外源葡萄糖通過調(diào)控蔗糖代謝增強采后杏果實的抗冷性

張 昱，蘆玉佳，趙亞婷，梁可欣，任新雅，劉志旭，石慧敏，朱 璇

（新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

新疆‘賽買提’杏（Prunus armeniacaL. cv.Saimaiti）風味獨特、果香濃郁、營養(yǎng)價值豐富，深受當?shù)叵M者喜愛，具有較高的商業(yè)價值[1]。杏屬于呼吸躍變型水果，且采收多集中于高溫季節(jié)，這導致果實后熟迅速，貨架時間短[2]。目前大量研究已經(jīng)證實了低溫貯藏是延緩果實采后衰老、品質(zhì)劣變和腐爛的常用策略之一[3]。但杏是冷敏性水果，在低溫貯藏期間易發(fā)生冷害，致使果實生理代謝紊亂，這是影響果實長期貯藏的主要限制因素[4-5]。因此如何減少果實在冷藏期間冷害的發(fā)生是目前鮮杏貯運產(chǎn)業(yè)亟需解決的問題。

可溶性糖含量與果實的品質(zhì)和口感密切相關，同時較高含量的可溶性糖在果實抵御低溫脅迫中起著重要的作用[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、果糖和蔗糖等可溶性糖可通過作為滲透壓調(diào)節(jié)劑、低溫保護劑、活性氧清除劑及信號分子等多重作用來緩解果實的低溫脅迫[9-11]。Shao Xingfeng等[12]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理可通過增強枇杷果實貯藏期間葡萄糖和果糖的含量來增強枇杷果實的耐冷性。Wang Zheng[3]與張杼潤[13]等研究發(fā)現(xiàn)，較高的葡萄糖與果糖水平可緩解杏果實的冷害現(xiàn)象。然而，這3 種可溶性糖在果實抵御低溫脅迫中所起的作用因果實種類和品種等差異而有所不同。Wang Ke[7]與董欣瑞[14]等研究發(fā)現(xiàn)，較高的蔗糖水平可緩解桃果實的冷害現(xiàn)象。在柑橘中也發(fā)現(xiàn)類似的結果，熱處理導致的蔗糖含量增加可能有助于提高柑橘果實的耐冷性[6]。

葡萄糖不僅是植物體內(nèi)主要的能量供應物質(zhì)，同時也可作為結構物質(zhì)為合成酚類及黃酮類等物質(zhì)提供碳骨架[15-16]。此外，研究表明，外源葡萄糖的施用可使園藝作物提質(zhì)增產(chǎn)、緩解植物逆境脅迫、調(diào)控植物成熟衰老[15-17]。Wei Jia等[17]研究發(fā)現(xiàn)，外源葡萄糖處理可提高甘藍和小白菜芽中的總酚與花青素的含量；Huang Yawen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖預處理在一定程度上降低了熱脅迫黃瓜的活性氧積累和膜脂質(zhì)過氧化，增強了黃瓜幼苗的耐熱性。Wang Yuanhua等[18]研究發(fā)現(xiàn)，外源葡萄糖處理可有效保持采后草莓的貯藏品質(zhì)，并提高其抗氧化能力。然而，目前關于外源葡萄糖處理對采后杏果實蔗糖代謝與冷害的影響還鮮有報道。因此本實驗以新疆‘賽買提’杏為材料，研究不同濃度葡萄糖處理對杏果實采后冷害與糖代謝的影響，旨在為杏果實冷害的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘賽買提’杏果實于2021年6月27日采自新疆英吉沙縣烏恰鎮(zhèn)試驗田，選取成熟度、大小相近、無病蟲害和機械損傷的杏果實，并立即運回新疆農(nóng)業(yè)大學果蔬采后貯藏實驗室。

果糖、葡萄糖、蔗糖標準品（純度≥99%） 上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、氯化鎂、氫氧化鈉、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、蒽酮、甘油（均為分析純） 天津致遠化學試劑有限公司；乙腈（色譜純） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

GY-4果實硬度計 浙江艾德堡儀器有限公司；NR10QC色差儀 廣東三恩時智能科技有限公司；PAL-1便攜式數(shù)顯折光儀 日本Atago公司；UF-103型紫外分光光度計 上海優(yōu)尼克儀器有限公司；3HBRI型高速冷凍離心機 湖南海瀾儀器設備有限公司；LC-20AB高效液相色譜儀 日本島津公司；HH-2S恒溫水浴鍋常州中纖檢測儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杏果實處理

