巨噬細胞極化在腱骨愈合中的研究進展

李建 甄東 郭彩芬

正常肌腱止點是一系列高度特異排序的組織，包括骨、鈣化的纖維軟骨層、非鈣化的纖維軟骨層和肌腱[1]。這一結構在力學傳導中能避免應力集中，提供足夠的強度[2]。手術修復是腱骨界面損傷的主要治療手段，術中為了促進腱骨愈合需要對骨及肌腱組織進行新鮮化，清除殘留的纖維軟骨層，但在愈合過程中腱骨界面的纖維軟骨層再生很困難。多項研究表明，通過促進腱骨愈合過程中纖維軟骨層形成，能明顯提高腱骨愈合后的生物力學強度[3-5]。這說明腱骨愈合的核心問題是肌腱與骨之間纖維軟骨層的形成。因此，如何提高腱骨界面纖維軟骨層的形成是腱骨愈合的關鍵。

巨噬細胞參與機體損傷應答，在組織炎癥調(diào)控、修復中發(fā)揮重要作用[2]。在炎癥微環(huán)境中巨噬細胞可極化為經(jīng)典活化性巨噬細胞 (M1 型) 和選擇活化性巨噬細胞 (M2型)[2]。研究表明，巨噬細胞浸潤貫穿腱骨愈合的整個階段，其功能也隨著病情進展而發(fā)生改變，在損傷的早期主要以 M1 型巨噬細胞浸潤，分泌重組人白細胞介素-1β(human IL-1 beta protein，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) 等促炎因子，參與清除病原體并促進成纖維細胞增殖，而隨后巨噬細胞極化為 M2 型，分泌大量的白介素-10 (interleukin-10，IL-10)、乙型轉(zhuǎn)化生長因子 (transforming growth factor beta，TGF-β) 等抗炎因子促進組織的修復[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，誘導 M1 型巨噬細胞極化為具有抗炎作用的 M2 型可降低肌腱損傷后炎癥水平，并改善肌腱的生物力學性能[8-9]。因此，誘導巨噬細胞表型改變有望成為治療腱骨愈合的有效策略。筆者廣泛查閱近年國內(nèi)外有關巨噬細胞極化在腱骨愈合治療作用的相關研究報道，以“巨噬細胞”“腱骨”“愈合”“腱骨愈合”“機制”作為關鍵詞，在中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)庫中進行檢索；以“macrophage”“tendon-bone”“healing”“tendon-bone healing”“mechanism”為主題詞，在 PubMed、Web of Science、Embase 數(shù)據(jù)庫檢索。對巨噬細胞極化在腱骨愈合中的作用進行總結，為后續(xù)腱骨愈合的研究提供新思路。

一、腱骨界面的結構和功能

腱骨界面結構復雜，它雖然很窄，大約為 200 μm 至1 mm 之間，卻存在典型的四層結構：骨組織、鈣化的纖維軟骨層、非鈣化的纖維軟骨層和肌腱。第一層是肌腱/韌帶組織，主要由成纖維細胞填充，具有與肌腱/ 韌帶相似的力學特性。細胞外基質(zhì)主要由線狀排列的 Ⅰ 型膠原纖維組成[1]。第二層是未鈣化的纖維軟骨，主要由纖維軟骨細胞和細胞外基質(zhì)組成，纖維軟骨細胞沿肌腱方向呈柱狀排列，細胞外基質(zhì)主要由 Ⅱ 型和 Ⅲ 型膠原及少量的蛋白多糖和核心蛋白[1]。第三層是鈣化的纖維軟骨，細胞主要為肥厚的纖維軟骨細胞，細胞外基質(zhì)主要是 Ⅱ 型膠原[1]。第四層是骨組織，細胞由骨細胞、成骨細胞和破骨細胞組成，細胞外基質(zhì)為礦化的 Ⅰ 型膠原。

盡管腱骨界面被分為典型的四層結構，且每層結構的組織成分不同，但這四層在結構上是連續(xù)的，具有明顯的梯度變化特點，使得力學特性也逐漸發(fā)生變化，由質(zhì)硬的骨組織逐漸過渡到柔軟的肌腱組織，在力學傳導中避免了應力集中，提供足夠的強度傳導強大的肌肉力量，從而提供一種獨特的機制來減少腱骨界面處的應力集中[10-11]。

