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    人白介素-29變異體在畢赤酵母中的表達(dá)及抗腫瘤活性

    2016-05-23 10:01:16李利云彭榮剛鄔敏辰江南大學(xué)藥學(xué)院江蘇無(wú)錫4江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院江蘇無(wú)錫4江南大學(xué)生物工程學(xué)院江蘇無(wú)錫4
    關(guān)鍵詞:抑制率酵母質(zhì)粒

    陸 源, 陳 偉, 李利云, 彭榮剛, 李 菲, 鄔敏辰(.江南大學(xué)藥學(xué)院,江蘇無(wú)錫4;.江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院,江蘇無(wú)錫4;.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫4)

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    人白介素-29變異體在畢赤酵母中的表達(dá)及抗腫瘤活性

    陸源1,陳偉*2,李利云3,彭榮剛2,李菲2,鄔敏辰2
    (1.江南大學(xué)藥學(xué)院,江蘇無(wú)錫214122;2.江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院,江蘇無(wú)錫214122;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫214122)

    摘要:基于生物信息學(xué)分析的結(jié)果,采用基因突變和大引物PCR技術(shù)完成人白細(xì)胞介素-29 (hIL-29)成熟肽第33位氨基酸的定點(diǎn)突變,成功實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115中的異源表達(dá)。重組人白細(xì)胞介素-29變異體蛋白(rhIL-29mut33)在不同質(zhì)量濃度時(shí),對(duì)肝癌細(xì)胞BEL7402、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8和胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖均有抑制作用,而且抑制增殖效應(yīng)強(qiáng)于野生型rhIL-29。與低質(zhì)量濃度相比,高質(zhì)量濃度下rhIL-29mut33對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用更強(qiáng),對(duì)上述3種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率分別達(dá)到(31.76±2.87)%、(22.47±0.26)%和(34.41± 0.40)%。rhIL-29mut33良好的生物學(xué)活性表明該變異體具有較大的應(yīng)用潛力。

    關(guān)鍵詞:人白細(xì)胞介素-29;定點(diǎn)突變;基因克隆;表達(dá);抗腫瘤活性

    人白細(xì)胞介素-29(Human interleukin-29,hIL-29)是近年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子,又稱為干擾素λ1 (Interferon λ1,IFNλ1),其與hIL-28A和hIL-28B同屬I(mǎi)FN λ家族(IFNλs)[1-2]。hIL-29通過(guò)結(jié)合特殊的異二聚體受體復(fù)合物起始信號(hào)的傳導(dǎo),其與Ⅰ型IFN共享相同的JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑,促進(jìn)一組共同基因的表達(dá)。因此,hIL-29表現(xiàn)出一些與Ⅰ型IFN相同的性質(zhì),如抗病毒、抗增殖、體內(nèi)抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性[3]。hIL-29的特異受體復(fù)合物由特有的結(jié)合亞基IL-28R1和輔助亞基IL-10R2組成。IL-28R1表達(dá)的細(xì)胞譜系較少,因此,hIL-29作用的靶細(xì)胞有限,主要包括肝細(xì)胞、胃腸細(xì)胞和上皮細(xì)胞[4-8]。由此提示hIL-29作為藥物的副作用可能比Ⅰ型IFN更小,可望研制開(kāi)發(fā)臨床療效高且副作用小的新一代干擾素藥物。研究發(fā)現(xiàn),hIL-29肽鏈中有一個(gè)由胞內(nèi)向胞外的跨膜結(jié)構(gòu)域,其空間構(gòu)象由6個(gè)α螺旋(A-F)和無(wú)規(guī)則卷曲組成[9]。hIL-29空間構(gòu)象的A、B和F螺旋可能是hIL-29與特異性受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的活性部位。對(duì)hIL-29的生物信息學(xué)分析表明,A和F螺旋中有4個(gè)氨基酸殘基可能是影響其生物學(xué)活性的關(guān)鍵氨基酸殘基[10]。

