miR-186-5p調控PRKAA2促進肺腺癌細胞鐵死亡的機制研究

劉璐 管欣 趙燕喬 王曉娜 尹崇高 劉清華 李洪利

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因[1]，肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是最常見的肺癌組織學類型[2]，肺癌患者的平均5年生存率仍然很低，致癌基因的有效監(jiān)視被視為癌癥治療的靶點，分子病理學診斷和靶向治療應用能顯著提高患者總生存期[3]。目前分子靶向治療在臨床應用中顯示出不錯的治療效果[4]，但是由于耐藥性的發(fā)展，患者的治療仍具有挑戰(zhàn)性。因此，進一步了解肺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，尋找更有效的分子靶向治療和預后預測指標對提高LUAD患者的生存率和生活質量至關重

要[5]。

鐵死亡（ferroptosis）是一種新的細胞死亡形式，其特征是大量鐵積累和脂質過氧化，在腫瘤微環(huán)境中起著關鍵作用[6]。鐵穩(wěn)態(tài)影響細胞特征的發(fā)展，細胞鐵含量可以影響腫瘤狀況，腫瘤細胞的生長和增殖需要大量的鐵，但過量的鐵水平會導致腫瘤細胞死亡[7]。先前研究證實，LUAD中重要的鐵死亡調節(jié)因子RRM2通過抑制鐵毒死亡促進腫瘤免疫浸潤[8]；KLF11通過抑制GPX4調控LUAD鐵下垂和化療敏感性[9]，因此解決抑制鐵死亡的分子機制、誘導鐵死亡發(fā)生對于治療肺癌具有深遠臨床意義。

微小RNA（microRNAs, miRNAs）是一種高度保守的非編碼RNA（non-coding RNAs, ncRNAs）[10]，主要通過3' UTR中的識別位點進行翻譯抑制或降解信使RNA（messenger RNA, mRNA）來調節(jié)基因的穩(wěn)定性表達[11]。有課題組研究[12]表明，lncRNA-AC009948.5通過結合miR-186-5p促進LUAD的侵襲轉移，miR-186-5p降低A549細胞的遷移和侵襲能力，miR-186-5p可能成為LUAD診斷和預后的生物標志物，但關于miR-186-5p是否通過鐵死亡方式影響LUAD增殖、侵襲與遷移還尚未見研究與報道。本文通過細胞功能實驗驗證miR-186-5p是否通過調控其下游靶蛋白PRKAA2影響A549鐵死亡途徑從而抑制LUAD細胞增殖、遷移和侵襲能力。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器 細胞株：LUAD A549、H1299細胞株以及293T細胞株購自ATCC（American Type Culture Collection）。miR-186-5p過表達及對照質粒、PRKAA2敲除及對照質粒均由上海吉凱基因股份有限公司構建合成。鐵死亡抑制劑Fer-1購自山東增峰生物科技有限公司。EdU和JC-1試劑盒購自碧云天生物技術有限公司?；钚匝酰╮eactive oxygen species, ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）試劑盒購自Boxbio生工科技有限公司。絲裂霉素C購自Sigma Aldrich公司。

1.2 細胞轉染與分組 將細胞分組：（1）con組：A549、H1299細胞轉染對照質粒；（2）con+Fer-1組：轉染對照質粒后加入10 μmol/L鐵死亡抑制劑Fer-1；（3）overmiR-186-5p+Fer-1組：轉染過表達miR-186-5p質粒后加入10 μmol/L鐵死亡抑制劑Fer-1；（4）over-miR-186-5p+sh-PR K A A2+Fer-1組：共轉染過表達miR-186-5p和敲低PRKAA2質粒后加入10 μmol/L鐵死亡抑制劑Fer-1。

