共表達(dá)HAC1基因?qū)χ亟M畢赤酵母分泌表達(dá)葡萄糖氧化酶的影響

顧　磊，　張　娟，　堵國(guó)成，　陳　堅(jiān)（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫214122；3.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

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共表達(dá)HAC1基因?qū)χ亟M畢赤酵母分泌表達(dá)葡萄糖氧化酶的影響

顧磊1，3，張娟1，3，堵國(guó)成1，3，陳堅(jiān)*2，3
（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫214122；3.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

摘要：通過(guò)增強(qiáng)不可折疊蛋白質(zhì)響應(yīng)（UPR）信號(hào)途徑以及研究不同培養(yǎng)溫度下的影響，來(lái)提高重組葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。影響畢赤酵母外源蛋白表達(dá)的因素，主要為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊速率以及不可折疊蛋白積累造成的胞內(nèi)脅迫壓力。通過(guò)共表達(dá)HAC1基因?qū)Σ豢烧郫B蛋白信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，搖瓶中改造菌株P(guān)P-G-HAC1胞外酶活達(dá)到161 U/mL，相比于原始重組葡萄糖氧化酶菌株提高了34%。進(jìn)一步研究不同溫度下過(guò)量表達(dá)HAC1基因?qū)甑纳L(zhǎng)和分泌外源蛋白的影響，菌株P(guān)P-G-HAC1在3 L發(fā)酵罐中28℃培養(yǎng)，酶活達(dá)到1 008 U/mL，胞外重組蛋白質(zhì)達(dá)到14.43 g/L，相比原始菌株在相同條件下提高了3.12倍。

關(guān)鍵詞：重組畢赤酵母；葡萄糖氧化酶；不可折疊蛋白響應(yīng)；HAC1基因

葡萄糖氧化酶（EC 1.1.3.4，簡(jiǎn)稱(chēng)GOD）是生物領(lǐng)域中重要的工具酶。它是一種黃素蛋白，可以將β-D-葡萄糖通過(guò)分子氧傳遞電子轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。葡萄糖氧化酶被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)[1]。其中在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域中的作用尤為重要。在醫(yī)藥領(lǐng)域中，可制成試劑盒及電極，用于血漿、尿液及腦脊液中葡萄糖的定量檢測(cè)[2]。在食品領(lǐng)域中，可用于去除食品和飲料中殘留的葡萄糖和氧，從而提高貨架期和保質(zhì)期，同時(shí)也是生產(chǎn)葡萄糖酸及其衍生物的重要轉(zhuǎn)化用酶[3]。葡萄糖氧化酶及其產(chǎn)物和產(chǎn)物衍生物均具有廣泛的市場(chǎng)和應(yīng)用前景。大規(guī)模生產(chǎn)菌株常采用黑曲霉或者青霉，然而采用霉菌生產(chǎn)有其弊端，大量的雜蛋白質(zhì)和伴生產(chǎn)物造成下游提取的困難，同時(shí)產(chǎn)酶量不高也成為大規(guī)模生產(chǎn)的主要瓶頸[4-6]。為了解決這些問(wèn)題，近年來(lái)使用基因工程改造方法進(jìn)行異源表達(dá)受到關(guān)注。其中酵母表達(dá)系統(tǒng)相較于大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)能夠較好地異源表達(dá)葡萄糖氧化酶[7-11]。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)由于過(guò)糖基化修飾，使得重組葡萄糖氧化酶過(guò)糖基化情況嚴(yán)重，限制了葡萄糖氧化酶的應(yīng)用[12]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在這方面展現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，但國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)導(dǎo)中，黑曲霉來(lái)源基因重組葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的最高產(chǎn)率為40 U/mL，仍然不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求[11]。因此，如何提高重組葡萄糖氧化酶的產(chǎn)量成為十分重要的研究方向。

畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種廣泛應(yīng)用于分泌表達(dá)外源蛋白的真核系統(tǒng)。盡管已有多種外源蛋白質(zhì)在該系統(tǒng)中成功表達(dá)，但不意味著所有的案例都達(dá)到預(yù)期的效果，畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)外源源蛋白存在著很大的差異。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚對(duì)于外源蛋白的分泌表達(dá)量有很大的影響[13-14]。經(jīng)常采用的更換強(qiáng)啟動(dòng)子或者增加外源蛋白基因拷貝數(shù)的策略，使得大量屬于外源蛋白質(zhì)的初生肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留，不能成功分泌表達(dá)，甚至影響了宿主菌株的生長(zhǎng)[15-17]。HAC1基因編碼的Hac1p是酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不可折疊蛋白響應(yīng)（UPR）機(jī)制的激活調(diào)控因子，能夠調(diào)控分泌表達(dá)途徑中的下游靶基因，這些基因包含了各種分子伴侶，折疊因子，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中參與糖基化控制，以及其他胞內(nèi)脅迫條件下調(diào)控因子的編碼基因[18-19]。在作者所在研究室前期的研究中，篩選得到的高產(chǎn)葡萄糖氧化酶黑曲霉菌株Aspergillus niger BBE11721，擴(kuò)增其葡萄糖氧化酶基因，構(gòu)建了畢赤酵母基因工程菌株P(guān)ichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD（保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2012266）。作者在此基礎(chǔ)上，共表達(dá)了HAC1基因，并且進(jìn)一步研究不同培養(yǎng)溫度下共表達(dá)HAC1基因?qū)甑纳L(zhǎng)和分泌外源蛋白質(zhì)的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒菌株與質(zhì)粒：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)及保存。研究中使用及構(gòu)建所得菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

1.1.2試劑PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶等：大連寶生物公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、蛋白質(zhì)電泳marker：購(gòu)自碧云天公司；培養(yǎng)基所用酵母膏、蛋白胨：Oxoid公司；引物及測(cè)序：均由上海生工有限公司完成。其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1 LB培養(yǎng)基葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L。

1.2.2畢赤酵母培養(yǎng)基畢赤酵母培養(yǎng)用的培養(yǎng)基（YPD、MD、BMGY和BMMY）配方參照Invitrogen公司操作手冊(cè)。

1.2.3分批發(fā)酵BSM培養(yǎng)基85%磷酸26.7 mL/L，CaSO4·H2O 0.93 g/L，K2SO418.2 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，KOH 4.13 g/L，甘油40.0 g/L，PTM1 4.35 mL/L（PTM1配方參照Invitrogen公司操作手冊(cè)）。

1.2.4補(bǔ)料培養(yǎng)基50%甘油（含12 mL/L PTM1）。

表1　本研究中所使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2.5誘導(dǎo)培養(yǎng)基100%甲醇（含12 mL/L PTM1）。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1搖瓶發(fā)酵大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。畢赤酵母采用YPD、BMGY和BMMY等培養(yǎng)。其中畢赤酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)，在BMGY中培養(yǎng)至OD值為1.2～1.5時(shí)，將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，每12小時(shí)加入總體積1%的甲醇進(jìn)行持續(xù)誘導(dǎo)。

1.3.2 3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵將YPD中菌液按10%接種體積分?jǐn)?shù)接入3 L全自動(dòng)發(fā)酵罐（LiFlus GM BioTRON，Korea）中。以50%氨水和磷酸溶液控制pH 5.5，溫度30℃，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速（500～1 000 r/min）和通氣量（2～5 L/min）維持溶氧30%以上。當(dāng)甘油耗盡（DO迅速上升，且DO＞60%時(shí)）開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。當(dāng)菌體達(dá)到一定質(zhì)量濃度后（60、80、100 g/L），停止補(bǔ)料。待甘油再次耗盡，繼續(xù)保持基質(zhì)匱乏狀態(tài)1 h，DO＞60%后，開(kāi)始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并把誘導(dǎo)溫度降低至22℃或者28℃誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白質(zhì)。甲醇濃度控制在2%，使用FC2002華東理工大學(xué)在線甲醇在線檢測(cè)與控制器控制。