    作者所在課題組前期已從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)RT-PCR得到hIL-29成熟肽的編碼基因,并獲得酵母表達(dá)的重組hIL-29成熟肽[11-12]。在此基礎(chǔ)上,作者以生物信息學(xué)分析結(jié)果為依據(jù)[10],采用定點(diǎn)突變和大引物PCR技術(shù)將hIL-29成熟肽的Lys33定點(diǎn)改造為Arg33,將變異體hIL-29mut33通過(guò)畢赤酵母GS115重組表達(dá),初步分析了重組hIL-29變異體(rhIL-29mut33)的抗腫瘤活性,結(jié)果顯示該變異體具有較好的抗腫瘤效應(yīng)。

    1 材料與方法

    1.1質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株

    大腸桿菌E. coli JM109,真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM:購(gòu)自Invitrogen公司并經(jīng)作者所在實(shí)驗(yàn)室改造;整合了hIL-29成熟肽基因的重組質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29:由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;克隆質(zhì)粒pUCm-T:上海Sangon公司;畢赤酵母GS115:Invitrogen公司;人肝癌細(xì)胞BEL7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8及人胃癌細(xì)胞SGC7901:由江南大學(xué)藥學(xué)院金堅(jiān)教授惠贈(zèng)。

    1.2主要試劑和培養(yǎng)基

    各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Ladder Marker、低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker和EZ-10柱式DNA回收試劑盒:大連TaKaRa公司;胰蛋白胨、酵母提取物、DAB、SDS、G418、硝酸纖維素膜(NC膜)和RPMI-1640培養(yǎng)基等:上海Sangon公司;羊抗人IL-29多克隆抗體:美國(guó)R&D公司;HRP標(biāo)記兔抗羊IgG:上海明睿公司;新生小牛血清:浙江天杭生物科技有限公司;胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液(100×)和Cell Counting Kit-8試劑:碧云天生物技術(shù)研究所;重組人干擾素α2b注射液:北京凱因科技股份有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。LB、YPD、MD、BMGY 和BMMY培養(yǎng)基的配制按Multi -Copy Pichia Expression Kit(Invitrogen公司)操作手冊(cè)。

    1.3引物設(shè)計(jì)與合成

    參照NCBI公布的hIL-29的編碼序列(登錄號(hào):AY336716.1),結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果,設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼hIL-29成熟肽cDNA的特異性上、下游引物及突變引物(第98位堿基T突變?yōu)镃):

    上游引物(hIL-29-F):5’- CTCGAGAAAAGAG GCCCTGTCCCCACTTCC -3’,含XhoⅠ位點(diǎn);

    下游引物(hIL-29-R):5’- GCGGCCGCTCAGG TGGACTCAGGGTGG -3’,含NotⅠ位點(diǎn);

    突變引物(hIL-29-A):5’- CCCTGGCCCTCTT GAAGCTCGCTA -3’,含突變位點(diǎn)。

    1.4 hIL-29mut33編碼基因的克隆

    采用大引物PCR方法,對(duì)hIL-29成熟肽基因?qū)嵭卸c(diǎn)突變。第一輪PCR擴(kuò)增以pPIC9KM-hIL-29質(zhì)粒為模板,hIL-29-F和hIL-29-A為引物,反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。第二輪大引物PCR擴(kuò)增以pPIC9KM-hIL-29質(zhì)粒為模板,以第一輪PCR產(chǎn)物和hIL-29-R為引物,反應(yīng)條件與第一輪相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳后,用EZ-10 Spin Column DNA Extraction Kit回收目的基因,操作按說(shuō)明書(shū)。將回收的目的基因與pUCm-T連接,轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,送上海Sangon公司測(cè)序,測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pUCm-T-hIL-29mut33經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ雙酶切,回收目的基因hIL-29mut,與同樣雙酶切的pPIC9KM質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)PCR篩選鑒定獲重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29mut33后,送上海Sangon公司測(cè)序鑒定。