參照本課題組前期研究結果[19]，采用減壓滲透法處理杏果實，處理組分別用100、200、400 mmol/L葡萄糖溶液對杏果實進行減壓滲透處理；以蒸餾水減壓滲透處理作為對照組。各組處理均重復3 次，每次重復4 kg果實。待果實晾干后于溫度（0±1）℃、相對濕度90%～95%的冷庫中貯藏。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 冷害發(fā)病率及冷害指數(shù)的測定

參照何歡等[5]的方法進行冷害發(fā)病率及冷害指數(shù)測定。

1.3.2.2 硬度、色澤、可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)的測定

杏果實硬度采用GY-4硬度計測定；色澤采用NR10QC色差儀測定；可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)（soluble solids content，SSC）采用PAL-1糖度儀測定。

1.3.2.3 可滴定酸質(zhì)量分數(shù)和抗壞血酸含量的測定

參照曹建康[20]的方法測定可滴定酸（titratable acidity，TA）質(zhì)量分數(shù)和抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）含量。TA質(zhì)量分數(shù)采用氫氧化鈉滴定法測定；ASA含量采用2,6-二氯靛酚滴定法測定，單位為mg/100 g。

1.3.2.4 丙二醛含量和細胞膜滲透率的測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量參照曹建康等[20]的方法測定，單位為nmol/g。細胞膜滲透率參照曹建康等[17]的方法，采用電導率法測定，單位為%。

1.3.2.5 蔗糖、果糖和葡萄糖含量的測定

采用液相色譜法測定可溶性糖含量[21]。提取方法：稱取5.0 g經(jīng)過勻漿處理的杏果肉樣品，加超純水50 mL，加入10.6 g/100 mL亞鐵氰化鉀溶液和21.9 g/100 mL乙酸鋅溶液各5 mL，磁力攪拌30 min，加超純水定容至100 mL。經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，進樣高效液相色譜儀進行分析。每處理選果3 個，重復3 次。

1.3.2.6 蔗糖代謝相關酶活力的測定

參照Jiang Hanyu等[22]的方法測定蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）和蔗糖合成酶（sucrose synthase、SS）活力。粗酶液提?。喝?.0 g杏果實樣品，液氮研磨后加入200 mmol/L pH 7.5 Hepes-NaOH溶液5 mL。將混合物在10 000 r/min下離心10 min，上清液即為粗酶液。SPS的測定體系包括：0.1 mL粗酶液、0.5 mL 50 mmol/L Hepes-NaOH緩沖液（pH 7.5）、0.2 mL 15 mmol/L MgCl2、0.15 mL 5 mmol/L 果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F(xiàn)-6-P）、0.15 mL 15 mmol/L葡萄糖-6-磷酸（glucose 6-phosphate，G-6-P）、0.2 mL 10 mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG），反應體系在37 ℃下孵育60 min，然后加入100 μL、質(zhì)量分數(shù)30% KOH溶液終止反應，用蒽酮測定法測定該反應產(chǎn)生的蔗糖量，以每克鮮質(zhì)量樣品每小時產(chǎn)生的蔗糖的物質(zhì)的量表示SPS活力，單位為μmol/（h·g）。SS活力測定時的混合物體系為0.1 mL粗酶液、0.5 mL 50 mmol/L Hepes-NaOH緩沖液（pH 7.5）、0.2 mL 15 mmol/L MgCl2、0.15 mL 10 mmol/L果糖、0.2 mL 10 mmol/L UDPG，其余操作及定義同SPS活力，單位為μmol/（h·g）。

酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase，AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（neutral invertase，NI）活力的檢測參考Cao Shifeng等[23]的方法。將約0.2 mL粗酶液與0.8 mL反應緩沖液（0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH 5.5）、0.1 g/L蔗糖）混合，34 ℃孵育1 h，采用3,5二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法檢測反應過程中產(chǎn)生的葡萄糖量，以每克鮮樣每小時產(chǎn)生的葡萄糖物質(zhì)的量表示AI活力，單位為μmol/（h·g）。將約0.2 mL粗酶液與0.8 mL反應緩沖液（含1 g/L蔗糖、pH 7.5 0.1 mol/L磷酸緩沖液、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二胺四乙酸）混合，其余操作及定義同AI活力，以每克鮮樣每小時產(chǎn)生的葡萄糖物質(zhì)的量表示NI活力，單位為μmol/（h·g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有物質(zhì)含量、酶活力結果均以鮮質(zhì)量計，采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)結果計算。用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncan檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。使用GraphPad Prism 8.0.2和Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 外源葡萄糖處理對杏果實采后冷害發(fā)病率及冷害指數(shù)的影響