手術為腱骨界面損傷的主要治療方法，臨床研究表明，將斷裂的肌腱通過手術重新至骨組織上，腱骨愈合界面不再是典型的四層結構，而多為瘢痕組織所替代，由于瘢痕組織的細胞外基質(zhì)不規(guī)則，彈性降低，缺乏應力分散作用，其生物力學性能顯著降低，導致術后再撕裂率增加[11]。腱骨界面的復雜結構奠定了其力學特性的基礎[12]。因此，腱骨界面愈合的主要問題是如何恢復腱骨界面的正常梯度結構。

二、巨噬細胞在腱骨愈合中的作用

腱骨愈合包括三個階段：炎癥期、修復期和重塑期[13]。第一階段為炎癥期，主要表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤 (如中性粒細胞和單核細胞)，巨噬細胞吞噬消化壞死物質(zhì)，持續(xù)約 3 天。第二階段為修復期，本階段巨噬細胞釋放生長因子招募和活化肌腱成纖維細胞，共同合成纖連蛋白、Ⅲ 型膠原蛋白和初始無定形的細胞外基質(zhì)，而后 Ⅲ 型膠原蛋白逐漸被更牢固的 Ⅰ 型膠原蛋白替代，這一階段持續(xù)約數(shù)周。第三階段為重塑期，此階段腱細胞的新陳代謝很旺盛，而且腱細胞和膠原纖維開始沿應力方向排列以恢復抗拉強度和肌腱剛度。此外，Ⅲ 型膠原蛋白繼續(xù)轉(zhuǎn)化為 Ⅰ 型膠原蛋白，肌腱成纖維細胞逐漸分化為成肌纖維細胞。

腱骨愈合是機體內(nèi)損傷后組織的修復過程，炎癥反應在其中起著重要的作用，參與組織修復的巨噬細胞貫穿整個愈合過程，通過分泌各種炎癥因子和生長因子調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和細胞外基質(zhì)形成，在炎癥早期階段，外周血、骨髓和滑膜組織中的 M0 巨噬細胞被募集到腱骨界面，主要極化為 M1 型巨噬細胞，清除壞死物質(zhì)，如過度活化后會影響腱骨愈合；而在隨后的修復和重塑階段，以M2 型巨噬細胞占主導地位，可促進腱骨愈合[13]。

1.巨噬細胞極化的調(diào)控機制：巨噬細胞在不同的環(huán)境刺激下可極化為 M1 和 M2 型巨噬細胞。在脂多糖(lipopolysaco haride，LPS)、TNF-α、干擾素 γ (interferon gamma，IFN-γ) 的刺激下，M0 巨噬細胞可極化為 M1 巨噬細胞，同時產(chǎn)生大量的活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 和炎癥因子 (如 IL-1β、TNF-α、IL-6)[14]。M2 型巨噬細胞可極化為 M2a、M2b、M2c、M2d 四種亞型，每種亞型發(fā)揮各自不同的作用。在 IL-4、IL-13 刺激下，巨噬細胞可極化為 M2a 型，并分泌精氨酸酶-1 (arginase-1，Arg-1) 和胰島素樣生長因子-1 (insulin-like growth factor 1，IGF-1) 以促進血管新生和膠原蛋白形成，從而參與細胞外基質(zhì)的合成，這表明，M2a 巨噬細胞在細胞外基質(zhì)的合成中是必不可少的[15]。M2b 巨噬細胞的極化可被免疫復合物和 LPS 誘導并表達白細胞分化抗原 86 (cluster of differentiation 86，CD86)、CD68 和主要組織相融復合體 Ⅱ (major histocompatibility complex class Ⅱ，MHCⅡ)CD86、CD68 和 MHCⅡ，其可分泌 IL-10 抑制炎癥反應，同時分泌大量的炎癥因子 (如 TNF-α、IL-1β)[16]。M2c 巨噬細胞的極化可被糖皮質(zhì)激素、IL-10 和 TGF-β 誘導，能夠分泌 IL-10 和基質(zhì)金屬蛋白酶，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)重塑和纖維化[17]。IL-6 和腺苷可誘導 M2d 巨噬細胞的極化，其分泌轉(zhuǎn)化生長因子 β (transforming growth factor-β，TGF-β)和血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 促進肉芽組織的形成[18]。以上研究結果表明，不能將巨噬細胞極化簡單地分為 M1 和 M2 型，不同巨噬細胞表型的極化以及在組織愈合中的作用仍需進一步研究。

