殼聚糖創(chuàng)面敷料的微生物限度檢驗方法研究

常麗梅 王 媛 李仲洋 王康俊

1.海南省藥品和醫(yī)療器械審評服務中心，海南?？?570216；2.海南省藥品檢驗所，海南?？?570216

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，為天然多糖甲殼素在堿性條件下脫乙?；蟮漠a(chǎn)物[1]。殼聚糖具有良好的生物相容性及多種生理學活性[2]，其不僅具有良好的吸附性、吸濕性、成膜性、通透性以及較好的生物相容性、生物降解性和低過敏等特性，還具有抗微生物、抗氧化、抗菌等功能[3-5]。關于殼聚糖的抑菌活性機制，目前最容易被接受的理論是電荷作用，即殼聚糖的胺基（-NH2）正電荷與細菌細胞壁上的負電荷之間的靜電作用，引起細菌表面膜性質(zhì)的改變和損壞，從而抑制細菌的新陳代謝，導致細菌死亡[6-7]。殼聚糖的抑菌活性與分子量的大小、水溶性以及自身的脫乙?；潭鹊让芮邢嚓P。低分子質(zhì)量殼聚糖對革蘭氏陰性菌具有較好的效果，高分子質(zhì)量殼聚糖對于革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌效果，且抑菌效果均隨著相對分子質(zhì)量的增加而升高，但是，隨著殼聚糖相對分子量的增大，其水溶性逐漸降低[8]。

由于殼聚糖具有良好的生物活性，因而其在生物醫(yī)藥領域被廣泛應用于止血、防粘連、創(chuàng)面護理等創(chuàng)面敷料。但是殼聚糖產(chǎn)品中不同分子量的殼聚糖及非無菌產(chǎn)品中防腐劑的使用，都會影響其微生物檢驗結(jié)果，可能出現(xiàn)假陰性。本研究采用《中華人民共和國藥典（四部）》（2020年版）（通則1105）微生物計數(shù)法中平皿法[9]分別測定4種不同產(chǎn)品試驗菌回收比值，以驗證殼聚糖創(chuàng)面敷料微生物限度檢驗方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]（批號：9a5-2）、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]（批號：3a31-2）、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]（批號：2a30-1）、白色念珠菌[CMCC（B）98001]（批號：2a24-1）、黑曲霉菌[CMCC（B）98003]（批號：OA1006），均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 儀器與試劑

BSC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、LRH-250生化培養(yǎng)箱（日本松下公司）、DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、SQ810C高壓滅菌器（日本YAMATO公司）。

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：220506）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：2211162）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：221101）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號：221025）、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：220425）、0.9%無菌氯化鈉溶液（批號：220115），均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

4種非無菌含殼聚糖的液體/凝膠型產(chǎn)品，具體信息參見表1。

1.3 試驗菌液的制備[9]

取經(jīng)33℃新鮮培養(yǎng)20 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆液體培養(yǎng)物各1 ml，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液9 ml進行10倍稀釋，制成菌落數(shù)約為1000 cfu/ml的試驗菌液，備用。

取經(jīng)25℃新鮮培養(yǎng)20 h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液9 ml進行10倍稀釋，制成菌落數(shù)約為1000 cfu/ml的試驗菌液，備用。

取經(jīng)25℃在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)斜面上培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加入3～10 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液1 ml，加入9 ml上述聚山梨酯80的無菌氯化鈉溶液進行10倍稀釋，制成菌落數(shù)約為1000 cfu/ml的試驗菌液，備用。

1.4 供試品溶液的制備

取表1中試驗用產(chǎn)品（A1～A4）各10 g（或10 ml），用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液溶解并稀釋制成1∶10和1∶50的供試品溶液，備用。

1.5 計數(shù)方法適用性試驗

鑒于殼聚糖目前較小的相對分子量為5萬[10]，且部分產(chǎn)品中含卡波姆，粒徑均＞0.45 μm，無法采用薄膜過濾法處理，參照《中華人民共和國藥典（四部）》（2020年版）（通則1105）非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查有關微生物計數(shù)法[9]要求，選擇平皿法（稀釋法）對4種產(chǎn)品進行人工染菌的回收率測定，考察不同產(chǎn)品微生物計數(shù)方法的適用性。

1.5.1 試驗組1 需氧菌計數(shù)：取1.4所述的1∶10供試品溶液9.9 ml各5份，置于20 ml無菌試管中，分別加入0.1 ml試驗菌液（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉），混勻后制成人工污染試驗菌的供試液，分別取人工污染試驗菌的供試液1 ml注入平皿（1 ml/皿），立即傾入溶化后涼至45℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基約18 ml，每份平行制備2個平皿，待凝固后，于30℃～35℃倒置培養(yǎng)，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)5 d，其他菌培養(yǎng)3 d，計數(shù)菌落數(shù)，試驗重復3次，取平均值。

