CRISPR/Cas 系統(tǒng)在基因修飾植物及其產(chǎn)品檢測(cè)應(yīng)用中的原理和進(jìn)展

王渭霞 朱廷恒 賴鳳香 萬品俊 魏琪 傅強(qiáng)

（1 中國水稻研究所/水稻生物育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310006；2 浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，杭州 310014；第一作者：wangweixia@caas.cn；*通信作者：thzhu@zjut.edu.cn；fuqiang@caas.cn）

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced shorted palindromic repeats, CRISPR）及其相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein, Cas 蛋白） 系統(tǒng)CRISPR/Cas 是古細(xì)菌等微生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的一種抵御外來DNA 入侵的保護(hù)機(jī)制[1-2]，通過該系統(tǒng)將初次入侵生物的部分保守DNA 短序列剪切后作為間隔序列整合到重復(fù)序列之間形成記憶庫。整合的外源生物DNA 轉(zhuǎn)錄的crRNA（CRISPR RNA）可精準(zhǔn)識(shí)別再次入侵生物DNA，并啟動(dòng)該系統(tǒng)的核酸切割功能，從而保護(hù)自己不被侵染裂解死亡[3-4]。基于CRISPR系統(tǒng)精準(zhǔn)識(shí)別和切割基因組的功能發(fā)展而成的基因編輯技術(shù)像一把“魔剪”，不僅能“剪切”基因，還能用于“修補(bǔ)”基因。該技術(shù)在生命科學(xué)和技術(shù)領(lǐng)域顯示出強(qiáng)大的生命力，可以對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行敲除、插入和堿基定點(diǎn)替換等精準(zhǔn)編輯，在物種基因組修飾、基因工程等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域可用來提高作物產(chǎn)量、增加抗性、改良品質(zhì)以及創(chuàng)制雄性不育和固定雜種優(yōu)勢(shì)[5-6]。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)的開發(fā)應(yīng)用越來越廣泛，除了crRNA 引導(dǎo)的靶標(biāo)DNA 區(qū)精準(zhǔn)編輯，部分Cas 蛋白還會(huì)通過Cas 蛋白/crRNA/靶DNA 三元復(fù)合物啟動(dòng)非特異性降解單鏈DNA(ssDNA)/單鏈RNA(ssRNA)，也被稱為反式切割?；诖耍珻RISPR/Cas 系統(tǒng)也被廣泛應(yīng)用于快速分子檢測(cè)，包括病原微生物、單核苷酸突變等檢測(cè)領(lǐng)域，展現(xiàn)出特異性高、靈敏度高、無需特殊儀器、快速準(zhǔn)確等突出優(yōu)勢(shì)[7-9]。本文綜述了CRISPR 系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因以及基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)介紹