2.M1 巨噬細胞極化對腱骨愈合的影響：在炎癥早期階段，外周血、骨髓和滑膜組織中的 M0 巨噬細胞被募集到腱骨界面，主要極化為 M1 型巨噬細胞[19]。研究發(fā)現(xiàn)，腱骨界面損傷后的第 3 天 M1 巨噬細胞標志物的表達達到峰值，隨后逐漸下降[20]。M1 巨噬細胞可以吞噬細胞碎片，清除外來病原體，并通過分泌炎癥因子 (IL-1β、TNF-α 和 IL-6) 及趨化因子 [趨化因子配體 2 (chemokine ligand 2，CCL2)、抗人白介素 8 (anti-human IL-8，CXCL8)、基質(zhì)細胞衍生因子-1 (stromal cell derived factor 1，SDF-1)、CCL2、CXCL8、SDF-1]影響腱骨愈合。

(1) IL-1β 對腱骨愈合的影響：IL-1β 是 M1 巨噬細胞分泌的一種炎癥因子，在正常腱骨界面低表達，但在腱骨界面損傷后的瘢痕組織及周圍關節(jié)液中過表達，表明IL-1β 與腱骨愈合不佳密切相關[21]。體外實驗研究表明，IL-1β 可顯著降低肌腱干細胞中 Ⅰ 型膠原 mRNA 的表達，并促進人肌腱細胞中環(huán)氧合酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶 1 (matrix metallopeptidase 1，MMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶 3 (matrix metallopeptidase 3，MMP3)、COX-2、MMP1、MMP3 及前列腺素 E2 的表達，從而參與腱骨界面細胞外基質(zhì)的降解[21]。此外，IL-1β 還可通過核因子 κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB) 信號通路影響腱骨愈合，具體機制為通過激活 IκB 激酶 (inhibitor of nuclear factor kappa-B，IKK) 復合體的磷酸化，從而降解 NF-κB 二聚體抑制劑 I-B，使 NF-κB 二聚體轉(zhuǎn)移到細胞核，增加促炎因子基因的表達[21]。在對過表達 IKK 小鼠腱骨界面的研究中發(fā)現(xiàn)，IKK 和 NF-κB 在肩袖撕裂患者肌腱組織和小鼠急性肩袖撕裂腱骨界面組織中過表達，腱骨界面 CD68+巨噬細胞大量浸潤和纖維軟骨明顯退變；與野生型或 IKK 過表達小鼠相比，敲除 IKK 基因的小鼠腱骨界面損傷后的愈合能力明顯增強，這表明激活 NF-κB 信號通路對腱骨愈合產(chǎn)生了有害影響，這可能與 M1 巨噬細胞浸潤及促炎細胞因子分泌增加有關[22]。進一步研究表明，當激活 NF-κB 信號通路時，腱骨界面轉(zhuǎn)錄因子 9 (tranion factor sox-9) 的表達減少，從而阻礙了間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstem cells，MSCs) 的成軟骨分化，這也表明腱骨愈合不良的關鍵可能在纖維軟骨層[23]。IL-1β 還能誘導腱骨界面破骨細胞的過度活化，導致腱骨愈合過程中骨質(zhì)丟失和再生不良[24]。綜上所述，IL-1β 通過激活 NF-κB信號通路，直接或間接的影響了腱骨愈合，NF-κB 信號通路是腱骨界面愈合不佳重要的信號通路。