霉菌和酵母菌計數(shù)：另取1.4所述的1∶10供試品溶液9.9 ml各2份，置于20 ml無菌試管中，分別加入0.1 ml試驗菌液（白色念珠菌、黑曲霉菌），混勻后制成人工污染試驗菌的供試液，分別取人工污染試驗菌的供試液1 ml注入平皿（1 ml/皿），立即傾入溶化后涼至45℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基約18 ml，每份平行制備2個平皿，待凝固后，于20℃～25℃倒置培養(yǎng)5 d，計數(shù)菌落數(shù)，試驗重復3次，取平均值。

1.5.2 試驗組2 需氧菌計數(shù)：取1.4所述的1∶50供試品溶液9.9 ml各5份，置于20 ml無菌試管中，后續(xù)操作同1.5.1試驗組1，計數(shù)菌落數(shù)，試驗重復3次，取平均值。

霉菌和酵母菌計數(shù)：另取1.4所述的1∶50供試品溶液9.9 ml各2份，置20 ml無菌試管中，后續(xù)操作同1.5.1試驗組1，計數(shù)菌落數(shù)，試驗重復3次，取平均值。

1.5.3 菌液對照組 取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 ml，置于20 ml無菌試管中，后續(xù)操作同1.5.1試驗組1，分別進行需氧菌計數(shù)、霉菌和酵母菌計數(shù)。

1.5.4 供試品對照組 分別取1.4所述的1∶10、1∶50供試品溶液各9.9 ml，置于20 ml無菌試管中，以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替試驗菌液，后續(xù)操作同1.5.1試驗組1，分別進行需氧菌計數(shù)、霉菌和酵母菌計數(shù)。

1.5.5 回收比值計算及判定 采用平皿法（稀釋法）分別稀釋至1∶10和1∶50測定微生物回收率，試驗菌回收比值=（試驗組菌落數(shù)平均值-供試品對照組菌落數(shù)平均值）/菌液對照組菌落數(shù)平均值。判定依據(jù)：參照《中華人民共和國藥典（四部）》（2020年版）（通則1105）供試品計數(shù)方法適用性試驗，回收比值在0.5～2.0，符合要求。

2 結(jié)果

對4種產(chǎn)品人為污染需氧菌及霉菌和酵母菌后，試驗菌回收比值測定結(jié)果顯示：試驗組1中4種產(chǎn)品的試驗菌回收比值均＜0.5，不符合《中華人民共和國藥典（四部）》（2020年版）（通則1105）方法適用性的要求；試驗組2中除產(chǎn)品A2回收比值不符合要求外，其他3種產(chǎn)品的回收比值均在0.5～2.0，符合《中華人民共和國藥典（四部）》（2020年版）（通則1105）方法適用性的要求。試驗結(jié)果見表2～3。

表2 需氧菌的回收比值

表3 霉菌和酵母菌的回收比值

3 討論

分析表2～3數(shù)據(jù)可見，試驗產(chǎn)品的試驗菌回收比值隨殼聚糖濃度的減小而增大，其原因歸結(jié)為殼聚糖中的-NH2，隨著殼聚糖濃度的增加，溶液中-NH2的濃度也隨之增加，從而導致抑菌活性增強，試驗菌回收比值減小。

殼聚糖具有廣泛的抑菌活性，其抑菌活性與殼聚糖的分子量和濃度均有關[8，10]，無論是低分子量殼聚糖還是高分子量殼聚糖，隨著濃度的不斷增加，其抑菌性均逐漸增大[11]。4種試驗產(chǎn)品中僅A2在兩種稀釋濃度下試驗菌回收比值均不符合要求且趨于0，可見其抑菌活性非常強，可能為殼聚糖的季銨鹽衍生物等強抑菌性產(chǎn)品[12-13]。

殼聚糖的溶解性較差，難溶于水和大部分溶劑[14-15]，目前在醫(yī)藥領域使用的殼聚糖多為殼聚糖衍生物。含殼聚糖創(chuàng)面敷料由于不同企業(yè)產(chǎn)品主要原材料不同，其產(chǎn)品抑菌性存在差異，采用微生物計數(shù)方法進行適用性試驗是很有必要的?；跉ぞ厶茄苌锏奶匦裕瑲ぞ厶欠菬o菌產(chǎn)品微生物限度檢驗方法優(yōu)選采用平皿法中的稀釋法，并建議充分考慮殼聚糖衍生物信息及含量、所用防腐劑類別及用量、成品是否易溶于所選擇的稀釋劑、是否可以采用中和劑去除主成分及消除防腐劑的抑菌作用等，只有這樣才能科學制訂產(chǎn)品技術要求，更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。