1987 年，ISHINO 等[10]在對(duì)K12 大腸桿菌中的堿性磷酸酶基因測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)，其附近有許多串聯(lián)間隔的重復(fù)序列，2002 年JANSEN 等[11]將其命名為CRISPR 序列。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CRISPR 的間隔序列與噬菌體的某些序列存在著高度同源性[1]，隨后證實(shí)細(xì)菌可利用CRISPR 系統(tǒng)抵御噬菌體入侵和外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移[12-13]。CRISPR 的保守重復(fù)序列長(zhǎng)度為25~50 bp，間隔片段長(zhǎng)度為26~72 bp，二者間隔串聯(lián)而成[14]，這些串聯(lián)重復(fù)序列源于不同時(shí)間、不同噬菌體的感染整合，存在于40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中[12]。自2011 年起，CRISPR/Cas 系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫機(jī)理不斷被揭示，CRISPR／Cas 系統(tǒng)由CRISPR 基因座、Cas 蛋白和tracrRNA（trans-activating RNA）三部分組成。CRISPR 的前導(dǎo)序列轉(zhuǎn)錄為前體crRNA（pre-CRISPR-derived RNA），pre-crRNA經(jīng)RNA 內(nèi)切酶切割生成含有與噬菌體靶標(biāo)序列匹配的成熟CRISPR RNA ( crRNA)，crRNA 通過堿基配對(duì)與tracrRNA 結(jié)合形成tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)Cas 蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)序列的識(shí)別和切割[15]。Cas 蛋白對(duì)靶標(biāo)序列的識(shí)別必須依賴于間隔序列毗鄰基序( Protospacer adjacent motif，PAM)。tracrRNA 的功能主要是連接crRNA 和Cas 蛋白。后來通過人工設(shè)計(jì)將crRNA 和tracrRNA 改造合并成一條具有引導(dǎo)作用的sgRNA（single guide RNA），可同樣實(shí)現(xiàn)引導(dǎo)Cas 蛋白對(duì)目標(biāo)DNA 的定點(diǎn)切割[16]。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)根據(jù)其組成和功能可分為兩大類群：第一類由多個(gè)Cas 組成的效應(yīng)復(fù)合體行使功能；第二類則由單個(gè)多結(jié)構(gòu)域的Cas 組成，包括Ⅱ型的Cas9、Ⅴ型的Cas12 和Ⅵ型的Cas13[17]。第二類系統(tǒng)簡(jiǎn)單，蛋白分子量小，操作方便，是目前主要應(yīng)用的基因編輯系統(tǒng)。其中，通過融合胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑的Cas 蛋白可高效地對(duì)靶向位點(diǎn)內(nèi)的特定堿基進(jìn)行替換，進(jìn)一步提高了定點(diǎn)基因精準(zhǔn)編輯的功能[18-19]。

2 CRISPR/Cas 在分子檢測(cè)中的應(yīng)用

在Cas 蛋白切割靶標(biāo)DNA 的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)某些Cas蛋白會(huì)啟動(dòng)其附帶“切割活性”，完成對(duì)其他非靶標(biāo)DNA 或RNA 的任意切割。這一特性為檢測(cè)樣品是否含有某目的DNA/RNA 序列提供了可行性。例如，合成含特異性識(shí)別靶標(biāo)序列（目標(biāo)序列）的sgRNA 和切割非特異性序列（熒光報(bào)告核酸）的檢測(cè)系統(tǒng)，一旦sgRNA 檢測(cè)到目的序列，系統(tǒng)將啟動(dòng)，熒光報(bào)告核酸也會(huì)被降解，從而釋放出熒光信號(hào)。截至目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)里有三類單一效應(yīng)蛋白（Cas12、Cas13 和Cas14）被報(bào)道具有非特異性切割核酸特性，可用于分子診斷檢測(cè)[20-24]?；诓煌珻as 的核酸切割功能，開發(fā)出了SHERLOCK （Cas13a/RNA）、DETECTR [Cas12a/dsDNA（雙鏈DNA）或Cas14a/ssDNA]等核酸檢測(cè)系統(tǒng)（圖1），并成功應(yīng)用于SARS-CoV-2、寨卡病毒、埃博拉病毒、HPV 和結(jié)核分枝桿菌等的檢測(cè)[9，25]。

圖1 三種Cas 蛋白附屬切割活性進(jìn)行分子診斷的示意圖[9]

2.1 基于Cas13a 的分子檢測(cè)

