微生物發(fā)酵法制備乳源生物活性肽研究進(jìn)展

李思怡，姜雨彤，妥彥峰，吳曉萌，牟光慶，姜淑娟

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

生物活性肽是由短氨基酸序列組成的特異性蛋白質(zhì)片段[1]，存在于各種富含蛋白質(zhì)的食物中，具有廣泛的生物功能[2-4]，包括抗菌[5]、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）[6]、抗氧化[7]、抗癌[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]和抗炎[10]等，由于它們具有特異性高、毒性低、結(jié)構(gòu)多樣性高和分子質(zhì)量低等特點(diǎn)[11]，被認(rèn)為是應(yīng)用于保健品或功能性食品的理想物質(zhì)[12]。肽大多嵌在其親代蛋白中，必須在食品加工、微生物發(fā)酵或胃腸道消化過程中被切割[13-16]，通過腸道上皮細(xì)胞運(yùn)輸進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)和靶器官[17]，被吸收后可以激活不同的代謝和感覺信號(hào)通路[18]，調(diào)節(jié)不同的身體功能[19]。乳源生物活性肽具有活性強(qiáng)、易制備、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，并且作為乳品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[20-22]，在發(fā)酵乳制品中的生理功能也在不斷被發(fā)現(xiàn)[23-24]。

生物活性肽在食品蛋白中的釋放主要是通過酶解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)法[25]，這些方法主要是通過酶、微生物和化學(xué)試劑等作用來分解蛋白質(zhì)，進(jìn)而釋放功能肽[18]。盡管有多種方法可用于獲得生物活性肽，但由于不同的制備方法在獲得的肽的產(chǎn)率、呈現(xiàn)出的生物活性以及使用的工藝、消耗的成本等方面都存在一些差異，因此，了解并選擇合適的方法來進(jìn)行生物活性肽的制備是至關(guān)重要的[18]。本文綜述了近年來通過微生物發(fā)酵法制備乳源生物活性肽的研究進(jìn)展，并對(duì)乳蛋白發(fā)酵降解產(chǎn)生的活性肽的生理功能進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為發(fā)酵法制備乳源生物活性肽的研究提供參考。

1 微生物發(fā)酵法制備乳源生物活性肽概述

近年來帶有生物活性標(biāo)簽的發(fā)酵食品越來越受到消費(fèi)者的青睞[26-27]。釋放以非活性形式存在于乳蛋白中的生物活性肽主要通過以下3 種方式：1）利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等消化酶酶解；2）用蛋白水解起始培養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵；3）由源自蛋白水解微生物的酶進(jìn)行蛋白水解[28]。微生物發(fā)酵法是利用微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的復(fù)合酶系將大分子蛋白分解為小分子蛋白，在微生物的作用下肽基團(tuán)發(fā)生修飾和重組進(jìn)而獲得生物活性肽的一種生物技術(shù)[29-30]。在這種肽的制備方法中，通常使用的微生物是具有高蛋白酶活性和多種肽酶的乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌[30]，它們可以存在于基質(zhì)中或作為添加的起始培養(yǎng)物[18]。然而，由于每種微生物蛋白水解系統(tǒng)的獨(dú)特性，它們發(fā)酵的最終結(jié)果也是不同的[18]。

2 乳酸菌發(fā)酵法制備乳源生物活性肽

乳酸菌因其具有高效的蛋白水解系統(tǒng)以及對(duì)不同環(huán)境和底物的高度適應(yīng)性，被認(rèn)為是獲得生物活性肽最有價(jià)值的微生物之一[18]。乳酸菌（例如乳酸乳球菌、瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌和保加利亞乳桿菌）的蛋白水解系統(tǒng)由細(xì)胞壁蛋白酶和許多不同的細(xì)胞內(nèi)肽酶組成，包括內(nèi)肽酶、氨基肽酶、二肽酶和三肽酶，通過該系統(tǒng)水解產(chǎn)生的肽表現(xiàn)出抗菌、抗炎、ACE抑制、免疫調(diào)節(jié)等各種生物活性[31]。目前，國(guó)內(nèi)通過益生菌發(fā)酵產(chǎn)生生物活性肽方面的研究起步較晚，因此通過乳酸菌發(fā)酵法制備乳源生物活性肽是很有意義的探索[32]。