1.3 在線網(wǎng)站預測和篩選靶基因 通過miRWalk數(shù)據(jù)庫、DIANA數(shù)據(jù)庫（https://diana.e-ce.uth.gr/tools）、miRDB數(shù)據(jù)庫（http://mirdb.org/）以及FerrDb數(shù)據(jù)庫（http://www.zhounan.org/ferrdb/current/）預測可能與miR-186-5p結合的靶基因。通過韋恩圖將以上網(wǎng)站所預測到的靶蛋白取交集。通過GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫最終篩選出表達以及生存預后符合條件的靶蛋白。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測 構建pGL3-PRKAA2-3’-UTR-WT（UGAAAAUCAGUUAUAUUCUUUA）和pGL3-PRKAA2-3’-UTRMUT（UGAAAAUCAGUUAUCGCGAUCA），將miR-186-5p過表達（CTCGAGTGCTTGTAACTTTCCAAAGAATTCTCCTTTTG GGCTTTCTGGTTTTATTTTAAGCCCAAAGGTGAATTTTT TGGGAAGTTTGAGCTTTCGAA）及對照質粒和PRKAA2的野生型質粒、突變型質粒用Lipofectamine 2000共轉染入293T細胞，48 h后測定熒光素酶活性。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測PRKAA2基因表達水平 細胞轉染24 h后，提取細胞總RNA，逆轉錄為互補DNA（complementary DNA, cDNA），qRT-PCR檢測PRKAA2在細胞中的表達量。

1.6 Western blot實驗檢測PRKAA2蛋白表達水平 細胞轉染后提取總蛋白，煮蛋白，電泳，轉膜，封閉，一抗4oC過夜，洗膜，二抗孵育，洗膜，曝光。實驗重復3次。

1.7 EdU細胞增殖實驗 各分組細胞轉染24 h后，加入EdU工作液，37oC孵育2 h，甲醇固定30 min，Triton透膜40 min，Click反應液孵育40 min，DAPI染核。

1.8 Transwell侵襲實驗 取培養(yǎng)24 h的各組轉染細胞，無血清培養(yǎng)基重懸。取稀釋后的Matrigel膠涂抹于上室。上室滴加200 μL（4×104個）細胞懸液，下室滴加含10% FBS的正常培養(yǎng)液。24 h后甲醇固定，PBS洗滌，姬姆薩染色，雙蒸水沖洗晾干，拍照并計數(shù)。實驗獨立重復3次。

1.9 劃痕愈合實驗 取移液器200 μL吸頭做平行劃痕，PBS洗滌，更換為含1%胎牛血清的培養(yǎng)基。獨立實驗重復3次。

1.10 MDA和還原型GSH含量檢測 各組轉染細胞數(shù)量1×104個，離心收集細胞，冰浴超聲破碎，4oC 8000g離心10 min。取上清加入MDA檢測試劑后沸水浴處理60 min，測定450、532和600 nm三處的吸光值進行MDA含量計算；另取上清加入GSH檢測試劑后室溫充分顯色，酶標儀測定412 nm處吸光值進行GSH含量計算。

1.11 ROS和脂質活性氧（lipid ROS, L-ROS）含量檢測 各組轉染過的細胞以2×105數(shù)量鋪于共聚焦小皿中，加入無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA熒光探針的工作液（1:1000，終濃度10 μmol/L），避光孵育20 min；無血清培養(yǎng)基洗滌后換為正常培養(yǎng)液，觀察并拍照。L-ROS：甲醇固定20 min，PBS洗滌，加入1 mL用無血清培養(yǎng)液稀釋C11-BODIPY探針的工作液，孵育30 min，PBS洗滌，換為正常培養(yǎng)液。觀察并拍照，實驗重復3次。

1.12 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計學分析處理，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，兩組樣本比較采用t檢驗，多組樣本比較采用單因素方差分析，P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PRKAA2與miR-186-5p靶向結合且在LUAD中高表達通過生信網(wǎng)站miRDB、DIANA、miRWalk、FerrDb預測可與miR-186-5p結合的鐵死亡相關靶基因，4組數(shù)據(jù)取交集得到2個靶基因：PIK3CA、PRKAA2（圖1A）。通過GEPIA和Ualcan數(shù)據(jù)庫對預測到的靶蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，PRKAA2在LUAD組織中高表達（圖1B，P＜0.05），PRKAA2低表達的LUAD患者預后生存率高于高表達患者（圖1C，P＜0.05）。因此，我們選取PRKAA2為研究對象做后續(xù)研究。雙熒光素酶實驗驗證miR-186-5p與PRKAA2兩者間靶向結合關系，結果顯示，PRKAA2 mRNA的3’-UTR區(qū)是miR-186-5p的直接結合位點（圖1D，P＜0.05）。綜上所述，PRKAA2在LUAD中高表達，miR-186-5p與PRKAA2存在結合位點且miR-186-5p負向調控PRKAA2蛋白表達。