Cas13a 屬于第二類中VI 型CRISPR-Cas 蛋白，可在gRNA 的引導(dǎo)下靶向單鏈RNA，激活單鏈RNA 酶活性，并啟動(dòng)非特異性切割RNA 特性[26]。DOUDNA 團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一端帶有熒光素另一端帶有淬滅集團(tuán)的熒光報(bào)告RNA，Cas13a 在匹配到靶標(biāo)RNA 后即可非特異性切割環(huán)境中的熒光報(bào)告RNA，釋放熒光素并發(fā)出熒光，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)RNA 檢測(cè)。采用該技術(shù)成功檢測(cè)了噬菌體RNA，靈敏度達(dá)0.01 nM[20]?；诖?，重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplificatin，RPA）相結(jié)合設(shè)計(jì)出SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）技術(shù)，使得樣本中低濃度的靶標(biāo)分子DNA 首先通過RPA 擴(kuò)增后轉(zhuǎn)錄或RNA 分子通過逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（RT-RPA）得到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，再采用Cas13a-gRNA 與熒光報(bào)告RNA 檢測(cè)，大幅提高了檢測(cè)靈敏度?？稍? h 內(nèi)直接從患者樣本（如血清、尿液和唾液）中以低至每1 μL 1 個(gè)拷貝的濃度直接檢測(cè)寨卡病毒（ZIKV）和登革熱病毒（DENV）[27]。在升級(jí)版的SHERLOCKv2 中，使用4 種不同的Cas13和Cas12 酶的組合，在單個(gè)反應(yīng)中可檢測(cè)到4 種靶標(biāo)核酸序列，并通過使用CRISPR 相關(guān)酶Csm6 提高Cas13 活性，使檢測(cè)靈敏度提高了約3.5 倍[28]。

2.2 基于Cas12a 的分子檢測(cè)

Cas12a 是第二類V 型CRISPR-Cas 蛋白，含有RuvC 催化結(jié)構(gòu)域可識(shí)別富含T 的靶向序列，在sgRNA的引導(dǎo)下特異性切割雙鏈DNA（dsDNA）或單鏈DNA（ssDNA）并產(chǎn)生附屬的ssDNA 酶活性[21，23]?；诖?，通過將CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)與RPA 相結(jié)合，開發(fā)了一種新的DNA 內(nèi)切酶靶向CRISPR 反式報(bào)告器DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）用于核酸檢測(cè)（圖1）。該技術(shù)被成功應(yīng)用于HPV 病毒的分型檢測(cè)[21]，DNA 病毒pseudorabies virus (PRV) 和RNA 病毒Japanese encephalitis virus (JEV)的檢測(cè)[23]。與SHERLOCK 相比，該技術(shù)體系減少了從擴(kuò)增后的DNA轉(zhuǎn)錄到RNA 這一步，其熒光報(bào)告分子為DNA 探針，易于保存。隨著類似于Cas12a 活性的其他Cas 蛋白如Cas12b 等的發(fā)現(xiàn)，基于Cas12 的核酸檢測(cè)系統(tǒng)得到了一系列改進(jìn)，集成了多種擴(kuò)增方法（包括PCR、RPA、LAMP）和單一讀數(shù)形式（例如熒光檢測(cè)器、裸眼觀察和側(cè)向流動(dòng)分析），使該方法更靈敏、準(zhǔn)確、便攜且更易于使用[25，29]。

2.3 基于Cas14a 的分子檢測(cè)