    1.5 hIL-29mut33在畢赤酵母GS115中的表達(dá)

    pPIC9KM和經(jīng)測(cè)序鑒定的pPIC9KM-hIL-29mut33經(jīng)SalⅠ線性化后,用電轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115;轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GS115涂布MD平板,挑選在MD平板上生長(zhǎng)良好的菌落用牙簽點(diǎn)種至含不同質(zhì)量濃度G418的YPD平板,篩選出抗高質(zhì)量濃度(2.0 mg/mL)的重組畢赤酵母,分別命名為GS115/9KM和GS115/hIL-29mut33。按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的方法提取重組GS115基因組DNA,以通用引物5’-AOX和3’-AOX進(jìn)行PCR,鑒定目的基因是否整合入GS115基因組內(nèi)。GS115/9KM和GS115/ hIL -29mut33的誘導(dǎo)表達(dá)按Multi -Copy Pichia Expression Kit(Invitrogen公司)操作手冊(cè)。

    1.6 rhIL-29mut33的分離純化

    誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心10 min,收集上清液。向上清液中加入硫酸銨至30%飽和度,4℃靜置過(guò)夜后離心去除部分雜蛋白質(zhì)和色素。在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至65%飽和度,4℃靜置過(guò)夜,離心收集沉淀。將沉淀溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(10 mmol/L,pH 6.0),經(jīng)透析、超濾濃縮(截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000,Millipore公司)后,加至預(yù)先用上述緩沖液平衡的SP-Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換柱(Φ 16 mm×200 mm),以同樣緩沖液洗柱,然后以含NaCl的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(10 mmol/L,0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl,pH 6.0)進(jìn)行梯度洗脫,流速1.0 mL/min,收集洗脫液。將含有rhIL-29mut33的洗脫液超濾濃縮至3 mL,加至預(yù)先用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡的Sephadex G-75凝膠層析柱(Φ 1.6 cm×100 cm),然后同一緩沖液洗脫,流速0.4 mL/min,收集含rhIL-29mut33的組分,冷凍干燥。

    1.7 rhIL-29mut33的鑒定

    取少量純化后的重組蛋白凍干粉,用適量的無(wú)菌超純水溶解,采用SDS-PAGE對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行分析及表觀相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。以Western Blot鑒定rhIL-29mut33是否表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至NC膜上,用含10%健康兔血清的TBST緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,15 mmol/L NaCl,土溫-20 0.05%,pH 7.2)于4℃封閉過(guò)夜,TBST清洗后用羊抗人IL-29抗體(1∶1 000)于37℃孵育2 h, TBST清洗后用HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶2 500)于37℃孵育1 h,TBST清洗后用DAB試劑顯色。

    1.8 rhIL-29mut33的HPLC純度鑒定

    采用美國(guó)安捷倫公司的Agilent 1100液相色譜系統(tǒng),選擇色譜柱:Agilent C18,300 ?,5 μL反相柱。將純化蛋白質(zhì)的凍干粉用10 mmol/L,pH 7.0的PBS溶解,調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度為2 mg/mL以上,上樣量為20 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm,對(duì)各個(gè)吸收峰進(jìn)行積分,按面積歸一法計(jì)算hIL-29mut33的純度。

    1.9 rhIL-29mut33的抗腫瘤活性分析

    將rhIL-29mut33、野生型rhIL-29、陽(yáng)性對(duì)照IFN-α2b分別設(shè)置50、500、1 000 ng/mL 3個(gè)劑量組,同時(shí)設(shè)置空白和陰性對(duì)照組,每組設(shè)5個(gè)平行孔。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BEL7402、HCT8和SGC7901細(xì)胞,經(jīng)體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL,接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔100 μL(空白孔不接種),置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,吸去上清液;取上述樣品用RPMI-1640完全培養(yǎng)液稀釋,分別按劑量組每孔加入100 μL,空白和陰性對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)液,置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1 h,酶標(biāo)儀測(cè)定A450,計(jì)算rhIL -29mut33對(duì)BEL7402、HCT8以及SGC7901細(xì)胞的增殖抑制率,并運(yùn)用SPSS軟件22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析結(jié)果,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    IR(增殖抑制率)=1-樣品組A450值/陰性對(duì)照組A450值