1.4方法

1.4.1基因PCR擴(kuò)增葡萄糖氧化酶GOD基因通過(guò)GeneBank登錄號(hào)ACB30370.1設(shè)計(jì)引物：GODF：TCCTACGTAAATGGCATTGAAGCCAGCCT；GODR：TTGCGGCCGCTCACTGCATGGAA GCATAATCT TC（下劃線處堿基為酶切位點(diǎn)）。以黑曲霉A. niger BBE11721的cDNA為模版。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，57℃退火30 s，72℃延伸2 min（30個(gè)循環(huán)）；72℃延伸10 min。

HAC1基因以GeneBank公布的基因編號(hào)8196642設(shè)計(jì)引物：HAC1 -F：GGGTTCGAAAT GCCCGTAGATTCTTCTC；HAC1-R：TTGCGGCCGCC TATTCCTGGAAGAATACAAAGTC（下劃線處堿基為酶切位點(diǎn)）。以畢赤酵母P. pastoris GS115的cDNA為模版。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min（30個(gè)循環(huán)）；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4.2重組質(zhì)粒構(gòu)建將上述PCR片斷純化后連接到pMD19-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，提取質(zhì)粒，將篩選得到的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序鑒定。葡萄糖氧化酶GOD克隆載體采用SnaBI和NotI進(jìn)行雙酶切，其產(chǎn)物純化后與表達(dá)載體pPIC9k相連接，篩選陽(yáng)性克隆驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒pPIC9k/ GOD。HAC1基因克隆載體采用AsuII和NotI進(jìn)行雙酶切，其產(chǎn)物純化后與表達(dá)載體pGAPZ相連接，篩選陽(yáng)性克隆驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒pGAPZ/HAC1。

1.4.3酵母轉(zhuǎn)化和重組子篩選將構(gòu)建的表達(dá)載體pPIC9k/GOD使用BglII進(jìn)行酶切線性化，pGAPZ/HAC1使用SacI進(jìn)行酶切線性化。pPIC9k/ GOD線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，使用電轉(zhuǎn)儀（Gene Pulser electroporator，Bio-Rad），電轉(zhuǎn)條件：2000 V，200 Ω，25 μF。使用RT-qPCR方法測(cè)定挑選出的陽(yáng)性克隆中的GOD拷貝數(shù)，獲得PP-GOD重組菌株。將pGAPZ/HAC1線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母PP-GOD感受態(tài)細(xì)胞，使用RT-qPCR方法測(cè)定挑選出的陽(yáng)性克隆中的HAC1基因拷貝數(shù)，獲得PP-G-HAC1重組菌株。

1.4.4 TRIzol法提取RNA離心收集菌體并置于液氮終止反應(yīng)，RNA的抽提使用RNA抽提試劑盒（Trizol regent），參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.5 RT -qPCR將獲得的RNA使用cDNA Synthesis kit（Takara）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后將反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模版。熒光定量PCR所用試劑盒為SYBR○R

Premix Ex TaqTMkit（Takara），反應(yīng)儀器為L(zhǎng)ightCycler 480 II Real-time PCR instrument（Roche Applied Science，Mannheim，Germany）。反應(yīng)條件為95℃30 s，40個(gè)循環(huán)。95℃5 s，60℃20 s最后50 ℃30 s冷卻?；蜣D(zhuǎn)錄變化計(jì)算方法為2-△△CT，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。選取3個(gè)生物學(xué)平行樣，取平均值，所用定量PCR引物見(jiàn)表2。

表2　本研究中所使用定量引物Table 2 Oligonucleotides used in this study

1.4.6葡萄糖氧化酶活性測(cè)定測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[6]?；盍Χx單位：每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol葡萄糖為葡萄糖酸和過(guò)氧化氫所需的酶量為一個(gè)單位，以U/mL表示。

1.4.7 AOX氧化酶活性測(cè)定測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[20]。活力定義單位：相同菌濃下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol過(guò)氧化氫所需的酶量為一個(gè)單位，以U/gDCW表示。