圖1 miR-186-5p與PRKAA2靶向結合。A：韋恩圖顯示4個生信網(wǎng)站取交集獲得2個共同鐵死亡蛋白；B：Ualcan查詢PRKAA2在正常組織和肺腺癌組織中的表達情況；C：GEPIA查詢PRKAA2的生存曲線分析；D：熒光素酶實驗檢測不同組細胞的熒光素酶活性。*P＜0.05。Fig 1 Targeted binding of miR-186-5p with PRKAA2. A: Venn diagram shows that two common ferroptosis proteins are obtained by intersection of four websites; B: UALCAN query the expression of PRKAA2 in normal tissues and lung adenocarcinoma tissues; C: GEPIA inquires about the survival curve analysis of PRKAA2; D: Luciferase activity of different groups of cells was detected by luciferase experiment. *P＜0.05. LUAD: lung adenocarcinoma; WT: wild-type; MUT: mutant-type; con: control.

2.2 miR-186-5p負向調控PRKAA2發(fā)揮作用 通過qRT-PCR檢測PRKAA2的基因表達水平。結果顯示與對照組相比，過表達miR-186-5p后PRKAA2表達量顯著下降（圖2A）；通過Western印跡檢測過表達miR-186-5p后PRKAA2蛋白的表達情況。結果顯示，over-miR-186-5p組PRKAA2的表達明顯低于con組（圖2B，P＜0.05）。綜上所述，miR-186-5p負向調控PRKAA2從而發(fā)揮作用。

圖2 miR-186-5p負向調控PRKAA2。A：qRT-PCR檢測過表達miR-186-5p后PRKAA2的基因表達水平；B：Western blot檢測過表達miR-186-5p后PRKAA2的蛋白表達水平。*P＜0.05。Fig 2 miR-186-5p negatively regulates PRKAA2. A: The gene expression level of PRKAA2 was detected by qRT-PCR after miR-186-5p was overexpressed; B: The protein expression level of PRKAA2 was detected by Western blot after miR-186-5p was expressed. *P＜0.05. qRT-PCR:quantitative real-time polymerase chain reaction.

2.3 miR-186-5p通過鐵死亡方式抑制LUAD細胞增殖能力 EdU增殖實驗結果顯示，在相同濃度（10 μmol/L）抑制劑Fer-1處理下，con+Fer-1組陽性增殖細胞數(shù)明顯多于con組；相較于con+Fer-1組，over-miR-186-5p+Fer-1組A549和H1299陽性細胞數(shù)相對減少；over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組陽性增殖細胞數(shù)比over-miR-186-5p+Fer-1組更少（圖3A、3B），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 miR-186-5p調控PRKAA2通過鐵死亡方式抑制肺腺癌細胞增殖能力。A：EdU實驗檢測在加入Fer-1條件下，轉染miR-186-5p和PRKAA2對A549細胞增殖能力的結果圖及定量分析；B：相同條件下對H1299細胞侵襲能力的結果圖及定量分析。*P＜0.05。Fig 3 The ability of miR-186-5p to inhibit the proliferation of lung adenocarcinoma cell by ferroptosis. A: EdU experiment was used to detect the proliferation ability of tranfected miR-186-5p and PRKAA2 to A549 cells under the condition of adding Fer-1; B: Results and quantitative analysis of invasion ability of H1299 cells under the same conditions. *P＜0.05.

2.4 miR-186-5p通過鐵死亡方式抑制LUAD細胞侵襲遷移能力 Transwell侵襲實驗結果顯示（圖4），在相同濃度（10 μmol/L）抑制劑Fer-1處理下，con+Fer-1組穿過基質膠的細胞數(shù)明顯多于con組，相較于con+Fer-1組，over-miR-186-5p+Fer-1組穿過基底膜的A549和H1299細胞數(shù)相對減少；over-miR-186-5p+Fer-1組穿過基底膜的細胞數(shù)多于overmiR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組。劃痕愈合實驗結果顯示，每組在加入絲裂霉素C排除細胞增殖對劃痕遷移能力的影響后，在相同濃度（10 μmol/L）抑制劑Fer-1處理下，相較于con組，con+Fer-1組劃痕寬度更窄；over-miR-186-5p+Fer-1組細胞遷移率小于con+Fer-1組；相較于over-miR-186-5p+Fer-1組，over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組劃痕寬度更加顯著（圖5A、5B），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖4 miR-186-5p調控PRKAA2通過鐵死亡方式抑制肺腺癌細胞侵襲能力。A：Transwell實驗檢測在加入Fer-1條件下，轉染miR-186-5p和PRKAA2對A549細胞侵襲能力的結果圖及定量分析；B：相同條件下對H1299細胞侵襲能力的結果圖及定量分析。*P＜0.05。Fig 4 The ability of miR-186-5p to inhibit the invasion of lung adenocarcinoma cell by ferroptosis. A: Transwell experiment was used to detect the invasion ability of transfected miR-186-5p and PRKAA2 to A549 cells under the condition of adding Fer-1; B: Results and quantitative analysis of invasion ability of H1299 cells under the same conditions. *P＜0.05.