    2 結(jié)果與討論

    2.1 hIL-29mut33基因的克隆

    按照1.4中的方法進(jìn)行PCR反應(yīng),經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)第一輪PCR產(chǎn)物,在約130 bp處有一明顯的條帶,見(jiàn)圖1泳道1。將目的產(chǎn)物回收純化。以第一輪PCR產(chǎn)物為大引物,進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,PCR產(chǎn)物在約560 bp處有一條特異性的條帶,見(jiàn)圖1泳道2。PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期相符,回收產(chǎn)物與pUCm-T連接的重組質(zhì)粒pUCm-T-hIL-29mut33,經(jīng)測(cè)序鑒定的結(jié)果顯示,基因大小為563 bp,編碼181個(gè)氨基酸,將其序列與hIL-29的編碼基因(登錄號(hào):AY336716.1)比對(duì)顯示第98位堿基T突變?yōu)镃。將hIL-29mut33與pPIC9KM連接得到的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29mut33經(jīng)測(cè)序鑒定,結(jié)果表明目的基因沒(méi)有發(fā)生突變,且讀碼框完全正確。

    圖1 hIL-29mut33的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplifications for hIL-29mut33

    2.2 hIL-29mut33基因在畢赤酵母中的表達(dá)

    按照1.5中的方法,將線性化的pPIC9KM-hIL-29mut33質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞后,經(jīng)G418篩選獲得高拷貝的hIL-29mut33/GS115。將挑選的高拷貝hIL-29mut33/GS115重組子為模板,用引物5’-AOX和3’-AOX進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示,PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為2 100 bp和1 100 bp的產(chǎn)物,2 100 bp的產(chǎn)物為GS115本身的AOX1基因,1 100 bp的產(chǎn)物包括約為600 bp的目的基因(563 bp)和500 bp pPIC9KM質(zhì)粒上的5’-AOX和3’-AOX引物序列之間的片段,見(jiàn)圖2,表明hIL-29mut33基因已成功整合入酵母GS115基因組中。

    2.3 rhIL-29mut33的表達(dá)和鑒定

    挑取hIL-29mut33/GS115菌落常規(guī)誘導(dǎo)表達(dá)72 h,將發(fā)酵上清液按1.6中的方法經(jīng)鹽析、透析、超濾、SP-Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析純化的產(chǎn)物,經(jīng)SDSPAGE分析表明,在約22 600處可見(jiàn)明顯的單一目的蛋白質(zhì)條帶,見(jiàn)圖3泳道3,而GS115/9KM的發(fā)酵液在該處并無(wú)相同條帶,見(jiàn)圖3泳道1。SDS-PAGE結(jié)果顯示,rhIL-29mut33的表觀相對(duì)分子質(zhì)量高于理論計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量(20018.0),這可能由于rhIL-29mut33在酵母GS115表達(dá)過(guò)程中發(fā)生了糖基化修飾[9]。用在線軟件NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu. dk/services/NetNGlyc/)和NetOGlyc 4.0(http://www. cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)分別對(duì)N和O糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果表明hIL-29mut33氨基酸序列中含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和8個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。

    圖2 重組畢赤酵母hIL-29mut33/GS115的PCR檢測(cè)Fig. 2  PCR detections of recombinant P.pastoris hIL -29mut33/GS115

    圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expressed products

    hIL-29mut33/GS115的發(fā)酵上清液經(jīng)Western Blot分析,結(jié)果顯示,重組表達(dá)的rhIL-29mut33與羊抗人IL-29抗體反應(yīng)后在NC膜上呈現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶,其大小約為22 600,見(jiàn)圖4,與SDS-PAGE中的條帶大小相符,但反應(yīng)條帶略有彌散,這可能是Western Blot的放大效應(yīng)所致。

    圖4 rhIL-29mut33的Western Blot鑒定Fig. 4 Western Blotof rhIL-29mut33

    2.4 rhIL-29mut33的HPLC純度鑒定

    采用C18反相柱,在HPLC系統(tǒng)上檢測(cè)純化后rhIL-29mut33的純度。流動(dòng)相為:10%乙腈和0.5%三氟乙酸;洗脫條件為:0~10 min,10%~30%的乙腈和0.5%三氟乙酸;10~20 min,30%~70%的乙腈和0.5%的三氟乙酸。經(jīng)過(guò)面積歸一法計(jì)算,rhIL-29mut33的純度為95.13%,可以用于體外細(xì)胞活性的檢測(cè)。

    2.5 rhIL-29mut33的抗腫瘤活性分析

    按照1.9中的方法,rhIL-29mut33對(duì)BEL7402、HCT8和SGC7901三株腫瘤細(xì)胞的增殖抑制分析結(jié)果表明,各劑量組均顯示增殖抑制效應(yīng),隨著rhIL-29mut33濃度的增加,細(xì)胞增殖抑制率均隨之增加,呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)依賴關(guān)系,見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS軟件22.0,符合方差齊性和正態(tài)分布的數(shù)據(jù),進(jìn)一步做單因素方差分析;p<0.05記作*,表示顯著性差異;p<0.01記作**,表示極顯著差異。

    表1 rhIL-29mut33對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的抑制作用Table 1  Inhibition effects of rhIL -29mut33on different tumor cell lines

    統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,rhIL-29mut33、野生型rhIL-29及商品化的IFN-α2b對(duì)3株腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)略有差異,rhIL-29mut33在低、中、高劑量組對(duì)BEL7402細(xì)胞抑制作用均強(qiáng)于野生型rhIL-29及IFN-α2b,其高劑量組的抑制率達(dá)到(31.76± 2.87)%,見(jiàn)圖5,極顯著地抑制了BEL7402細(xì)胞的增殖。

    圖5 rhIL-29mut33對(duì)BEL7402細(xì)胞的抗增殖活性分析Fig. 5  Antiproliterative activities analysis of rhIL-29mut33in BEL7402 cells

    高劑量組的rhIL-29mut33、rhIL-29及IFN-α2b 對(duì)HCT8細(xì)胞的增殖抑制率分別為(22.47±0.26)%、(20.38±1.23)%和(27.16±1.22)%,表明rhIL-29mut33、rhIL-29對(duì)HCT8細(xì)胞的抑制效應(yīng)低于IFN-α2b,而rhIL-29mut33和rhIL-29對(duì)HCT8細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)差異不大,見(jiàn)圖6。

    圖6 rhIL-29mut33對(duì)HCT8細(xì)胞的抗增殖活性分析Fig. 6  Antiproliterative activities analysis of rhIL-29mut33in HCT8 cells

    對(duì)SGC7901細(xì)胞的增殖抑制分析結(jié)果顯示,rhIL-29mut33表現(xiàn)出良好的細(xì)胞增殖抑制能力,rhIL-29mut33、rhIL-29及IFN-α2b的高劑量組對(duì)該細(xì)胞的增殖抑制率分別為(34.41±0.40)%、(29.09±1.76)%和(27.74±1.25)%,見(jiàn)圖7。三者均表現(xiàn)出顯著的增殖抑制效應(yīng),但rhIL-29mut33的抑制作用更強(qiáng),極顯著地抑制了SGC7901細(xì)胞的增殖。