2　結(jié)果與討論

2.1葡萄糖氧化酶重組菌株及HAC1共表達(dá)重組菌株的構(gòu)建

分別以A. niger BBE11721為模版，配合以GOD-F/GOD-R為引物；以畢赤酵母P. pastoris GS115的cDNA為模版，配合以HAC1-F/HAC1-R和為引物，按照方法1.4.1進(jìn)行基因克隆，分別PCR擴(kuò)增得到1 800左右和1 000左右的特異性條帶，見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增所得GOD基因全長(zhǎng)1 749 bp，編碼583個(gè)氨基酸；PCR擴(kuò)增所得HAC1基因全長(zhǎng)996 bp，編碼332個(gè)氨基酸，兩段基因大小和序列均與預(yù)期相符。

為在畢赤酵母表達(dá)體系中順利將GOD表達(dá)并分泌至胞外，采用畢赤酵母表達(dá)載體上的信號(hào)肽αfactor以實(shí)現(xiàn)在畢赤酵母表達(dá)體系中的分泌。并使用帶有AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子的pPIC9k表達(dá)載體，按照方法1.4.2構(gòu)建得到pPIC9k/GOD重組載體。同時(shí)，為在畢赤酵母表達(dá)體系中胞內(nèi)表達(dá)調(diào)控子Hac1p，作者采用了帶有GAP啟動(dòng)子的表達(dá)載體pGAPZα，并通過(guò)使用AsuII和NotI雙酶切方式去除了質(zhì)粒上的信號(hào)肽α-factor，按照方法1.4.2構(gòu)建得到了pGAPZ/HAC1重組載體。此后，將pPIC9k/GOD線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，獲得PP-GOD重組菌株。將pGAPZ/HAC1線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母PP-GOD感受態(tài)細(xì)胞，獲得PP-GHAC1重組菌株。重組菌中的葡萄糖氧化酶基因GOD和HAC1基因拷貝數(shù)使用RT-qPCR的方法測(cè)定，參照文獻(xiàn)[21]。本研究中所使用菌株中基因拷貝數(shù)見(jiàn)表3。因?yàn)锳OX1與GAP基因同時(shí)存在于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒和畢赤酵母的基因組中，因此表中所示拷貝數(shù)為測(cè)得拷貝數(shù)減去基因組中已存在的一個(gè)拷貝數(shù)。

菌株　GOD拷貝數(shù)　HAC1拷貝數(shù)PP-GOD　5　0 PP-HAC1　0　1 PP-G-HAC1　5　1

2.2共表達(dá)HAC1基因?qū)ζ咸烟茄趸窯OD表達(dá)的影響

在畢赤酵母中過(guò)量表達(dá)外源蛋白質(zhì)會(huì)帶給分泌途徑負(fù)擔(dān)，大量的未折疊肽鏈或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)是影響外源分泌表達(dá)的主要原因[22]。在本研究中，作為UPR效應(yīng)的激活因子Hac1p的編碼基因HAC1，通過(guò)過(guò)量共表達(dá)HAC1基因考察了該基因?qū)ζ咸烟茄趸窯OD在P. pastoris中表達(dá)的影響。如圖2所示，改造重組菌株P(guān)P-G-HAC1在搖瓶中能夠分泌更多的胞外GOD，培養(yǎng)120 h后胞外GOD活性達(dá)到161 U/mL，相比于原始菌株P(guān)P-GOD提高了37%。同時(shí)通過(guò)過(guò)量共表達(dá)HAC1基因，使得GOD的單位生產(chǎn)率從PP-GOD菌株的0.42 mg/（g·h）提高到PP-G-HAC1菌株的0.52 mg/（g·h）。如表4所示，改造重組菌PP-G-HAC1在胞外GOD蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和GOD酶得率（重組酶量/細(xì)胞干質(zhì)量DCW）均有所提高，分別從原始菌株的1 059 mg/L 與60.2 mg/g提高到1 439 mg/L與74.2 mg/g。結(jié)果表明，共表達(dá)調(diào)控因子編碼HAC1基因能夠有效的改善GOD在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。