2.1 乳酸菌發(fā)酵法制備牛乳源活性肽

干酪乳桿菌作為一種很有前景的功能性菌株，能夠提升乳制品對(duì)人的健康益處，Solieri等[33]使用從帕瑪森奶酪中篩選得到的具有益生菌特性的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）PRA205發(fā)酵牛乳，與使用鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）PRA331發(fā)酵的牛乳相比，干酪乳桿菌發(fā)酵牛乳顯示出更高的自由基清除活性（（184.83±40.28）mmol/L，Trolox當(dāng)量）和更強(qiáng)的ACE抑制活性（半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）＝54.57 mg/mL），這種差異可能是由于干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌具有不同特異性的細(xì)胞膜蛋白酶或肽酶，導(dǎo)致其分解乳蛋白后產(chǎn)生不同類型、質(zhì)量或濃度的肽。乳酸乳球菌可以取代商業(yè)發(fā)酵劑用于生產(chǎn)發(fā)酵乳制品，是最重要的乳酸菌之一[34]。Rodriguez-Figueroa等[35]通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了乳酸乳球菌發(fā)酵乳對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的降血壓和降血脂作用，結(jié)果表明，連續(xù)食用由乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NRRL B-50571和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NRRL B-50572發(fā)酵的牛乳可以降低自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓和舒張壓，飲用乳酸菌發(fā)酵牛乳3 周后，自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓和舒張壓分別降低了23.3 mmHg和49.8 mmHg，同時(shí)乳酸菌發(fā)酵乳也可以降低自發(fā)性高血壓大鼠血漿低密度脂蛋白、膽固醇和甘油三酯的含量，這些結(jié)果表明，由乳酸菌發(fā)酵的牛乳可能是降低高血壓和高脂血癥的輔助劑，也可以用作功能性食品改善心血管健康。Rendón-Rosales等[36]發(fā)現(xiàn)從乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NRRL B-50571和NRRL B-50572發(fā)酵的牛乳中鑒定得到的生物活性肽在經(jīng)胃腸道消化后，對(duì)ACE、血栓形成（主要抑制凝血酶）和2型糖尿病（主要抑制二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV））的抑制活性顯著增加，其中ACE抑制活性增加了30%以上，凝血酶抑制活性顯著增加了10 倍，這可能是由于在體外模擬消化過程中釋放了有助于提高肽生物活性的氨基酸序列如脯氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，這也證明了在發(fā)酵過程中釋放的肽序列可以作為具有多功能生物活性片段的前體，在胃腸道消化后具有抑制ACE、凝血酶和DPP-IV的活性，有助于高血壓、糖尿病和血栓的治療。因此，以乳酸菌發(fā)酵的牛乳可作為維護(hù)心血管健康的潛在功能食品。

2.2 乳酸菌發(fā)酵法制備羊乳源活性肽

羊乳有多種健康益處，在消化性、酸堿性和緩沖能力方面與牛乳不同，同時(shí)羊乳也因其對(duì)過敏人群的治療作用而倍受歡迎[37]。但我國(guó)目前對(duì)于羊乳資源的開發(fā)利用主要停留在乳粉和液態(tài)乳開發(fā)層面，對(duì)于功能性羊乳制品的開發(fā)較少，所以羊乳資源亟待深度開發(fā)利用[38]。