    圖7 rhIL-29mut33對(duì)SGC7901細(xì)胞的抗增殖活性分析Fig. 7  Antiproliterative activities analysis of rhIL-29mut33in SGC7901 cells

    分析結(jié)果表明,不同劑量組的變異體rhIL-29mut33對(duì)這3種腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用,且隨著藥物質(zhì)量濃度的增加,增殖抑制率也隨之增加。對(duì)于HCT8細(xì)胞,rhIL-29mut33的抑制作用強(qiáng)于野生型rhIL-29,但弱于商品化的IFN-α2b;而對(duì)于BEL7402和SGC7901細(xì)胞,rhIL-29mut33的抑制作用強(qiáng)于野生型rhIL-29和商品化IFN-α2b,表現(xiàn)出極顯著的抗腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)。

    3 結(jié)語(yǔ)

    近年來(lái),隨著對(duì)hIL-29生物學(xué)活性的研究日益廣泛和深入,hIL-29由于具有與IFN-α相似的抗病毒和抗腫瘤活性以及細(xì)胞靶向性而引起越來(lái)越多研究者的關(guān)注。已有研究表明,hIL-29的突變可以影響它的抗病毒和抗腫瘤活性,而且很多突變被假設(shè)且與受體聯(lián)系起來(lái)[13]。作者在前期研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合生物信息學(xué)分析,采用定點(diǎn)突變方法對(duì)hIL-29 的A、F螺旋中4個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)之一的Lys33進(jìn)行分子改造,以改變hIL-29與受體結(jié)合的親和性,從而提高其生物學(xué)活性。

    作者采用定點(diǎn)突變和大引物PCR技術(shù)成功克隆出hIL-29mut33的編碼基因并在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá),獲得的rhIL-29mut33表現(xiàn)出良好的抗增殖活性。對(duì)于BEL7402、HCT8和SGC7901這3種腫瘤細(xì)胞,不同劑量的rhIL-29mut33均具有抗腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng),而且對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用均強(qiáng)于野生型rhIL-29。同時(shí)隨著藥物質(zhì)量濃度的增加,細(xì)胞增殖抑制率均隨之增加。高劑量的rhIL-29mut33對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng),對(duì)上述3種細(xì)胞的細(xì)胞抑制率分別達(dá)到(31.76±2.87)%、(22.47±0.26)%和(34.41±0.40)%。本研究成果為hIL-29分子改造的深入研究奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為后續(xù)研制高效的干擾素抗腫瘤藥物提供參考。

    參考文獻(xiàn):

    [ 1 ] Sheppard P,Kindsvogel W,Xu W,et al. IL-28,IL-29 and their classⅡcytokine receptor IL-28R [J]. Nature Immunology,2003,4(1):63-68.

    [ 2 ] Kotenko SV,Gallagber G,Baurin W,et al. IFN-λs mediate antiviral protection through a distinct classⅡcytokine receptor complex[J]. Nature Immunology,2003,4(1):69-77.

    [ 3 ] Zhou Z,Hamming OJ,Ank N,et al. Type III interferon(IFN)induces a type I IFN-like response in a restricted subset of cells through signaling pathways involving both the Jak-STAT pathway and the mitogen-activated protein kinases [J]. Virology,2007,81(14):7749-7758.

    [ 4 ] Witte K,Gruetz G,Volk HD,et al. Despite IFN-lambda receptor expression,blood immune cells,but not keratinocytes or melanocytes,have an impaired response to type III interferons:implica- tions for therapeutic applications of these cytokines[J]. Genesandimmunity,2009,10(8):702-714.

    [ 5 ] Meager A,Visvalingam K,Dilger P,et al. Biological activity of interleukins-28 and -29:comparison with type I interferons[J]. Cytokine,2005,31(2):109-118.

    [ 6 ] Zitzmann K,Brand S,Baehs S,et al. Novel interferon-lambdas induce antiproliferative effects in neuroendocrine tumor cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,344(4):1334-1341.