圖5 miR-186-5p調控PRKAA2通過鐵死亡方式抑制肺腺癌細胞遷移能力。A：劃痕實驗檢測在加入Fer-1條件下，轉染miR-186-5p和PRKAA2對A549細胞遷移能力的結果圖及定量分析；B：相同條件下對H1299細胞侵襲能力的結果圖及定量分析。*P＜0.05。Fig 5 The ability of miR-186-5p to inhibit the migration of lung adenocarcinoma cell by ferroptosis. A: Scratch test results and quantitative analysis of the migration ability of transfected miR-186-5p and PRKAA2 to A549 cells under the condition of adding Fer-1; B: Results and quantitative analysis of invasion ability of H1299 cells under the same conditions. *P＜0.05.

2.5 miR-186-5p逆轉Fer-1減少LUAD細胞ROS含量的影響ROS實驗結果顯示，在相同濃度（10 μmol/L）抑制劑Fer-1處理下，con+Fer-1組細胞熒光強度明顯低于con組；相較于con+Fer-1組，over-miR-186-5p+Fer-1組A549和H1299細胞熒光強度相對增強；over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組熒光強度強于over-miR-186-5p+Fer-1組，過表達miR-186-5p和敲低PRKAA2引起大量ROS的生成（圖6），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖6 ROS實驗檢測各組細胞內ROS含量變化。敲低PRKAA2協(xié)同miR-186-5p共同升高細胞內ROS含量。Fig 6 ROS experiment was used to detect the changes of ROS content in cells of each group. Knockdown of PRKAA2 and miR-186-5p increase the content of intracellular ROS. ROS: reactive oxygen species.

2.6 miR-186-5p調控PRKAA2通過調節(jié)MDA與GSH含量促進鐵死亡敏感性 MDA實驗顯示，與con組相比，con+Fer-1組細胞MDA含量降低；相較于con+Fer-1組，over-miR-186-5p+Fer-1組A549和H1299細胞MDA含量升高；over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組細胞MDA含量顯著高于overmiR-186-5p+Fer-1組。GSH實驗結果顯示，與con組相比，con+Fer-1組還原型GSH含量升高；相較于con+Fer-1組，over-miR-186-5p+Fer-1組A549和H1299細胞還原型GSH含量降低；over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組細胞還原型GSH含量顯著低于over-miR-186-5p+Fer-1組（圖7）。因此，過表達miR-186-5p逆轉了Fer-1對LUAD細胞鐵死亡指標的影響，過表達miR-186-5p和敲除PRKAA2可明顯上調A549和H1299細胞中MDA水平，下調GSH含量，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖7 miR-186-5p和PRKAA2對A549（A）、H1299（B）細胞MDA和GSH水平的影響。*P＜0.05。Fig 7 Effect of miR-186-5p and PRKAA2 on MDA and GSH levels of A549 (A) and H1299 (B) cells. *P＜0.05. MDA: malondialdehyde; GSH: glutathione.