如圖1A所示，在貯藏期間，杏果實的冷害發(fā)病率不斷上升。在貯藏14 d時，對照組的杏果實已發(fā)生冷害，而葡萄糖處理組在21 d時才開始發(fā)生冷害。此時（21 d）對照組杏果實冷害發(fā)病率分別是100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖處理組的1.23、2.09、1.23 倍。在貯藏第49天時，100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖處理組杏果實冷害發(fā)病率分別比對照組低15.87%、34.92%和19.04%（P＜0.05）。結果表明，不同濃度的葡萄糖處理均可顯著抑制杏果實冷害發(fā)病率的上升。

如圖1B所示，在貯藏過程中，杏果實的冷害指數(shù)呈上升趨勢，200 mmol/L葡萄糖處理組冷害指數(shù)在貯藏過程中顯著低于對照組。在貯藏結束時，對照組冷害指數(shù)分別是100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖處理組的1.31、1.81、1.36 倍（P＜0.05）。說明外源葡萄糖處理可顯著抑制杏果實冷害指數(shù)的上升。

與對照組相比，外源葡萄糖處理對杏果實采后冷害發(fā)病率和冷害指數(shù)都有一定的抑制作用，其中以200 mmol/L葡萄糖處理效果最顯著。

2.2 外源葡萄糖處理對杏果實采后貯藏品質(zhì)的影響

2.2.1 外源葡萄糖處理對杏果實色澤的影響

色澤是反映杏果實成熟度最直觀的指標之一。L*值表示果實的亮度，如圖2A所示，在貯藏期內(nèi)，各組杏果實的L*值均不斷下降。在貯藏期14～49 d時，200 mmol/L葡萄糖處理組杏果實的L*值顯著高于對照組（P＜0.05）。a*值表示果實的紅綠程度，a*值越大則果皮越紅，反之越綠。如圖2B所示，在貯藏過程中，杏果實的a*值呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，對照組a*值上升速率快于葡萄糖處理組。在貯藏結束時，200 mmol/L葡萄糖處理組的杏果實a*值分別比對照組、100 mmol/L葡萄糖處理組和400 mmol/L葡萄糖處理組低23.07%、11.53%、21.32%（P＜0.05）。如圖2C所示，在整個貯藏過程中，杏果實的b*值呈先上升后保持穩(wěn)定的趨勢，且各葡萄糖處理組b*值低于對照組，在第49天時，200 mmol/L葡萄糖處理組b*值比對照組低5.70%（P＜0.05）。說明，外源葡萄糖處理可有效維持杏果實貯藏期間的色澤，其中200 mmol/L葡萄糖處理效果最顯著。

圖2 外源葡萄糖對杏果實采后L*值（A）、a*值（B）、b*值（C）的影響Fig. 2 Effect of exogenous glucose on L* (A), a* (B) and b* (C) values of postharvest apricot fruit

2.2.2 外源葡萄糖處理對杏果實硬度、TA質(zhì)量分數(shù)、ASA含量、SSC的影響

如圖3A所示，在貯藏期間，杏果實硬度不斷降低，外源葡萄糖處理組杏果實的硬度高于對照組。在貯藏第49天時，200 mmol/L葡萄糖處理組的硬度比對照組高23.74%（P＜0.05）。說明適宜濃度的外源葡萄糖處理可有效維持杏果實硬度。

圖3 外源葡萄糖對杏果實采后硬度（A）、TA質(zhì)量分數(shù)（B）、ASA含量（C）和SSC（D）的影響Fig. 3 Effect of exogenous glucose on the hardness (A), and TA (B),ASA (C) contents and SSC (D) of postharvest apricot fruit

如圖3B、C所示，貯藏期間，杏果實TA質(zhì)量分數(shù)與ASA含量呈下降趨勢。在貯藏初期，對照組TA質(zhì)量分數(shù)下降迅速，在第14天時100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖處理組TA質(zhì)量分數(shù)分別是對照組的1.11、1.12、1.08 倍（P＜0.05）；在貯藏第35天時，100、200 mmol/L葡萄糖處理組杏果實AsA含量分別比對照組高14.75%、25.98%（P＜0.05）。說明適宜濃度的外源葡萄糖處理可有效維持貯藏期間杏果實TA質(zhì)量分數(shù)與ASA含量。

如圖3D所示，在貯藏前期SSC不斷上升，對照組杏果實SSC在14 d時達到峰值，而各葡萄糖處理組杏果實SSC在21 d時達到頂峰，此時（21 d），100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖處理組杏果實SSC比對照組分別高10.61%、8.84%、7.07%（P＜0.05）。在42 d時，100、200 mmol/L和400 mmol/L葡萄糖處理組杏果實SSC分別是對照組的1.06、1.13、1.07 倍（P＜0.05）。說明適宜濃度的外源葡萄糖處理可有效保持杏果實的SSC。

