6 p53家族對海水浸泡致TBI小鼠神經(jīng)元內(nèi)源性凋亡通路的調(diào)節(jié)Fig.6 Endogenous apoptotic pathways regulated by p53 family in neurons of TBI mice with seawater immersion

2.6 基因集富集分析結(jié)果 通過MsigDB 數(shù)據(jù)庫篩選出免疫相關(guān)的基因通路進(jìn)行基因集富集分析，結(jié)果顯示，NK 細(xì)胞相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)與TBI+海水組關(guān)系更密切(P<0.05，圖7A)。對各組小鼠腦組織中NK細(xì)胞相關(guān)的基因表達(dá)量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示TBI+海水組表達(dá)水平明顯高于TBI 組(P<0.05，圖7B)。

圖7 自然殺傷細(xì)胞在海水浸泡TBI小鼠腦組織中參與免疫調(diào)節(jié)Fig.7 Natural killer cells participates in immune regulation in brain tissues of TBI mice with seawater immersion

3 討 論

TBI+海水浸泡常見于海戰(zhàn)、海上作業(yè)等特殊環(huán)境下，因海水獨(dú)特的理化性質(zhì)，可使TBI的病理生理過程更加復(fù)雜。海水高滲、高鉀、高鈉的特點(diǎn)可使TBI損傷區(qū)域離子通道異常開放，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞水腫，釋放毒性神經(jīng)遞質(zhì)，加劇腦組織的損傷程度[6]；高pH的特點(diǎn)可加重TBI損傷組織血管上皮的損傷，引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)晶體滲透壓增高，進(jìn)而誘發(fā)鈣超載，激發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)，加速神經(jīng)細(xì)胞的死亡進(jìn)程，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損。本研究結(jié)果顯示，海水浸泡可明顯降低TBI小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力和耐力，破壞血腦屏障的完整性和通透性，加重浸泡區(qū)域腦組織的病理損傷，而p53蛋白相關(guān)的凋亡通路與NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)可能參與了海水浸泡誘發(fā)的損傷過程。

海水浸泡可導(dǎo)致TBI的傷死率和致殘率增高。既往研究顯示，TBI后神經(jīng)功能缺失是神經(jīng)元凋亡的結(jié)果，而海水浸泡加重神經(jīng)功能缺失是否是由凋亡介導(dǎo)尚不清楚。Bax是細(xì)胞質(zhì)中的凋亡相關(guān)蛋白，可誘導(dǎo)線粒體膜通透性增高，釋放c-fos等凋亡相關(guān)因子，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；Bax可與抑凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合形成異二聚體，影響其發(fā)揮清除氧自由基、恢復(fù)線粒體膜電勢等功效。Bax和Bcl-2是p53家族介導(dǎo)凋亡的常見標(biāo)志物。本研究的平衡木試驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)結(jié)果顯示，海水浸泡可明顯降低TBI小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力和耐力，Western blotting檢測結(jié)果也顯示海水浸泡可顯著增加凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2 的比值，提示海水浸泡后神經(jīng)功能缺損可能是由于細(xì)胞凋亡加重所致。p53基因是一種抑癌基因，與神經(jīng)元凋亡有重要關(guān)聯(lián)[11]。Xu等[12]在TBI中發(fā)現(xiàn)，p53的表達(dá)呈時間依賴性增高，且p53的激活可誘發(fā)線粒體代謝異常，釋放細(xì)胞色素C 等，促進(jìn)胱天蛋白酶(Caspase)的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生凋亡。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α 等炎性因子與p53 關(guān)系密切，Shao等[13]發(fā)現(xiàn)，p53家族是TNF-α作用于TBI的關(guān)鍵樞紐。本研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果顯示，p53介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡參與了海水浸泡后的TBI，提示p53可能是海水浸泡促進(jìn)TBI神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，可激活凋亡相關(guān)通路，促進(jìn)受損神經(jīng)元發(fā)生凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)功能受損。

血腦屏障是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cell，BMEC)之間的緊密連接等構(gòu)成的天然免疫屏障，可阻擋外周免疫細(xì)胞的流入，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫穩(wěn)態(tài)[14]。NK細(xì)胞是一種天然免疫細(xì)胞，既往研究顯示其主要在抗感染方面發(fā)揮作用，近年來隨著對TBI研究的深入，發(fā)現(xiàn)其與TBI也有重要聯(lián)系[15-16]。Kong 等[17]報道，人體外周循環(huán)的NK 細(xì)胞數(shù)量與TBI 的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)；Al Nimer等[18]報道，相比于正常對照組，TBI組損傷區(qū)域腦組織NK 細(xì)胞數(shù)量顯著增高，提示TBI 早期NK 細(xì)胞可釋放促炎因子，趨化同類免疫細(xì)胞穿過血腦屏障到達(dá)損傷區(qū)域，發(fā)揮炎癥效應(yīng)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害。在本研究中，經(jīng)海水浸泡后TBI小鼠血腦屏障通透性在損傷早期明顯增高，導(dǎo)致外周免疫細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮免疫效應(yīng)，破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步加重了損傷區(qū)域腦組織的病理損傷；腦組織的轉(zhuǎn)錄組中NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)通路顯著富集，提示海水浸泡后外周NK細(xì)胞可透過血腦屏障促進(jìn)炎性效應(yīng)。此外，本研究還顯示，凋亡和免疫相關(guān)富集通路的基因表達(dá)產(chǎn)物水通道蛋白11(aquaporin 11，AQP11)上調(diào)，提示其可能是海水浸泡TBI 早期腦水腫發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，海水浸泡可增加TBI小鼠血腦屏障的通透性，加重?fù)p傷區(qū)域腦組織的病理損傷，導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)功能下降；p53介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡和NK細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)可能與之相關(guān)。海水浸泡加重TBI小鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)和相關(guān)機(jī)制及免疫微環(huán)境的組成尚待進(jìn)一步研究。