圖2　搖瓶中過(guò)量表達(dá)HAC1對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的發(fā)酵過(guò)程曲線Fig. 2 Effects of Co-Expression of HAC1 on the GOD secretion in P. pastoris in shake flasks

2.3 3 L發(fā)酵罐中不同培養(yǎng)溫度下共表達(dá)HAC1基因?qū)Πl(fā)酵產(chǎn)GOD的影響

外源蛋白質(zhì)表達(dá)分泌的過(guò)程中，環(huán)境因素對(duì)宿主的生理和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率有重要影響。在畢赤酵母表達(dá)體系中，溫度被認(rèn)為直接影響蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力和宿主代謝功能。不同的培養(yǎng)溫度能夠改變蛋白質(zhì)的合成、折疊和分泌速率，同時(shí)對(duì)宿主內(nèi)部蛋白質(zhì)分泌途徑中造成脅迫應(yīng)激反應(yīng)也有重要的影響。溫度對(duì)蛋白質(zhì)分泌的影響是基于宿主生長(zhǎng)情況，蛋白質(zhì)合成和蛋白質(zhì)在胞內(nèi)積聚造成的脅迫壓力等各因素的綜合體現(xiàn)[23]。畢赤酵母的最適生長(zhǎng)溫度為28～30℃，而研究表明，降低培養(yǎng)溫度有利于提高部分外源蛋白質(zhì)的分泌[24]。雖然溫度的降低使得畢赤酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝速率降低，但能夠減少由于蛋白質(zhì)過(guò)量合成分泌過(guò)程引起的細(xì)胞衰亡，見(jiàn)表4。作者采用3 L發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)一步對(duì)不同改造菌株在不同培養(yǎng)溫度下的發(fā)酵情況進(jìn)行研究。目的在于研究共表達(dá)HAC1基因在不同溫度下對(duì)外源分泌蛋白質(zhì)的影響，以及在改進(jìn)培養(yǎng)溫度的發(fā)酵條件下進(jìn)一步提高葡萄糖氧化酶GOD的酶活。

2.3.1重組菌PP-GOD在3 L發(fā)酵罐中不同培養(yǎng)溫度下對(duì)發(fā)酵產(chǎn)GOD的影響考察了3 L發(fā)酵罐中不同培養(yǎng)溫度（22℃和28℃）、不同重組菌發(fā)酵產(chǎn)GOD的影響。如圖3所示，重組菌PP-GOD在22℃時(shí)DCW最高達(dá)到179 g/L，然而在28℃DCW最高僅能達(dá)到134 g/L。同時(shí)，重組菌PP-GOD在22℃最高GOD活性達(dá)到427.6 U/mL，相較于28℃培養(yǎng)條件GOD活性323 U/mL提高了25%。這些結(jié)果表明，甲醇誘導(dǎo)期的低溫誘導(dǎo)能夠有效提高重組菌PP-GOD的GOD產(chǎn)量。

表4　搖瓶中過(guò)量表達(dá)HAC1對(duì)工程菌發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 Effects of co-expression of HAC1 on heterologous protein production of GOD in shake flasks

圖3　3 L發(fā)酵罐中不同培養(yǎng)溫度下重組菌PP-GOD產(chǎn)GOD的發(fā)酵曲線Fig. 3　 Fermentation properties of the GOD over -expressing strain PP-GOD in 3 L fermentor