綜上所述，外源葡萄糖處理可維持杏果實的貯藏品質(zhì)，但以200 mmol/L葡萄糖處理效果最佳，故將200 mmol/L葡萄糖處理作為最佳濃度用于后續(xù)的實驗分析。

2.3 外源葡萄糖處理對杏果實采后細胞膜滲透率及MDA含量的影響

如圖4A、B所示，在貯藏過程中，杏果實的MDA含量與細胞膜滲透率呈上升趨勢。但200 mmol/L葡萄糖處理組杏果實MDA含量與細胞膜電解質(zhì)滲透率上升速率低于同期對照組。在貯藏第49天時，對照組MDA含量比200 mmol/L葡萄糖處理組高0.27 倍（P＜0.05），細胞膜滲透率比200 mmol/L葡萄糖處理組高0.18 倍（P＜0.05）。結果表明外源葡萄糖處理可顯著抑制杏果實貯藏期MDA的積累與細胞膜電解質(zhì)滲透率的上升。

2.4 外源葡萄糖處理對杏果實采后可溶性糖含量的影響

如圖5A所示，在貯藏第0～14天，對照組蔗糖含量迅速下降，而葡萄糖處理組則呈上升趨勢。在貯藏的21～35 d，各組蔗糖含量均呈下降趨勢。在貯藏第28～42天，對照組蔗糖含量顯著高于葡萄糖處理組，在第28天時，對照組蔗糖含量比葡萄糖處理組高0.12 倍（P＜0.05）。如圖5B所示，葡萄糖處理組在貯藏期間（14～49 d）果糖含量逐漸上升，從第21天起兩組間開始出現(xiàn)顯著性差異。在貯藏第49天時，葡萄糖處理組果糖含量比對照組高6.55%（P＜0.05）。如圖5C所示，貯藏初始時外源葡萄糖處理組葡萄糖含量呈快速，在貯藏第7天時，外源葡萄糖處理組葡萄糖含量比對照組高8.70%（P＜0.05），且整個貯藏過程中外源葡萄糖處理組的葡萄糖含量均顯著高于對照組。

圖5 外源葡萄糖處理對杏果實蔗糖（A）、果糖（B）和葡萄糖（C）含量的影響Fig. 5 Effect of exogenous glucose treatment on the contents of sucrose (A),fructose (B) and glucose (C) in apricot fruit

2.5 外源葡萄糖處理對杏果實采后蔗糖代謝相關酶活力的影響

如圖6A、B所示，在整個貯藏期間杏果實AI與NI活力先上升后下降，并在21 d時達到峰值，此時對照組AI活力比外源葡萄糖處理組低26.94%（P＜0.05）；外源葡萄糖處理組的NI活力比對照組高21.49%（P＜0.05）。在貯藏后期，對照組AI與NI活力下降迅速，在49 d時，外源葡萄糖處理組杏果實AI活力是對照組的1.83 倍（P＜0.05）；對照組NI活力在42 d時比外源葡萄糖處理組低22.22%（P＜0.05）。

圖6 外源葡萄糖處理對杏果實 AI（A）、NI（B）、SS（C）和SPS（D）活力的影響Fig. 6 Effect of exogenous glucose treatment on AI (A), NI (B), SS (C)and SPS (D) activities of apricot fruit

如圖6C所示，杏果實SS活力呈先上升后下降趨勢，在14 d時，外源葡萄糖處理組SS活力是對照組的1.36 倍（P＜0.05），在第42天時，外源葡萄糖處理組杏果實SS活力比對照組高23.91%（P＜0.05）。

如圖6D所示，貯藏期間，對照組杏果實SPS活力呈逐漸下降趨勢，而外源葡萄糖處理組在貯藏前期（0～14 d）SPS活力略有增加，之后呈下降趨勢。在14 d時，外源葡萄糖處理組SPS活力是對照組的1.21 倍（P＜0.05）。在第49天時，外源葡萄糖處理組杏果實SPS活力比對照組高1.71 倍（P＜0.05）。

3 討 論

葡萄糖是植物細胞中主要的代謝前體及生物質(zhì)來源，同時還可作為信號分子參與調(diào)控植物生長發(fā)育進程[16,24]。有研究表明，外源葡萄糖處理可有效提高青花菜貨架期間的抗氧化相關酶的活性，從而降低其衰老與黃化的速度[25-26]。Wu Jiang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖可作為滲透調(diào)節(jié)劑，通過保持細胞質(zhì)膜完整性來保護西瓜幼苗免受低溫脅迫。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，200 mmol/L葡萄糖處理可通過調(diào)控蔗糖代謝相關酶活性，提高貯藏期間葡萄糖與果糖的含量，抑制MDA的積累與細胞膜電解質(zhì)滲透率的上升，從而有效降低果實冷害發(fā)病率與冷害指數(shù)的升高，保持杏果實的貯藏品質(zhì)。