曹吉利等[39]以2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率作為檢測(cè)指標(biāo)篩選能夠在發(fā)酵羊乳后高產(chǎn)抗氧化肽的乳桿菌菌株，結(jié)果表明，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）L60發(fā)酵后的羊乳DPPH自由基清除率達(dá)到了69.14%，具有較高的產(chǎn)抗氧化肽能力。Chen Li等[27]利用從開菲爾（Kefir）中分離得到的野生型植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）L60發(fā)酵羊乳12 h后，發(fā)酵乳的DPPH自由基清除活性達(dá)到了70.81%；并采用超濾和反相高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵后的羊乳進(jìn)行分離，鑒定出了3 種肽序列（VGINYWLAHK、TPEVDKEALEK和DLLER），這些肽具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性和經(jīng)胃腸消化后良好的穩(wěn)定性。同時(shí)，植物乳桿菌也是具有抗高血壓活性的潛在菌株，Chen Li等[26]從內(nèi)蒙古發(fā)酵牛乳中分離得到了具有高ACE抑制活性的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）69，使用植物乳桿菌69發(fā)酵的羊乳ACE抑制活性達(dá)到88.91%，顯示出了較高的抗高血壓能力。除了植物乳桿菌外，經(jīng)發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）KGL4發(fā)酵后的羊乳抗氧化和抗菌活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，同時(shí)發(fā)酵羊乳顯著降低了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的RAW 264.7細(xì)胞中過多的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）和白細(xì)胞介素1β（interleukin 1 beta，IL-1β）的產(chǎn)生，顯示出明顯的抗炎活性[40]。并且使用具有良好蛋白水解活性的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）NK9和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）LF發(fā)酵的羊乳也表現(xiàn)出一定的ACE抑制活性，利用這兩種潛在的乳桿菌培養(yǎng)物發(fā)酵羊乳可能成為ACE抑制肽的新來源[37]。這些結(jié)果均表明發(fā)酵后的羊乳具有良好的保健作用，這也將有利于今后的工業(yè)應(yīng)用和功能食品的開發(fā)。

2.3 乳酸菌發(fā)酵法制備駱駝乳源活性肽

駱駝乳在營(yíng)養(yǎng)成分方面更接近人乳，蛋白質(zhì)構(gòu)成比例合理，具有多種生物活性物質(zhì)[22]，不含有致敏性的β-乳球蛋白，可作為牛乳過敏人群的替代乳；因此，提高駱駝乳的利用率和利用駱駝乳生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品非常有發(fā)展前景[41]。此外，研究表明駱駝乳肽也可作為開發(fā)保健功能食品和生產(chǎn)具有特定生物活性產(chǎn)品的重要補(bǔ)充劑[42]。

駱駝乳蛋白質(zhì)中酪蛋白占總蛋白質(zhì)含量的61.8%～88.5%，其中β-酪蛋白含量遠(yuǎn)高于牛乳，同時(shí)酪蛋白也是駱駝乳中生產(chǎn)生物活性肽的主要來源[22]。與發(fā)酵牛乳相比，發(fā)酵駱駝乳對(duì)健康的促進(jìn)作用更高，特別是抗氧化、ACE抑制活性[43]。駝乳抗氧化肽的制備主要采用酶解的方式，但近年來一些研究則利用發(fā)酵菌株以提高其蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性，其中乳酸菌發(fā)酵對(duì)駱駝乳的抗氧化活性和ACE抑制活性有很大影響。Soleymanzadeh等[42]研究發(fā)現(xiàn)乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）PTCC1899在發(fā)酵過程中能夠從駝乳酪蛋白結(jié)構(gòu)中釋放具有抗氧化和ACE抑制活性的肽（MVPYPQR），該活性肽可作為保健品和功能食品的原料；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）KGL3A發(fā)酵48 h后的駱駝乳的2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）陽離子自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除活性分別為61.52%、52.26%和62.19%，研究結(jié)果表明，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）KGL3A菌株發(fā)酵駝乳的各項(xiàng)抗氧化活性（ABTS陽離子自由基清除活性、羥自由基清除活性和超氧陽離子自由基清除活性）隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)顯著提高，表明發(fā)酵駱駝乳是具有抗氧化活性生物肽的有效來源，同時(shí)發(fā)酵駝乳顯著抑制了LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中促炎介質(zhì)和一氧化氮的產(chǎn)生，這一結(jié)果也證實(shí)了發(fā)酵駱駝乳的抗炎作用[44]。