2.3.2重組菌PP-G-HAC1在3 L發(fā)酵罐中不同培養(yǎng)溫度下對(duì)發(fā)酵產(chǎn)GOD的影響考察3 L發(fā)酵罐中改造重組菌PP-G-HAC1菌株在過(guò)量共表達(dá)HAC1基因發(fā)酵產(chǎn)GOD的影響，在22℃培養(yǎng)條件下，產(chǎn)GOD的能力并沒(méi)有因?yàn)榻档蜏囟榷兴岣?。如圖4所示，經(jīng)過(guò)156 h的誘導(dǎo)，改造重組菌PP-G-HAC1在28℃時(shí)胞外GOD酶活能夠達(dá)到1 008 U/mL，同時(shí)比酶活70 kU/g，菌體干重DCW最高達(dá)到300 g/L。而在3 L發(fā)酵罐中，22℃下GOD酶活最高達(dá)到699 U/mL，胞外GOD酶量12.02 g/L，比28℃培養(yǎng)條件下有所降低。

圖4　3 L發(fā)酵罐中不同溫度下重組菌PP-G-HAC1產(chǎn)GOD的發(fā)酵曲線Fig. 4　 Effect of different cultivation temperatures on GOD secretion in engineered secretion strain PPG-HAC1 in 3 L fermentor

進(jìn)一步考察了3 L發(fā)酵罐中不同培養(yǎng)溫度對(duì)不同重組菌PP-GOD與PP-G-HAC1發(fā)酵產(chǎn)GOD的影響。綜合各情況下發(fā)酵參數(shù)的比較，如表5所示，重組菌PP-G-HAC1在28℃下對(duì)產(chǎn)GOD更有利，比酶活69 854 U/g，GOD生產(chǎn)率6.46 U/（mL·h），胞外GOD酶量14.43 g/L，均相較于22℃培養(yǎng)條件下有明顯的提高（比酶活58 153 U/g，GOD生產(chǎn)率4.48 U/（mL·h），胞外GOD酶量12.02 g/L）。如圖5所示，PP-G-HAC1菌株在不同溫度下，誘導(dǎo)156 h胞外蛋白SDS-PAGE圖，顯示28℃條件下的GOD條帶要較22℃更為明顯。

同時(shí)，從表5中發(fā)酵參數(shù)發(fā)現(xiàn)，重組菌PP-GOD在28℃下的發(fā)酵參數(shù)要明顯低于重組菌PP-GHAC1的發(fā)酵參數(shù)。通過(guò)對(duì)AOX醇氧化酶活性的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在相同條件下不同的改造菌株中差異較大。P. pastoris對(duì)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)受到AOX1啟動(dòng)子調(diào)控，AOX醇氧化酶是甲醇代謝途徑中第一個(gè)關(guān)鍵酶，受甲醇的誘導(dǎo)啟動(dòng)[25]。如圖6所示，PP-GHAC1菌株中的AOX活性曲線高于PP-GOD菌株，并且最大AOX活性達(dá)到8.8 U/g，相較于PP-GOD菌株中的5.1 U/g有明顯提高。

表5　不同重組菌在不同培養(yǎng)溫度下發(fā)酵產(chǎn)GOD的參數(shù)Table 5 Comparison of parameters for GOD production under different cultivation temperatures

圖5　不同培養(yǎng)溫度下PP-G-HAC1菌株156 h時(shí)胞外蛋白SDS-PAGE圖Fig. 5　 SDS -PAGE of fermentation supernatant of the engineered secretion strain PP-G-HAC1 in 3 L fermentor at different temperatures.

圖6　3 L發(fā)酵罐中28℃下重組菌PP-G-HAC1與PPGOD產(chǎn)GOD的AOX活性曲線Fig. 6 Effects of co-expression of HAC1 on AOX activity in 3 L fermentor at 28℃