古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)一種具有400~700 個(gè)氨基酸組成的屬于第二類系統(tǒng)Ⅴ型的Cas14 蛋白，具有典型的RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域，可靶向ssDNA，在激活后剪切靶ssDNA和非特異性地剪切環(huán)境中的ssDNA[22]。Cas14 對(duì)靶標(biāo)序列沒有前間區(qū)序列鄰近基序的限制，所以可以靶向任何序列，但對(duì)識(shí)別序列中間的堿基的要求很嚴(yán)格，有1個(gè)錯(cuò)配就不能結(jié)合，特異性能達(dá)到單堿基。但由于Cas14-sgRNA 只識(shí)別ssDNA，因此在檢測(cè)應(yīng)用中需要對(duì)靶序列擴(kuò)增的引物進(jìn)行修飾，如使用含硫代磷酸（phosphorothioate oligonucleotide，PT）的引物擴(kuò)增DNA底物，以保護(hù)一條鏈不被核酸外切酶降解。擴(kuò)增產(chǎn)物加入T7 核酸外切酶后，帶有未修飾引物的鏈被降解，留下一條可被Cas14a 檢測(cè)的ssDNA 底物。利用該系統(tǒng)成功區(qū)別了與人類眼睛顏色有關(guān)的HERC2基因SNP（圖2），首先通過設(shè)計(jì)一條與藍(lán)色眼睛的目標(biāo)序列嚴(yán)格互補(bǔ)sgRNA，與sgRNA 互補(bǔ)鏈的引物含有PT，對(duì)唾液樣本中HERC2基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)T7 核酸外切酶酶切后，得到的藍(lán)色眼睛ssDNA 與sgRNA 互補(bǔ)并啟動(dòng)Cas14a 的ssDNA 切割活性，隨后啟動(dòng)其非特異切割活性，使熒光報(bào)告探針釋放出熒光得到檢測(cè)，而僅有1個(gè)堿基之差的（G-T）的褐色眼睛的ssDNA 得不到檢測(cè)。而Cas12 系統(tǒng)則無法區(qū)別這種單堿基突變的樣本。因此，通過將Cas14 的非特異性ssDNase 切割活性與等溫?cái)U(kuò)增法相結(jié)合（DETECTR-Cas14），可用于高保真度DNA 單核苷酸多態(tài)性基因分型，可能在傳染性和非傳染性疾病的CRISPR 診斷領(lǐng)域獲得指數(shù)級(jí)擴(kuò)展[30]。

圖2 利用Cas14 系統(tǒng)檢測(cè)人類HERC2 基因單堿基突變的示意圖

3 基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)

根據(jù)檢測(cè)對(duì)象不同，基于核酸的植物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)包括對(duì)常用的轉(zhuǎn)基因元件啟動(dòng)子（CaMV35S、FMV35S）、終止子（NOS、E9’3、T-CaMV35S）、選擇標(biāo)記基因（NPTII、HPT）及目的基因（Bt、Bar、Pat、EPSPS）篩選檢測(cè)，對(duì)載體構(gòu)建的構(gòu)建特異性檢測(cè)，以及對(duì)插入受體基因組的邊界序列的轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)。檢測(cè)通常采用定性PCR、熒光定量PCR 和數(shù)字PCR 等方法。常規(guī)PCR 需要在擴(kuò)增儀上經(jīng)過變性、退火、延伸三個(gè)步驟來完成擴(kuò)增。環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）和RPA 反應(yīng)最適溫度分別為65 ℃和37 ℃，不需要復(fù)雜的溫控設(shè)備，可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式快速核酸檢測(cè)，從而替代PCR 檢測(cè)技術(shù)[31-32]。CRISPR/Cas 檢測(cè)結(jié)合LAMP 或RPA 技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。其中，Cas12 檢測(cè)靶標(biāo)為雙鏈DNA 分子，與轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)的雙鏈DNA 一致，因此，Cas12 最有望應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)。

3.1 基于Cas12a 的轉(zhuǎn)Cry1C 基因的水稻的檢測(cè)

結(jié)合RPA 技術(shù)，通過合成sgRNAs 引導(dǎo)Cas12a 蛋白結(jié)合到RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物和單鏈DNA 報(bào)告探針（5-FAM-TTATT-Quencher-3），對(duì)轉(zhuǎn)Cry1C基因水稻實(shí)現(xiàn)高效檢測(cè)[33]。設(shè)計(jì)了4 種與Cry1C不同位置互補(bǔ)的sgRNA（1-4）引導(dǎo)Cas12a，檢測(cè)了對(duì)RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物和報(bào)告探針的切割活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cas12a 的靶標(biāo)DNA切割活性獨(dú)立于單鏈DNA 報(bào)告探針切割活性，檢測(cè)能力主要依賴于gRNA，其中sgRNA1 和sgRNA3 對(duì)靶標(biāo)DNA 的切割活性可達(dá)100%，sgRNA1 對(duì)DNA 報(bào)告探針的切割活性顯著高于其他sgRNA。