目前，對(duì)乳源抗菌肽的研究主要集中于牛乳和羊乳，有關(guān)駝乳抗菌肽的研究較少。駝乳含有重要的抗菌成分，如免疫球蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶等保護(hù)性蛋白，近年來學(xué)者們又對(duì)這些蛋白進(jìn)行水解，研究了水解后抗菌活性的變化。Algboory等[45]的研究表明用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）IS10發(fā)酵駱駝乳24 h后得到了7 種新型多肽，這些肽對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌亞種顯示出較強(qiáng)的抗菌活性。此外，Alhaj等[46]的研究也表明，與原料乳相比，接種瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）發(fā)酵的駱駝乳對(duì)蠟樣芽孢桿菌、鼠傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抗菌活性。駱駝乳發(fā)酵后抗菌活性增強(qiáng)可能是肽更容易穿透微生物細(xì)胞的脂膜，進(jìn)而促進(jìn)離子和代謝物的泄漏，破壞細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[41]。這些結(jié)果突出了非傳統(tǒng)發(fā)酵劑在乳品工業(yè)中的利用潛力，將它們與乳制品結(jié)合可以提高乳制品的健康益處和生物活性。

表1總結(jié)了近5 年乳酸菌發(fā)酵乳制品的生物活性肽產(chǎn)生情況。

3 芽孢桿菌發(fā)酵法制備乳源生物活性肽

芽孢桿菌由于其發(fā)酵周期短、生長(zhǎng)速率高和高產(chǎn)蛋白酶的特性[60]，被認(rèn)為是工業(yè)發(fā)酵中生產(chǎn)用于食品商業(yè)蛋白酶的主要細(xì)菌[61-62]。其中枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等的“GRAS”（generally regarded as safe）特性[62]，使其在工業(yè)生產(chǎn)中更具吸引力[63]?？莶菅挎邨U菌可以有效水解乳蛋白，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)乳蛋白肽有著較好的應(yīng)用前景[64]。此外，蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、霉菌芽孢桿菌等菌株均能有效水解酪蛋白，其中蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）發(fā)酵酪蛋白后產(chǎn)生了兩種新型抗菌肽（IKHQGLPQE和VLNENLR），抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該肽對(duì)嬰兒配方奶粉中的病原體阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）具有顯著的抑制活性[62]。

盡管迄今為止大多數(shù)酪蛋白衍生的生物活性肽都是由胃腸消化酶產(chǎn)生的，但芽孢桿菌具有從乳中生產(chǎn)生物活性肽的潛力，使用芽孢桿菌蛋白酶可能有助于發(fā)現(xiàn)更多新的生物活性肽。

4 酵母菌發(fā)酵法制備乳源生物活性肽

酵母菌在乳品（Kefir、酸馬奶、酸駝奶等）中發(fā)揮著重要作用，它們不僅可以代謝多種牛奶成分，賦予發(fā)酵乳獨(dú)特的風(fēng)味特征，同時(shí)還能水解乳蛋白產(chǎn)生生物活性肽[65-67]。酵母菌如馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母菌具有一組負(fù)責(zé)降解蛋白質(zhì)的蛋白酶和肽酶，它們主要用于在乳制品中分解乳蛋白并獲得生長(zhǎng)所需的肽和氨基酸[68-69]。Bintsis等[70]的研究表明，一些酵母菌具有比乳酸菌更高的蛋白水解活性；Klein等[71]在研究中發(fā)現(xiàn)，酵母菌表現(xiàn)出強(qiáng)大的肽酶活性，在降解β-酪蛋白衍生肽方面比瑞士乳桿菌更有效；唐蓉等[72]利用從傳統(tǒng)酸馬乳中篩選出的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）L8與解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Y7共發(fā)酵馬乳制備活性肽，經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件后發(fā)酵馬乳的ACE抑制率達(dá)到了80.67%，研究表明酵母菌發(fā)酵馬乳后不僅能釋放出ACE抑制肽，而且酵母菌的蛋白水解酶可能更有利于馬乳蛋白中特定ACE抑制肽的釋放。