通過(guò)在不同溫度下不同重組菌株發(fā)酵GOD影響的研究，發(fā)現(xiàn)在原始菌株P(guān)P-GOD中，降低誘導(dǎo)期培養(yǎng)溫度至22℃能夠有效地提高GOD的產(chǎn)量，菌體生長(zhǎng)較28℃時(shí)有明顯提高，說(shuō)明較高的培養(yǎng)溫度使得蛋白質(zhì)過(guò)量合成分泌過(guò)程引起的脅迫反應(yīng)影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)，導(dǎo)致GOD產(chǎn)量的降低。而在共表達(dá)HAC1基因的菌株P(guān)P-G-HAC1中，28℃培養(yǎng)條件較22℃培養(yǎng)條件下GOD的產(chǎn)量有進(jìn)一步的提高，兩種菌株在22、28℃下的產(chǎn)外源蛋白質(zhì)差異，說(shuō)明了共表達(dá)HAC1基因能夠有效減緩蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)情況下胞內(nèi)的脅迫壓力，增強(qiáng)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，在畢赤酵母最適生長(zhǎng)溫度28℃下進(jìn)一步提高GOD的產(chǎn)量。

2.4 28℃培養(yǎng)溫度下UPR下游靶基因基因轉(zhuǎn)錄水平變化

HAC1基因編碼的Hac1p作為UPR途徑的激活調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)控UPR途徑中的許多功能基因。畢赤酵母內(nèi)的UPR典型下游靶基因包含了折疊基因（ERO1，KAR2），轉(zhuǎn)運(yùn)基因（SEC18，SEC53，SSA4，VPS17），ERAD基因（HRD1，UBC1）和脅迫調(diào)控基因（GCN4，MSN2）等典型編碼基因。為了進(jìn)一步考察這些編碼基因在28℃培養(yǎng)條件下不同菌株中的轉(zhuǎn)錄水平變化，作者采用RT-qPCR技術(shù)對(duì)這些基因的表達(dá)量進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7　28℃培養(yǎng)溫度下UPR下游靶基因基因轉(zhuǎn)錄水平變化Fig. 7 Comparison of marker genes transcriptional levels

PP-G-HAC1菌株相較于PP-GOD菌株明顯上調(diào)的基因包括：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊基因KAR2，上調(diào)1.3倍；參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白修飾與糖基化與轉(zhuǎn)運(yùn)基因SEC53，上調(diào)1.7倍；參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解基因HRD1，上調(diào)1.1倍；調(diào)節(jié)選擇性降解非正確折疊蛋白基因UBC1，上調(diào)1.4倍。這些直接參與分泌途徑的基因的上調(diào)有效地說(shuō)明了PP-G-HAC1菌株在過(guò)量共表達(dá)HAC1基因的情況下胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)分泌外源蛋白GOD的能力更強(qiáng)。然而脅迫調(diào)控基因MSN2有所下調(diào)，同樣屬于脅迫調(diào)控基因GCN4基因卻較PP-GOD菌種有所上調(diào)。GCN4基因編碼的調(diào)控因子能夠調(diào)控一些與氨基酸合成相關(guān)基因的表達(dá)。GCN4編碼蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脅迫環(huán)境激活，被認(rèn)為是由HAC1基因調(diào)控的UPR應(yīng)答機(jī)制中關(guān)鍵下游調(diào)控蛋白。GCN4的同源基因作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫與氧化脅迫的調(diào)控橋梁，能夠調(diào)節(jié)還原型谷胱甘肽的生物合成，用來(lái)改善細(xì)胞由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解蛋白機(jī)制中造成的氧化蛋白折疊積累的活性氧形成的活性降低現(xiàn)象[26]。PP-G-HAC1菌株中GCN4基因的上調(diào)說(shuō)明了胞內(nèi)由于外源蛋白GOD大量分泌表達(dá)的情況下，為抵御活性氧（ROS）的形成進(jìn)行了更有效的抵御。

