木犀草素介導(dǎo)PERK/eIF2α/CHOP信號通路改善新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎的作用研究

章捷 田由 吳臻斐 黃玲莉

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是一種以腸道炎癥為主要特征的嚴(yán)重胃腸道疾病，多發(fā)于新生兒，尤其在早產(chǎn)兒、低體重兒中的發(fā)病率更高，是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因之一[1-2]。NEC 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。大量研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與NEC 病程發(fā)展密切相關(guān)，其中蛋白激酶RNA 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase RNA- like endoplasmic reticulum kinase，PERK）/真核翻譯啟動因子2α（eukayotic translation initiation factor 2α，eIF2α）/CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）信號通路是ERS 誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞凋亡的重要途徑，而抑制該通路可以改善腸道損傷，延緩NEC 的發(fā)病進(jìn)程[3-4]。因此，有效調(diào)控PERK/eIF2α/CHOP 信號通路或許能為治療NEC 的新藥研發(fā)提供思路。木犀草素是一種具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的黃酮類化合物，能有效減輕NEC 模型大鼠腸道黏膜損傷，對腸黏膜有保護(hù)作用[5-6]。木犀草素還能通過激活PERK、eIF2α、活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、CHOP 等ERS 相關(guān)蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[7]。但木犀草素能否通過調(diào)控PERK/eIF2α/CHOP 信號通路改善NEC，目前尚不明確。因此，本研究通過建立NEC 大鼠模型和NEC 細(xì)胞模型，從大鼠體內(nèi)外水平觀察木犀草素對NEC 的影響以及對PERK/eIF2α/CHOP 信號通路的調(diào)控作用，進(jìn)而探討木犀草素改善NEC 的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞 無特定病原體的清潔級新生SD 大鼠30 只，雌雄不限，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。大鼠小腸上皮細(xì)胞系IEC-6（批號：iCell-r016）購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。本研究經(jīng)浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查通過（批準(zhǔn)文號：ZJEY-20221128-06）。

1.2 主要試劑與儀器 木犀草素（粉劑；規(guī)格：100 mg/瓶；批號：B20888）、PERK 抑制劑GSK2606414（粉劑；規(guī)格：25 mg/瓶；批號：S80279）、4'，6-二脒基-2 苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（批號：S19119）均購自上海源葉生物科技有限公司；蘇木素（批號：20220425）、伊紅（批號：20220417）均購自美國Sigma公司；噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑盒（批號：117831320226）、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）試劑盒（批號：11222220513）、BCA 定量試劑盒（批號：120219200721）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（批號：202211）購自泉州市睿信生物科技有限公司；大鼠IL-6 ELISA 試劑盒（批號：864895-008）購自美國Thermo公司；PERK抗體（批號：23M5315）、磷酸化PERK（p-PERK）抗體（批號：87p8121）、eIF2α抗體（批號：55h2355）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）抗體（批號：83H9328）、CHOP 抗體（批號：55Y1643）均購自美國Affinity 公司。Micro17R 低溫高速離心機(jī)、BB150細(xì)胞培養(yǎng)箱均購自美國Thermo 公司；TP1020 脫水機(jī)、RM2235 病理切片機(jī)均購自上海徠卡儀器有限公司；BMJ-IB 包埋機(jī)購自天津天利航空機(jī)電有限公司；Nikon Eclipse Ci-L 正置光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon 公司；AE2000 光學(xué)顯微鏡購自中國Motic 公司；610020-9Q 化學(xué)發(fā)光儀購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；BX63 電動熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3 動物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 動物建模、分組與處理 （1）NEC 新生大鼠模型建立：取24 只新生大鼠置于含100%氮?dú)獾娜毖跸渲?0 s 后立即取出，置于4 ℃冰箱中10 min，每12 h 進(jìn)行1 次上述缺氧冷刺激，連續(xù)3 d，建立NEC 新生大鼠模型[8]。（2）動物分組：將建模后的新生大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為木犀草素17.5 mg/kg 組、木犀草素35 mg/kg組、木犀草素70 mg/kg 組、模型組，每組6 只；剩余6 只新生大鼠設(shè)為正常組。（3）動物處理：用藥的3 組新生大鼠分別予相應(yīng)劑量的木犀草素（均溶于0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液中），其余兩組新生大鼠僅予0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液，均灌胃1 次/d，連續(xù)4 d。5 組新生大鼠均在籠中鼠乳喂養(yǎng)，于第5 天予二氧化碳安樂死處理，采集大鼠眼眶血備用，剖腹取結(jié)腸組織備用。