(2) TNF-α 對腱骨愈合的影響：TNF-α 也是一種 M1 巨噬細胞在腱骨愈合過程中分泌的炎癥因子[25]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α 在撕裂肩袖肌腱組織中的表達明顯高于正常肩袖肌腱組織，其可引起肌腱干細胞凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶合成增加及 Ⅰ 型膠原合成減少，從而導致腱骨界面細胞外基質(zhì)降解[26]。TNF-α 亦可激活 NF-κB 信號通路分泌大量促炎因子，加劇腱骨愈合過程中的炎癥反應[27]。在 TNF-α 的誘導下，單核細胞可分化為破骨細胞，引起腱骨愈合過程中骨質(zhì)丟失[27]。研究表明，下調(diào) Lewis 大鼠腱骨愈合過程中TNF-α 的水平可減少 M1 巨噬細胞的數(shù)量，從而誘導纖維軟骨層的再生，最終提高腱骨愈合生物力學強度[28]。

(3) IL-6 對腱骨愈合的影響：IL-6 是 NF-κB 信號通路的下游產(chǎn)物，在肩袖撕裂的肌腱組織中大量表達，其在腱骨愈合中發(fā)揮雙重作用[29]。IL-6 具有抗炎和促炎的雙重特性，膜結合受體 IL-6R 介導其抗炎作用，可溶性的IL-6R 介導其促炎作用[30]。研究發(fā)現(xiàn)，雖然 IL-6 可以募集單核細胞并促進其分化為破骨細胞，但同時也可以增強IL-1 受體拮抗劑和 IL-10 的釋放，以抑制炎癥[29]。在 IL-6基因敲除小鼠髕腱損傷模型中，TNF-α 水平高于野生型小鼠，Ⅲ 型膠原與 Ⅰ 型膠原的比值也升高，表明 IL-6 參與了肌腱修復過程中的炎癥反應和細胞外基質(zhì)的重塑，與對照組相比，IL-6 基因敲除小鼠促炎因子 TNF-α 上調(diào)，機械性能降低[31]。以上結果表明 IL-6 在腱骨愈合中的作用是復雜的，IL-6 對腱骨愈合的影響有待進一步研究。

(4) 趨化因子對腱骨愈合的影響：M1 巨噬細胞不僅通過分泌炎癥因子調(diào)控腱骨愈合，還釋放趨化因子 (如CCL2、CXCL8、SDF-1) 將 MSCs 募集到損傷部位參與腱骨愈合[32]。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠肩袖腱骨愈合模型中，與對照組相比，鉆骨道修復組骨髓間充質(zhì)干細胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 可通過肱骨大結節(jié)上的骨隧道浸潤到腱骨界面，促進腱骨愈合[33]。Yang 等[34]通過紅外熒光成像跟蹤技術觀察外源性 MSCs 在小鼠腱骨愈合中的分布，建立腱骨愈合模型后，立即向肩關節(jié)腔內(nèi)注射外源性 MSCs，研究發(fā)現(xiàn)，于注射后第 3 天腱骨界面出現(xiàn)大量的 MSCs 并促進了腱骨愈合。這些研究均表明，無論是內(nèi)源性還是外源性 MSCs 均可以被募集到腱骨界面促進腱骨愈合，在此過程中，M1 巨噬細胞釋放的趨化因子在募集MSCs 到損傷部位參與腱骨愈合的過程中發(fā)揮重要作用。

總之，在腱骨愈合早期，大量 M1 巨噬細胞浸潤可以吞噬細胞碎片和外來病原體，同時通過分泌趨化因子將MSCs 招募到腱骨界面，可促進腱骨愈合，但一旦炎癥因子分泌過量，局部微環(huán)境的炎癥反應就會加劇，這對腱骨愈合是有害的。因此，如何精準調(diào)控巨噬細胞表型向有利腱骨愈合方法的極化是未來研究的方向和重點。