在前期的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PP-GOD菌株28℃培養(yǎng)的GOD產(chǎn)量較22℃下有明顯的降低，造成這一現(xiàn)象的原因是胞內(nèi)脅迫壓力引起宿主細(xì)胞生長(zhǎng)能力和蛋白質(zhì)合成速率的下降。脅迫壓力由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的大量積累造成，一旦發(fā)生這種情況會(huì)造成3種常見(jiàn)的結(jié)果[27]：1）新生肽鏈向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)減少；2）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力的加強(qiáng)；3）當(dāng)前兩者不能解決脅迫壓力，就會(huì)造成宿主功能性失常，宿主菌體就會(huì)死亡。宿主細(xì)胞對(duì)應(yīng)過(guò)量表達(dá)蛋白質(zhì)的脅迫情況下，自身的UPR途徑會(huì)被激活，作為一種防御機(jī)制來(lái)抵御胞內(nèi)的非正常脅迫環(huán)境。通過(guò)對(duì)UPR途徑下游典型編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平考察，發(fā)現(xiàn)在PP-G-HAC1中過(guò)量共表達(dá)HAC1基因能夠顯著增強(qiáng)UPR信號(hào)途徑的操縱能力。在相同培養(yǎng)條件下，同原始菌株P(guān)P-GOD相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中處理新生肽鏈折疊的編碼基因明顯上調(diào)，并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑ERAD等功能基因也顯著上調(diào)，這些功能基因轉(zhuǎn)錄水平的增強(qiáng)減輕了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫壓力。同時(shí)調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS水平的氧化脅迫調(diào)控基因GCN4的轉(zhuǎn)錄水平也明顯上調(diào)。這說(shuō)明了在28℃培養(yǎng)溫度條件下共表達(dá)HAC1基因，能夠有效地提高宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)折疊和分泌能力，同時(shí)增強(qiáng)胞內(nèi)脅迫壓力的抵御能力，從而提高外源GOD的產(chǎn)量。

3　結(jié)語(yǔ)

作者分析了畢赤酵母共表達(dá)中UPR中關(guān)鍵基因HAC1對(duì)于GS115菌株發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶GOD的影響，改造菌株P(guān)P-G-HAC1在3 L發(fā)酵罐中28℃培養(yǎng)，酶活達(dá)到1 008 U/mL，胞外重組蛋白質(zhì)達(dá)到14.43 g/L，相比原始菌株在相同條件下提高了3.12倍。為了進(jìn)一步提高葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的發(fā)酵生產(chǎn)，解析畢赤酵母系統(tǒng)中合成分泌外源蛋白質(zhì)通路的代謝網(wǎng)絡(luò)，以及通過(guò)代謝工程改造增強(qiáng)原生肽鏈修飾折疊，降低未折疊蛋白質(zhì)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脅迫，減少細(xì)胞負(fù)擔(dān)的同時(shí)增強(qiáng)外源蛋白質(zhì)分泌，將成為我們?nèi)蘸罄^續(xù)深入研究的重點(diǎn)。

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Effects of Co-Expression of HAC1 on Glucose Oxidase Production in Recombinant Pichia pastoris

GU Lei1，3，ZHANG Juan1，3，DU Guocheng1，3，CHEN Jian*2，3
（1. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：In this work，the enhancement of unfolded protein response transcription pathway at different cultivation temperatures were integrated as a novel protein secretion strategy to improve extracellular enzyme concentration and specific productivity of heterologous glucose oxidase（GOD）in Pichia pastoris. Efficient production of heterologous proteins in P. pastoris was often limited by metabolic and intrinsic stresses such as folding rate and ER stress by accumulation of unfolded protein. The results showed that enzymatic activity of engineered secretion strain PP-G-HAC1，co-expression of UPR activating transcription factor Hac1p from P. pastoris，was up 161 U/mL in shake flasks，34% higher compared to control strain. Furthermore，the effects of different cultivation

E-mail：jchen@jiangnan.edu.cntemperatures（22、28℃）were also investigated. The highest GOD activity and extracellular concentration at 28℃in PP-G-HAC1 were 1，008 U/mL and 14.43 g/L，respectively，3.12-fold increase than that of control strain.

Keywords：Pichia pastoris，glucose oxidase，unfolded protein response，HAC1

*通信作者：陳堅(jiān)（1962—），男，江蘇無(wú)錫人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程和食品生物技術(shù)方面的研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目（31470160）；國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA100905）；國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2013CB733902）；博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（114957，2013M540538）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2012553）。

收稿日期：2014-08-29

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 555

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）02—0113—10