1.3.2 大鼠腸道組織病理學(xué)變化觀察 采用HE 染色。取大鼠腸道組織，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm 切片，脫蠟水合，HE 染色。在正置光學(xué)顯微鏡觀察采集大鼠腸道組織病理學(xué)變化并采集圖片。

1.3.3 大鼠腸道組織細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL法。取大鼠腸道組織，切成5 μm 薄片，烤片30 min，脫蠟水化。滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，在37 ℃下處理30 min。甩干后使用PBS配置的0.1%Triton在室溫下孵育組織樣本20 min。隨后滴加TdT酶、dUTP、buffer，置于37 ℃恒溫箱孵育2 h。使用PBS洗滌3次，5 min/次。移除PBS后滴加DAPI染液，置于避光室溫下孵育10 min。使用抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，利用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=（TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.3.4 大鼠腸道組織及血清中TNF-α、IL-6 水平檢測 采用ELISA 法。（1）取大鼠腸道組織，PBS 沖洗，剪碎，制備組織勻漿，6 711 r/min 離心5 min，取上清液檢測大鼠腸道組織中TNF-α、IL-6 水平。（2）取大鼠眼眶血，3 500 r/min 離心15 min，取上清液檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平。

1.3.5 大鼠腸道組織PERK/eIF2α/CHOP 信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。根據(jù)試劑盒提示步驟提取大鼠腸道組織蛋白，采用BCA 法測定樣品濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，封閉，孵育1.5 h，洗膜，加入一抗（PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP），4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜。在暗室中曝光顯影，使用Quantity One 凝膠分析軟件測定蛋白條帶灰度值，計(jì)算p-PERK 與PERK、p-eIF2α 與eIF2α、CHOP 與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）條帶灰度值的比值。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞建模與分組 （1）NEC 細(xì)胞模型建立：將大鼠腸上皮細(xì)胞系IEC-6 置于100 μg/mL 脂多糖溶液中刺激3 h[9]。（2）細(xì)胞分組：①將建模后的IEC-6 細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞濃度設(shè)為1×106個/孔，按隨機(jī)數(shù)字表法分為木犀草素5 μmol/L 組、木犀草素10 μmol/L組、木犀草素20 μmol/L 組、模型組，另取未行脂多糖處理的IEC-6 細(xì)胞設(shè)為正常組（僅予0.9%氯化鈉溶液），使用移液槍分別加入相應(yīng)藥物后，均在37 ℃、95%O2+5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②另取建模后的IEC-6 細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞濃度設(shè)為1×106個/孔，分為GSK2606414 0.5 μmol/L 組、GSK2606414 1.0 μmol/L 組、GSK2606414 2.0 μmol/L 組、GSK2606414 4.0 μmol/L 組、模型組（僅予0.9%氯化鈉溶液），使用移液槍分別加入相應(yīng)藥物后，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以上實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3 個復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.4.2 IEC-6 細(xì)胞存活率檢測 采用MTT法。取各組IEC-6 細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，經(jīng)不同濃度木犀草素或GSK2606414干預(yù)處理后，加入10 μL MTT溶液培養(yǎng)2 h；使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm 處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)胞存活率最高的藥物濃度（木犀草素20 μmol/L，GSK2606414 4.0 μmol/L）作為干預(yù)濃度，增設(shè)木犀草素20 μmol/L+GSK2606414 4.0 μmol/L 組。

1.4.3 IEC-6 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 水平檢測 采用ELISA法。取IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)液，2 000～3 000 r/min離心20 min，取上清液檢測IEC-6細(xì)胞中TNF-α、IL-6水平。