細胞膜損傷是植物遭受低溫脅迫的原初反應結果[12]，在低溫環(huán)境下，細胞膜由液晶狀轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀，結構受損，致使胞內(nèi)電解質(zhì)外滲[5,12]。此外，在低溫脅迫下活性氧過度積累引起的膜過氧化損傷也是加劇冷害的重要原因之一[5,28-29]。由此說明，果實抗冷性的強弱與細胞膜完整性密切相關。同時研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖代謝在果實抵御低溫脅迫中發(fā)揮了重要作用[7,12,30]。SPS、SS、AI、NI是果實蔗糖代謝的關鍵酶，SS在蔗糖的轉(zhuǎn)化過程中具有雙重作用，可同時參與蔗糖的合成與分解；AI與NI可催化蔗糖分解為葡萄糖與果糖；而SPS則可催化果糖、葡萄糖轉(zhuǎn)化為蔗糖[7,23]。Zhu Yi等[31]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下較高的AI、NI和SS活性所導致的蔗糖和還原糖的積累與木瓜果實較高的抗冷性有關。在本實驗中，葡萄糖處理組在貯藏前期（0～14 d）SS與SPS活力出現(xiàn)上升趨勢，隨后緩慢下降；而對照組SPS活力在整個貯藏期間呈現(xiàn)下降趨勢。其原因可能是外源葡萄糖的介入打破了可溶性糖轉(zhuǎn)化的平衡，促進了貯藏前期蔗糖的合成。而在貯藏中后期，葡萄糖處理組的NI、AI活力在第21天時達到高峰，且始終高于對照組，這可能會促使蔗糖分解，從而導致葡萄糖處理組果實的蔗糖含量低于對照組果實，進而促使葡萄糖處理組果實保持較高水平的葡萄糖與果糖含量。這與Wang Zheng等[3]的研究結果相似，即杏果實耐寒性的增強與其較高的葡萄糖與果糖含量有關。同時，在本研究中，外源葡萄糖處理顯著抑制了果實貯藏期間MDA的積累與細胞膜電解質(zhì)滲透率的上升。其原因可能是外源葡萄糖處理有效提高了貯藏期間杏果實的葡萄糖與果糖的含量，增強了果實的抗氧化能力，這有利于增強細胞膜的穩(wěn)定性，從而顯著降低果實的冷害發(fā)病率與冷害指數(shù)。研究表明，熱處理可通過提高枇杷果實葡萄糖含量來誘導增加果實抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)活性，從而降低膜過氧化損傷程度，提高果實抗冷性[12]，這與本實驗研究結果相似。此外，研究表明，葡萄糖等還原糖也可作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，通過穩(wěn)定杏果實冷藏期間的細胞滲透壓減輕膜損傷程度，從而減少冷害的發(fā)生[3,31]。

冷害所造成的細胞不可逆損傷是導致果實品質(zhì)劣變、縮短貯藏期的主要原因之一[7,23,32]。當果實遭受冷害時，果皮出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，色澤變暗，同時果實內(nèi)部組織絮敗軟化。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，適宜濃度的外源葡萄糖處理可有效保持杏果實的色澤與硬度，同時有效抑制貯藏期間SSC、TA質(zhì)量分數(shù)與ASA含量的下降，較好地保持果實的貯藏品質(zhì)。在草莓果實的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的結果，即外源葡萄糖處理維持了采后草莓的貯藏品質(zhì)，延長其貯藏期[18]。這說明外源葡萄糖在降低果實冷害、保持果實貯藏品質(zhì)方面具有一定的應用潛力與價值。

4 結 論

外源葡萄糖處理可有效調(diào)控杏果實貯藏期間蔗糖代謝相關酶SS、SPS、AI、NI的活力，提高果實體內(nèi)葡萄糖與果糖含量，同時降低貯藏中后期蔗糖的含量，抑制MDA的積累與細胞膜滲透率的上升；同時，適宜濃度（200 mmol/L）的外源葡萄糖處理可保持杏果實的硬度、色澤、SSC、TA質(zhì)量分數(shù)與ASA含量，顯著降低杏果實的冷害發(fā)病率與冷害指數(shù)，說明外源葡萄糖處理可通過調(diào)控杏果實蔗糖代謝增強果實的抗冷性。