工業(yè)中常使用富含益生菌微生物的發(fā)酵劑，以獲得與傳統(tǒng)方法制備的發(fā)酵乳相同的化學(xué)和功能特性，酵母菌益生作用以及分泌細(xì)胞外生物活性代謝物（如肽等）的能力可以增加發(fā)酵乳的功能[73]，例如牛初乳和牛乳鐵蛋白經(jīng)馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）和解脂假絲酵母（Candida lipolytica）發(fā)酵后均可以釋放具有高ACE抑制活性的肽[73-74]；Rai等[75]從印度傳統(tǒng)奶酪Chhurpi分離得到的馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）YMP45和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） YAM14的發(fā)酵物具有較高的抗氧化活性，可與乳酸菌一起用作生產(chǎn)生物活性肽的輔助發(fā)酵劑，生產(chǎn)具有抗氧化特性的Chhurpi。另外，酵母菌的羧肽酶和氨基肽酶在牛奶蛋白水解中也起著重要作用[60]，這可能會(huì)產(chǎn)生新的生物活性肽[76]。Li Yun等[68]利用馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）Z17發(fā)酵牛乳后ACE抑制活性達(dá)到了81.23%，通過Sephadex G-15凝膠過濾、反相高效液相色譜和基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-light tandem mass spectrometry，MALDI/TOF-TOF MS/MS）從發(fā)酵牛乳中鑒定出兩種具有ACE抑制活性的新肽（VLSRYP（IC50＝36.7 μmol/L）和LRFF（IC50＝116.9 μmol/L）），這兩種肽的C端含有疏水氨基酸殘基，可以結(jié)合ACE的活性位點(diǎn)，從而顯示出高ACE抑制活性。

此外，酵母菌的高蛋白水解活性可產(chǎn)生芳香前體，從而形成許多芳香化合物[76]，進(jìn)而直接影響發(fā)酵乳制品的風(fēng)味或充當(dāng)風(fēng)味前體。據(jù)Chaves-López等[67]報(bào)道，從哥倫比亞傳統(tǒng)發(fā)酵牛乳Kumis中分離得到的畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）KL84A和馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）KL26A可以生產(chǎn)出具有ACE抑制活性且無苦味的發(fā)酵乳。因此，乳源酵母菌具有從乳蛋白中釋放生物活性肽的潛力，并且能夠通過豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和增強(qiáng)風(fēng)味特征來提高最終產(chǎn)品的質(zhì)量[68]。

綜上所述，酵母菌在提高發(fā)酵產(chǎn)物中生物活性代謝物方面具有積極作用。盡管大多數(shù)文獻(xiàn)均表明釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母和解脂假絲酵母在生物活性肽的制備中起作用，但也不應(yīng)忽視其他酵母菌在生物活性肽產(chǎn)生方面的作用。

表2總結(jié)了近10 年酵母菌發(fā)酵乳制品的生物活性肽產(chǎn)生情況。

表2 近10 年酵母菌發(fā)酵法制備乳源生物活性肽Table 2 Preparation of bioactive peptides from milk by yeast fermentation in the past decade

5 霉菌發(fā)酵法制備乳源生物活性肽

一些真菌如埃及曲霉和米曲霉在制備生物活性肽方面具有重要應(yīng)用[81-82]，這些真菌雖沒有像乳酸菌那樣的蛋白水解系統(tǒng)，但它們含有各種蛋白酶，通過肽鍵的斷裂參與蛋白質(zhì)的水解，進(jìn)而獲得生物活性肽[18]。同時(shí)由于米曲霉發(fā)酵成本低、條件易控、安全性高以及能在各種不同底物條件下產(chǎn)生不同酶的特性，是中國(guó)食品工業(yè)中用得最多的菌種之一[81-87]。