1.4.4 EC-6 細(xì)胞中PERK/eIF2α/CHOP 信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。根據(jù)試劑盒提示步驟提取EC-6 細(xì)胞總蛋白，后續(xù)步驟與1.3.5所描述的基本相同。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Graph-Pad Prism 9.0 軟件。計(jì)量資料以表示，若方差齊時多組間比較采用單因素方差分析的Tukey 檢驗(yàn)，若方差不齊多組間比較采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素對NEC 大鼠腸道組織病理學(xué)變化的影響 正常組大鼠腸道組織結(jié)構(gòu)基本正常完整，無明顯損傷；模型組、木犀草素17.5 mg/kg 組大鼠腸道組織絨毛脫落嚴(yán)重，黏膜下層和（或）固有層嚴(yán)重分離，組織損傷嚴(yán)重；木犀草素35 mg/kg組大鼠腸道組織絨毛脫落分離，組織輕微損傷；木犀草素70 mg/kg 組大鼠腸道組織結(jié)構(gòu)較為完整，絨毛輕微分離，組織損傷較小，見圖1。

圖1 木犀草素對壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠腸道組織病理學(xué)變化的影響

2.2 木犀草素對NEC 大鼠腸道組織細(xì)胞凋亡率的影響 與正常組比較，模型組大鼠腸道組織細(xì)胞凋亡率明顯較高（P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素17.5 mg/kg 組、木犀草素35 mg/kg 組、木犀草素70 mg/kg組大鼠腸道組織細(xì)胞凋亡率均明顯較低（均P＜0.05），見圖2（封三）。

圖2 木犀草素對壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠腸道組織細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 木犀草素、GSK2606414 對IEC-6 細(xì)胞存活率的影響 木犀草素5 μmol/L 組、木犀草素10 μmol/L 組、木犀草素20 μmol/L 組、模型組、正常組細(xì)胞存活率分別為（53.29±3.59）%、（68.70±4.55）%、（83.42±6.39）%、（43.39±2.80）%、（100.00±6.35）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中模型組細(xì)胞存活率較正常組明顯下降（P＜0.05），木犀草素5 μmol/L 組、木犀草素10 μmol/L 組、木犀草素20 μmol/L 組細(xì)胞存活率均較模型組明顯升高（均P＜0.05），且以木犀草素20 μmol/L組最高（均P＜0.05）。GSK2606414 0.5 μmol/L組、GSK2606414 1.0 μmol/L 組、GSK2606414 2.0 μmol/L組、GSK2606414 4.0 μmol/L 組、模型組細(xì)胞存活率分別為（66.72± 6.44）% 、（74.61± 7.39）% 、（80.15±7.42）%、（85.57±7.51）%、（52.52±5.17）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中GSK2606414 0.5 μmol/L 組、GSK2606414 1.0 μmol/L 組、GSK2606414 2.0 μmol/L 組、GSK2606414 4.0 μmol/L 組細(xì)胞存活率較模型組均明顯升高（均P＜0.05），且以GSK2606414 4.0 μmol/L 組最高（均P＜0.05）。故后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)胞存活率最高的藥物濃度（木犀草素20 μmol/L，GSK2606414 4.0 μmol/L）作為干預(yù)濃度。

2.4 木犀草素對NEC 大鼠腸道組織、血清及IEC-6 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠腸道組織及血清中TNF-α、IL-6 水平均明顯較高（均P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素35 mg/kg 組、木犀草素70 mg/kg 組大鼠腸道組織中TNF-α、IL-6 水平明顯較低（均P＜0.05），木犀草素17.5 mg/kg 組、木犀草素35 mg/kg 組、木犀草素70 mg/kg 組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平均明顯較低（均P＜0.05），見表1。與正常組比較，模型組IEC 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 水平均明顯較高（均P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素20 μmol/L 組IEC 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 水平均明顯較低（均P＜0.05），見表2。

表1 木犀草素對壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠腸道組織及血清中TNF-α、IL-6 水平的影響（ng/L）

表2 木犀草素對IEC-6細(xì)胞中TNF-α、IL-6水平的影響（ng/L）

2.5 木犀草素對NEC 大鼠腸道組織及IEC-6 細(xì)胞中PERK/eIF2α/CHOP 信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠腸道組織中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP 表達(dá)水平均明顯較高（均P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素17.5mg/kg組、木犀草素35mg/kg組、木犀草素70mg/kg組大鼠腸道組織中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表達(dá)水平均明顯較低（均P＜0.05），見圖3A。與正常組比較，模型組IEC-6細(xì)胞中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表達(dá)水平均明顯較高（均P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素20μmol/L組IEC-6細(xì)胞中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表達(dá)水平均較低（均P＜0.05）；與木犀草素20μmol/L組比較，木犀草素20μmol/L+GSK26064144.0μmol/L組IEC-6細(xì)胞中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表達(dá)水平均明顯較低（均P＜0.05），見圖3B。