    [ 7 ] Doyle SE,Schreckhise H,Khuu-Duong K,et al. Interleukin-29 uses a type 1 interferon-like program to promote antiviral responses in human hepatocytes[J]. Hepatology,2006,44(4):896-906.

    [ 8 ] Li Q,Kawamura K,Ma G,et al. Interferon- lambda induces G1 phase arrest or apoptosis in oesophageal carcinoma cells and produces anti-tumour effects in combination with anti-cancer agents[J]. European Journal of Cancer,2010,46(1):180-190.

    [ 9 ] Zachary JM,Eugenia M,Wei L,et al. Crystal structure of human interferon-λ1 incomplex with its high-affinity receptor interferon-λR1[J]. Journal of Molecular Biology,2010,404(4):650-664.

    [10]鄭海軍,朱榮,葛春蕾,等.人白細(xì)胞介素-29的生物信息學(xué)分析[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2013,26(2):209-212. ZHENG Haijun,ZHU Rong,GE Chunlei,et al. Bioinformatics of human interleukin-29 [J]. Chinese Journal of Biologicals,2013,26(2):209-212.(in Chinese)

    [11]陳偉,于明磊,鄭海軍,等.人白細(xì)胞介素-29基因的克隆和真核表達(dá)[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2012,25(4):446-448. CHEN Wei,YU Minglei,ZHENG Haijun,et al. Cloning and eukaryotic expression of human interleukin-29 gene [J]. Chinese Journal of Biologicals,2012,25(4):446-448.(in Chinese)

    [12]鄭海軍,陸源,陳偉,等.天然N-末端人白細(xì)胞介素-29成熟肽在畢赤酵母中表達(dá)條件的優(yōu)化[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2013,26(3):402-405. ZHENG Haijun,LU Yuan,CHEN Wei,et al. Optimization of condition for expression of native N-terminus of human interleukin-29 mature peptide in Pichia pastoris[J]. Chinese Journal of Biologicals,2013,26(3):402-405.(in Chinese)

    [13] Gad H H,Dellgren C,Hamming O J,Vends S,et al. Interferon- {lambda} is functionally an interferon but structurally related to the interleukin-10 family[J]. Biological Chemistry,2009,284(31):20869-20875.

    Expression of Recombinant Human Interleukin-29 Mutant in Pichia pastoris and Antitumor Analysis

    LU Yuan1,CHEN Wei*2,LI Liyun3,PENG Ronggang2,LI Fei2,WU Minchen2
    (1. School of Medicine Science,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2. Wuxi Medical School,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3. School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

    Abstract:Based on results of the bioinformatics analysis,a mutant of recombinant human interleukin 29(rhIL-29mut33)was constructed by site-directed mutagenesis and megaprimer PCR. Then,it was successfully expressed in Pichiapastoris GS115. The rhIL-29mut33showed strong anti-proliferation effects on liver cancer cell BEL7402,colon cancer cell HCT8,and gastric cancer cell SGC7901 at different concentrations,and all of them showed stronger than that of wild type rhIL-29. At a high concentration of the rhIL-29mut33,the inhibition ratios of the three tumor cells were (31.76±2.87)%,(22.47±0.26)%,and(34.41±0.40)%,respectively. The superior biological activities of rhIL-29mut33,especially the antitumor activity,make it have great potential applications in the drug industry.

    Keywords:human interleukin-29,site-directed mutation,gene cloning,expression,antineoplastic activity

    *通信作者:陳偉(1956—),男,江西宜豐人,醫(yī)學(xué)博士,副教授,碩士研究生導(dǎo)師,主要從事免疫學(xué)和生物制藥方面的研究。E-mail:chenwei@jiangnan.edu.cn

    基金項(xiàng)目:國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201210295024)。

    收稿日期:2014-07-07

    中圖分類號(hào):Q 78

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1673—1689(2016)02—0185—07

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