霉菌中的米曲霉能產(chǎn)生多種蛋白酶，包括酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶[85-86]，且蛋白酶專一性不強(qiáng)[86-87]，在蛋白酶系的作用下，米曲霉可以將植物或動(dòng)物源的多種蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、肽和氨基酸[84,86-87]。例如，米曲霉蛋白酶水解酪蛋白后，可以從酶解物中純化得到降血壓肽（Ile-Pro-Pro）[88]；Mizuno等[89]使用包括米曲霉蛋白酶在內(nèi)的9 種蛋白酶水解酪蛋白，結(jié)果表明與其他酪蛋白水解物相比，由米曲霉蛋白酶制備的酪蛋白水解產(chǎn)物顯示出有效的體外ACE抑制活性和體內(nèi)降血壓作用，并且米曲霉肽的降壓作用具有劑量依賴性，因此米曲霉蛋白酶也被認(rèn)為是生產(chǎn)ACE抑制活性肽的酶。利用米曲霉和黃曲霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的真菌蛋白酶水解羊乳和牛乳后也可以產(chǎn)生具有抗菌和抗氧化活性的乳源生物活性肽，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于工業(yè)和生物技術(shù)的應(yīng)用具有一定價(jià)值[5]。

6 乳源生物活性肽制備方法優(yōu)、缺點(diǎn)比較分析

酶解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)法是生物活性肽在食品蛋白中釋放的主要方法，其中化學(xué)水解的方法因其非特異性、產(chǎn)率低、會(huì)導(dǎo)致氨基酸變性等缺陷而不是獲得生物活性肽的合適方法[90]。另外也可以利用重組DNA技術(shù)通過微生物來制備生物活性肽，但這一技術(shù)的局限性在于轉(zhuǎn)基因生物在食品中的應(yīng)用以及生產(chǎn)出的多肽可能對(duì)宿主機(jī)體產(chǎn)生有害影響[81,91]。與其他的生產(chǎn)方法相比，酶解法和微生物發(fā)酵法具有更高的安全性，已成為制備生物活性肽最常用的方法。

6.1 酶解法

在乳制品加工過程中，蛋白酶特定的活性位點(diǎn)首先與底物結(jié)合，然后通過氫鍵、范德華力或疏水相互作用形成酶-底物復(fù)合物，最后當(dāng)酶-底物復(fù)合物處于特定構(gòu)象時(shí)，它可以將大的蛋白質(zhì)片段水解成較小的肽或單個(gè)氨基酸。表3包含了在乳制品加工過程中使用的來源于動(dòng)物、植物和微生物的外源性蛋白酶，使用各種蛋白酶對(duì)乳蛋白進(jìn)行酶水解產(chǎn)生的一系列水解產(chǎn)物可作為生物功能成分應(yīng)用于各種配方食品，以滿足特定人群需求[92]。

表3 用于乳制品加工的動(dòng)物、植物和微生物來源的蛋白酶及其特性[93]Table 3 Proteases from animal, plant and microbial origins for dairy processing and their properties[93]

使用酶解法制備生物活性肽的優(yōu)勢(shì)在于其反應(yīng)迅速[93]、反應(yīng)條件溫和[94]，在反應(yīng)過程中通常不會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，并且在反應(yīng)過程中不使用化學(xué)合成藥物[95]，雖然這是一種經(jīng)過充分研究且很可靠的生物活性肽的生產(chǎn)方法[23,96-98]，但也存在一些缺點(diǎn)，例如在使用酶解法制備生物活性肽時(shí)，酶與底物比、反應(yīng)時(shí)間、pH值和反應(yīng)溫度等因素均會(huì)影響肽的分子質(zhì)量和氨基酸組成，從而影響其生物活性[12,23]。同時(shí)當(dāng)使用酶解法制備生物活性肽時(shí)，通常對(duì)底物進(jìn)行預(yù)處理，如加熱處理，這也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性以及一些氨基酸受損[99]，并且酶解過程中需要不斷添加酸或堿來調(diào)節(jié)pH值，引入的無機(jī)鹽增加了肽分離純化的難度[59]。最后，與發(fā)酵等其他工藝相比，酶解法成本昂貴，并且需要特殊的方法來保持其活性。