該體系只需要合成長(zhǎng)度為30~35 nt 的RPA 擴(kuò)增用引物，基因組DNA 與擴(kuò)增酶在緩沖液中37 ℃溫浴10 min 獲得RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后添加1 μM Cas12a、100 ng sgRNA 和1 μL 單鏈DNA 報(bào)告探針，37 ℃溫浴10~60 min。反應(yīng)產(chǎn)物通過膠體金試紙條就可以在5~10 min 內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果（圖3）。該技術(shù)體系要點(diǎn)：RPA擴(kuò)增產(chǎn)物需含有Cas12a 蛋白切割識(shí)別的PAM 序列TTTG；其次緊隨PAM 序列后的sgRNA 序列與目標(biāo)序列的一致性是檢測(cè)特異性的關(guān)鍵，錯(cuò)配1 個(gè)堿基都會(huì)影響Cas12a 蛋白的切割活性。sgRNA 序列包含有引導(dǎo)序列和保守的莖環(huán)序列。以sgRNA1 為例：RPA 擴(kuò)增引物分別設(shè)計(jì)在Cry1C基因序列（GenBank 登錄號(hào)：HM107006.1）的156~185 bp 和506~537 bp 處，擴(kuò)增產(chǎn)物位于156~537 處，長(zhǎng)度328 bp。sgRNA1 則設(shè)計(jì)在227~250 bp處，序列為5’-TCGTTCAGATCGAACAGCTCATCA-3’，上游PAM 序列為223-TTTC-226。首先合成寡核苷酸序列sgDNA：5’-tgatgagctgttcgatctgaacgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC -3’，其中小寫字母為靶標(biāo)序列（227~250 bp）的互補(bǔ)序列，大寫字母為T7 啟動(dòng)子互補(bǔ)序列，大寫斜體為形成sgRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的核心序列，該序列通過與T7 啟動(dòng)子序列退火合成雙鏈后即可利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄獲得sgRNA1（圖4）。

圖3 基于Cas12a 的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)示意圖[33]

圖4 Cry1Ac 的sgRNA1 序列合成示意圖(A)和二級(jí)結(jié)構(gòu)（B）

3.2 基于Cas12a 的CaMV35S 啟動(dòng)子的檢測(cè)

結(jié)合LAMP，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的外源啟動(dòng)子CaMV35S（GenBank 登錄號(hào)GU734659.1）的644~934 bp處進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增片段中需含有可以激活Cas12a 活性的PAM 序列即富含T 的TTTN，單鏈DNA 報(bào)告探針為5’6-FAM-TTATT-3’BHQ1 和可引導(dǎo)Cas12a 蛋白靶向LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物中CaMV35S擴(kuò)增子的sgRNA。sgRNA 包括可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的核心序列UAAUUU CUACUAAGUGUAGAU 和目標(biāo)序列CUUUAUCGCAA UGAUGGCAUU。目標(biāo)序列DNA 位于GU734659.1 717~737 bp 處，序列為CTTTATCGCAATGATGGCATT，上游為PAM 序列TTTC。在sgRNA 中只是“T”被“U”取代（圖5）。在37 ℃下CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)與擴(kuò)增產(chǎn)物溫浴5 min 就可在紫外光下肉眼快速識(shí)別檢測(cè)結(jié)果。所建立的方法能顯著區(qū)分特異性擴(kuò)增和非特異性擴(kuò)增。檢測(cè)限可達(dá)轉(zhuǎn)基因含量0.05%[34]。將LAMP 反應(yīng)和Cas12a 檢測(cè)試劑混合在1 個(gè)反應(yīng)管中可有效防止源頭污染，無需額外試劑，使操作過程更加快捷方便。

圖5 CaMV35S 的sgRNA 序列二級(jí)結(jié)構(gòu)和CaMV35S 擴(kuò)增子的對(duì)應(yīng)靶標(biāo)DNA 序列示意圖