2.7 miR-186-5p調控PRKAA2通過增加L-ROS促進鐵死亡敏感性 采用C11 BODIPY 581/591檢測A549脂質過氧化情況，未氧化的C11 BODIPY 581/591呈現(xiàn)紅色熒光信號，氧化的呈綠色熒光信號。L-ROS實驗結果顯示，相較于con組，con+Fer-1組A549和H1299細胞L-ROS紅色熒光信號強度升高，over-miR-186-5p+Fer-1組A549細胞紅色熒光強度減弱；相較于over-miR-186-5p+Fer-1組，over-miR-186-5p+sh-PRKAA2+Fer-1組細胞綠色熒光信號顯著增強，紅色熒光明顯減弱（圖8），miR-186-5p通過靶向調控PRKAA2增強L-ROS水平，打破細胞內氧化還原平衡，誘導A549和H1299細胞L-ROS生成，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖8 miR-186-5p靶向PRKAA2破壞A549、H1299細胞中的鐵穩(wěn)態(tài)。L-ROS實驗檢測在加入Fer-1條件下，過表達miR-186-5p和敲低PRKAA2后細胞內L-ROS含量變化。Fig 8 miR-186-5p targeted PRKAA2 to destroy iron homeostasis in A549 and H1299 cells. L-ROS experiment was used to detect the changes of L-ROS content in cells after overexpression of miR-186-5p and knockdown of PRKAA2 under the condition of adding Fer-1. L-ROS: lipid reactive oxygen species.

3 討論

LUAD常見于肺外周組織，約占非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）的70%和肺腫瘤的40%。針對性地靶向打擊癌細胞是癌癥治療的主要挑戰(zhàn)，癌癥的發(fā)生和維持均有癌基因的調控，因此抑制腫瘤生長的策略之一是靶向致癌途徑[13]。隨著精準醫(yī)療的快速發(fā)展，人們提出了新的治療策略，以改善LUAD患者的預后[14]。確定肺癌發(fā)生發(fā)展機制是開發(fā)有效的生物標志物，以更好地診斷和設計治療干預措施的必要條件[15]。

miR-186-5p參與多種形式的細胞死亡過程，如凋亡、焦亡和自噬。本研究發(fā)現(xiàn)miR-186-5p通過結合PRKAA2抑制Fer-1促進A549、H1299細胞鐵死亡，這些研究表明miR-186-5p是介導細胞凋亡、焦亡、自噬和鐵死亡交叉調控的重要miRNA，進一步探討miR-186-5p在細胞凋亡、自噬和鐵死亡之間相互作用中的關鍵作用具有深遠的臨床意義。鐵對于快速增殖的癌細胞至關重要，已經(jīng)有人嘗試通過鐵代謝來抑制腫瘤生長[16]。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）賦予極化上皮細胞更強的侵襲性，被認為是腫瘤轉移的關鍵步驟[17]。鐵下垂和EMT是腫瘤發(fā)生的主要生物學過程，它們之間存在著復雜的關系，并通過多種信號通路介導。EMT過程通過不同的機制在多種癌細胞中產(chǎn)生對細胞死亡的抗性。對治療有抵抗力或接受EMT的癌細胞可能更容易誘導鐵下垂，具有間充質性質的癌細胞通常比具有上皮性質的癌細胞對鐵下垂更敏感，這意味著EMT在一定程度上與鐵下垂有關[18]。

miR-186-5p已被證實與癌癥密切相關，我們課題組前期實驗研究[19]表明，miR-186-5p通過靶向調控PTTG1抑制LUAD細胞的EMT，然而有關miR-186-5p如何通過鐵死亡機制影響其在LUAD增殖遷移和侵襲中發(fā)揮作用尚未見研究報道，因此，本文通過實驗驗證敲低PRKAA2能協(xié)同miR-186-5p增強LUAD細胞對Fer-1誘導的鐵死亡敏感性，逆轉Fer-1抑制LUAD細胞鐵死亡的趨勢，從而抑制LUAD細胞增殖、侵襲、遷移能力，進一步加強證實miR-186-5p在LUAD細胞中所發(fā)揮的抑癌作用。

AMPK（5′AMP活化蛋白激酶）作為細胞能量傳感器，是多種癌癥的關鍵調節(jié)因子[20]。PRKAA2是AMPK的α2亞基，在葡萄糖代謝中起重要作用[21]。我們的研究表明，PRKAA2是miR-186-5p的直接靶點，敲除PRKAA2促進A549細胞鐵死亡，miR-186-5p通過負向調控PRKAA2促進LUAD細胞鐵死亡，從而抑制LUAD細胞增殖、侵襲和遷移能力。通過本研究，我們探討了miR-186-5p促進LUAD細胞鐵死亡的分子機制，但關于miR-186-5p通過何種信號轉導通路靶向PRKAA2介導LUAD進程的機制尚不清楚，這也將成為我們接下來探索與研究的重點。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Liu L conceived and designed the study. Zhao YQ and Wang XN performed the experiments. Guan X analyzed the data. Liu QH contributed analysis tools. Yin CG and Li HL provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.