6.2 微生物發(fā)酵法

利用微生物發(fā)酵制備生物活性肽應(yīng)用最廣泛的兩種方法是液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵，其中固態(tài)發(fā)酵適用于對(duì)水分需求較少的真菌，液態(tài)發(fā)酵適用于具有高水位活性的微生物（例如細(xì)菌），并且具有生成的生物活性肽易于純化等優(yōu)勢(shì)[18,100]。與傳統(tǒng)酶解法制備的生物活性肽相比，微生物具有高度多樣性的、高活性的蛋白酶，在制備肽的過程中不同的酶在一系列反應(yīng)中混合作用于原料，而不是像酶水解中只有1 種蛋白酶起作用，因此，使用微生物發(fā)酵法制備生物活性肽的酶解效率高，且制備得到的肽具有更高的生物活性[101-102]。使用“GRAS”微生物從可食用蛋白中制備得到的生物活性肽被認(rèn)為更安全、更健康[103-104]，同時(shí)通過微生物發(fā)酵也可以增加所用底物的價(jià)值，降低活性肽的生產(chǎn)成本，并改善食品的感官、營(yíng)養(yǎng)和健康特性[104]。

另一方面，苦味是生物活性肽的特征之一，這也就意味著它們作為功能性產(chǎn)品的可接受性較低。而微生物代謝產(chǎn)生的肽酶可以水解苦味疏水性氨基酸，與傳統(tǒng)酶法相比能夠?qū)崿F(xiàn)生物脫苦，從而優(yōu)化生物活性肽產(chǎn)品的口感和風(fēng)味[29,105-106]。

7 乳源生物活性肽的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望

隨著經(jīng)濟(jì)與科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)食物的需求由溫飽轉(zhuǎn)向合理膳食。乳源生物活性肽因其潛在的健康益處，多被應(yīng)用于功能性食品或膳食補(bǔ)充劑中，同時(shí)乳源蛋白因來源廣泛、價(jià)格低廉等特點(diǎn)也使乳源生物活性肽在應(yīng)用方面具有廣闊的前景。例如添加了乳源降壓肽的乳制品在美國(guó)、日本、荷蘭等國(guó)家均已上市；在嬰兒配方乳粉中添加適量的乳源抗菌肽有助于提高嬰幼兒對(duì)病原微生物的抵抗力，抗菌肽也在嬰幼兒的腸道中發(fā)揮著抗菌與提高免疫力的作用[16]。除此之外，具有促進(jìn)骨骼發(fā)育、預(yù)防骨質(zhì)疏松作用的酪蛋白磷酸肽也被廣泛應(yīng)用在兒童或中老年保健/功能食品中，當(dāng)下，日本、德國(guó)等國(guó)家已經(jīng)生產(chǎn)出含酪蛋白磷酸肽的保健品，例如日本三得利公司推出了含酪蛋白磷酸肽的鐵骨飲料等食品[64]。

使用發(fā)酵法制備乳源生物活性肽時(shí)，不同微生物蛋白酶的差異化導(dǎo)致了生物活性肽的多樣性。目前，乳蛋白中新的生物活性肽及其在發(fā)酵乳制品中的生理功能仍在不斷擴(kuò)增，制備工藝的高效性和安全性是實(shí)現(xiàn)生物活性肽產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素[24,102]，在后續(xù)的發(fā)展過程中應(yīng)以研究和理論為基礎(chǔ)，將各種乳源生物活性肽表現(xiàn)出的促健康作用標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)品化。

8 結(jié) 語

雖然很多研究表明攝入乳源生物活性肽有利于維持人體健康，但肽在人體內(nèi)的應(yīng)用仍然存在著一些潛在的生物學(xué)問題，例如其在人體中的穩(wěn)定性、生物利用度和功效等問題。大量鑒定出來的乳源生物活性肽僅停留在研究階段，且對(duì)其活性的研究局限于體外模型，體內(nèi)活性研究較少，同時(shí)也缺乏對(duì)活性肽作用機(jī)制的研究，肽的構(gòu)效關(guān)系也有待闡明。解決這些問題可以使人們更加充分地理解乳源生物活性肽在人體健康中的作用，并有望從乳蛋白中提取出新的生物活性肽。隨著研究的不斷深入，乳源生物活性肽的研究前景和方向?qū)⒏訌V闊，并對(duì)食品和醫(yī)療保健行業(yè)產(chǎn)生重大影響。