3.M2 巨噬細胞對腱骨愈合的影響：在肌腱骨愈合的炎癥期，巨噬細胞以 M1 型巨噬細胞為主，而在隨后的修復和重塑階段，以 CD206 和 Arg-1 為特征的 M2 型巨噬細胞占主導地位[35]。由于巨噬細胞的可塑性，組織愈合過程中 M2 巨噬細胞可能有兩方面的來源，一是 M1 巨噬細胞的復極化，二是 M0 巨噬細胞在 IL-4、IL-13 等刺激下誘導極化而來[35]。與 M1 巨噬細胞相比，M2 巨噬細胞吞噬病原體和產(chǎn)生促炎因子的能力有限，而其釋放 IL-4 和 IL-10 等抗炎因子的能力明顯增強，這些抗炎因子為腱骨愈合提供了合適的微環(huán)境[36]。體外研究表明，M2 巨噬細胞條件培養(yǎng)基可促進 MSCs 成骨分化，但加入 IL-10 中和抗體后，這種成骨作用減弱，這表明 IL-10 是 M2 巨噬細胞發(fā)揮腱骨愈合功能的重要因子[37]。M2 巨噬細胞被認為在炎癥后期逐漸取代 M1 巨噬細胞，通過分泌各種抗炎和生長因子來調(diào)節(jié)組織再生。雖然 M2 巨噬細胞通過抑制炎癥反應促進腱骨愈合的研究證據(jù)相當充分，但 M2 巨噬細胞分泌的生長因子在肌腱 -骨愈合中的作用仍不明確且存在爭議。

(1) TGF-β 對腱骨愈合的影響：TGF-β 是一組具有調(diào)節(jié)細胞生長和分化的 TGF-β 超家族。TGF-β 可通過誘導M2 型巨噬細胞分泌 TGF-β1、TGF-β3 等生長因子形成正反饋調(diào)控作用[38]。研究發(fā)現(xiàn)，在瘢痕形成和組織再生中，TGF-β 起著決定性作用[39]。在大鼠急性肩袖損傷后腱骨愈合過程中，TGF-β1 在第 10 天時達到峰值，且富含纖維瘢痕組織，其中主要成分為 Ⅲ 型膠原，表明 TGF-β1 參與損傷腱骨界面纖維瘢痕組織的形成[40]。在大鼠急性肩袖損傷模型中，加入外源性 TGF-β1 可促進腱骨愈合，提高生物力學強度，但同時亦增強了 Ⅲ 型膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，促進纖維瘢痕組織的形成[41]。相反，在腱骨愈合過程中，具有促進纖維軟骨形成的 TGF-β3 卻低表達[42]。研究發(fā)現(xiàn)，在腱骨界面加入 TGF-β3 可促進腱骨界面纖維軟骨的再生，從而提高了愈合后的生物力學強度，且瘢痕形成較少。以上結果表明，TGF-β 對腱骨愈合具體重要的作用，通過調(diào)節(jié)巨噬細胞向 M2 型極化，促進 TGF-β3 的生成可能成為促進腱骨愈合的有效策略。

(2) VEGF 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (bone morphogenetic protein type 2，BMP-2) 對腱骨愈合的影響：巨噬細胞釋放的生長因子 VEGF、BMP-2 也在組織再生中發(fā)揮重要作用[43]。在小鼠模型中，硫酸殼聚糖可誘導 M2 巨噬細胞極化，從而促進內(nèi)源性血管內(nèi)皮生長因子 VEGF 的表達，從而促進缺血性疾病的血管新生[44]。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs 來源的外泌體可誘導 M2 巨噬細胞極化，增加 VEGF 的表達，促進大鼠損傷腱骨界面周圍血管新生，有利于腱骨愈合[45]。此外，通過改變蜂窩狀二氧化鈦的表面形貌來調(diào)控 M2 巨噬細胞的極化可以促進巨噬細胞釋放更多的BMP-2，以促進小鼠脛骨植骨模型中的成骨[46]。以上結果表明，M2 型巨噬細胞分泌釋放 VEGF 和 BMP-2 分別促進血管新生和成骨來提高腱骨愈合質(zhì)量，其具體機制仍需進一步探索。

三、總結與展望

腱骨界面結構特殊，損傷后腱骨愈合過程復雜，常規(guī)手術修復后再撕裂率高。巨噬細胞是促進腱骨愈合的重要靶點，貫穿于腱骨愈合的整個過程，在骨腱界面修復過程中，如何精準調(diào)控巨噬細胞在時空順序向不同表型極化對骨腱界面的愈合至關重要。如何定向誘導巨噬細胞分泌細胞因子充分發(fā)揮促進腱骨愈合的作用是發(fā)揮臨床療效的關鍵環(huán)節(jié)。未來的研究應進一步探索巨噬細胞調(diào)控腱骨愈合的機制，利用組織工程技術精確調(diào)控巨噬細胞表型，促進腱骨界面愈合。