4 展望

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中，開發(fā)低成本、準(zhǔn)確、高效和快速的檢測(cè)方法非常重要。相較于PCR 為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，CRISPR/Cas 系統(tǒng)顯示出其優(yōu)越性，有助于實(shí)現(xiàn)多種基因修飾產(chǎn)品的高靈敏度、高精度檢測(cè)，包括現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

CRISPR/Cas 檢測(cè)系統(tǒng)顯著拓寬了可檢測(cè)對(duì)象核酸種類。充分利用Cas 蛋白的附屬切割活性多樣性功能，可對(duì)不同種類和構(gòu)象的靶標(biāo)核酸進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)。Cas12 擅長(zhǎng)識(shí)別雙鏈DNA，Cas13 擅長(zhǎng)識(shí)別單鏈RNA，而Cas14 則擅長(zhǎng)識(shí)別單鏈DNA。這對(duì)提高不同基因修飾產(chǎn)品及其不同核酸樣品的準(zhǔn)確率提供技術(shù)保障。

CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)在基因修飾產(chǎn)品的檢測(cè)應(yīng)用中才剛剛起步。通常，針對(duì)不同轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，可開發(fā)一套常用元件的基因編輯檢測(cè)技術(shù)以及身份特異性快速檢測(cè)，應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管有重要意義。目前已經(jīng)開發(fā)出的針對(duì)Cry1C和CaMV35s啟動(dòng)子的CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)為轉(zhuǎn)基因植物的篩選檢測(cè)開啟了先河。針對(duì)每一個(gè)市場(chǎng)化轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的身份特異性快速檢測(cè)可為育種者知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)以及杜絕假種行為提供支撐，該技術(shù)的關(guān)鍵是合成特異性強(qiáng)、可誘導(dǎo)強(qiáng)切割活性的sgRNA。因此，針對(duì)特定檢測(cè)的靶標(biāo)序列對(duì)比研究獲得靈敏度高、特異性高的sgRNA 是實(shí)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)基因植物快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的先決條件。

相比于轉(zhuǎn)基因技術(shù)即將異源物種DNA 導(dǎo)入到目標(biāo)物種內(nèi)并隨機(jī)整合到目標(biāo)物種染色體上的技術(shù)，利用CRISPR/Cas 的基因編輯技術(shù)是對(duì)物種自身靶基因?qū)嵤┑亩c(diǎn)修飾，在此過程中會(huì)有載體序列等外源DNA 序列殘留。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因植物被插入大片段外源基因序列的情況不同，基因組編輯技術(shù)在改造的受體生物體內(nèi)留下的痕跡較少，已有的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法不能完全適用，給基因組編輯植物及其產(chǎn)品的檢測(cè)帶來新的挑戰(zhàn)[35]。對(duì)于含有外源短片段DNA 的基因編輯產(chǎn)品可借助于第二代測(cè)序技術(shù)和FED（foreign element detection）網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)庫實(shí)現(xiàn)外源DNA 成分的檢測(cè)識(shí)別[36]。FED 已經(jīng)內(nèi)置了24 種植物和13 種動(dòng)物的參考基因組信息，整理歸類了美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information）和addgene（https://www.addgene.org）等生物數(shù)據(jù)庫收集的各國科研人員遞交的不同物種的各類載體序列信息，并依此建立了外源成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。而對(duì)于無外源DNA 引入的基因編輯修飾產(chǎn)品，尤其是單核苷酸改變的情況，主要依賴DNA 測(cè)序、限制性內(nèi)切酶分析法、T7 核酸內(nèi)切酶分析法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法、高分辨率熔解曲線分析法和熒光探針PCR 檢測(cè)等極為復(fù)雜的檢測(cè)手段[37-38]。這些檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、需要昂貴的儀器設(shè)備，且檢測(cè)的準(zhǔn)確率也有待提高?；诨蚓庉嬒到y(tǒng)的sgRNA 與靶序列的準(zhǔn)確識(shí)別功能有望實(shí)現(xiàn)對(duì)單核苷酸突變的基因編輯產(chǎn)品的準(zhǔn)確識(shí)別和檢測(cè)。