3 討論

NEC 發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，早期以腸道炎癥為主要特征，隨疾病發(fā)展，可導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞凋亡、壞死，嚴(yán)重時可引發(fā)多器官衰竭和全身膿毒血癥，最終造成死亡[10-11]。因此，抑制腸道炎癥、減少小腸上皮細(xì)胞凋亡對于有效治療NEC 尤為重要。但目前對于NEC 的治療方法以外科手術(shù)治療和內(nèi)科保守治療為主，前者易導(dǎo)致多種并發(fā)癥，后者往往療效不佳且不良反應(yīng)較多，目前尚無統(tǒng)一有效的臨床治療措施[12-13]。本研究使用的木犀草素源于多種藥用植物的活性成分，具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的生物活性，可有效改善NEC 模型大鼠腸道損傷，緩解其發(fā)病進(jìn)程[5-6]。相關(guān)研究表明，木犀草素具有減輕組織損傷、減少細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)細(xì)胞活性的作用[14]。本研究以缺氧冷刺激法建立NEC 大鼠模型，HE 染色結(jié)果顯示，與模型組比較，木犀草素35 mg/kg 組、木犀草素70 mg/kg 組大鼠腸道組織絨毛分離減少，組織損傷明顯改善，這說明木犀草素對腸道組織結(jié)構(gòu)和功能具有顯著改善作用。TUNEL 染色結(jié)果顯示，與模型組比較，不同濃度木犀草素干預(yù)后的NEC 大鼠腸道組織細(xì)胞凋亡率均明顯下降，說明木犀草素可抑制腸道組織細(xì)胞凋亡。同時，本研究采用脂多糖刺激法建立NEC 細(xì)胞模型，MTT 結(jié)果顯示，與模型組比較，木犀草素5 μmol/L 組、木犀草素10 μmol/L 組、木犀草素20 μmol/L 組IEC 細(xì)胞存活率均明顯升高，其中木犀草素20 μmol/L 組作用最顯著，說明木犀草素能夠提高小腸上皮細(xì)胞存活率。以上研究結(jié)果與Vukelic 等[14]研究結(jié)果相符。

炎癥反應(yīng)在NEC 的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。多項(xiàng)研究表明，TNF-α、IL-6 水平與NEC 早期診斷和預(yù)后評估有關(guān)[15]。TNF-α 是體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在感染、腹瀉等多種應(yīng)激源的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核中，可介導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[16]。Schreurs 等[17]研究表明，胎兒CD4 效應(yīng)記憶T 細(xì)胞可通過分泌TNF-α 細(xì)胞因子在生命早期介導(dǎo)嚴(yán)重的細(xì)胞炎癥，進(jìn)而引發(fā)NEC。IL-6 是人體重要的促炎介質(zhì)，能誘導(dǎo)許多炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)的釋放，是導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)和平衡障礙的關(guān)鍵因素之一。Guo等[18]研究表明，IL-6 水平與腸道生理和病理狀態(tài)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，經(jīng)不同濃度木犀草素干預(yù)處理后的NEC 大鼠腸道組織、血清以及IEC 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 水平均明顯下降，說明木犀草素可通過抑制炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6 的釋放來減輕組織炎癥，進(jìn)而延緩疾病進(jìn)程，這可能與木犀草素能夠通過調(diào)控促炎介質(zhì)、調(diào)節(jié)促炎基因表達(dá)以及調(diào)節(jié)炎癥小體發(fā)揮抗炎作用等有關(guān)[19]。

ERS 是機(jī)體面對多種刺激因素和損傷因子進(jìn)行適應(yīng)環(huán)境的自我調(diào)整，在NEC 的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其增加會引起小腸上皮細(xì)胞凋亡或壞死，最終導(dǎo)致NEC 的發(fā)生[20]。當(dāng)發(fā)生ERS 時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）維持其正常功能并促進(jìn)細(xì)胞存活，但是如果刺激過強(qiáng)或持續(xù)過久，UPR 不能恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，則會啟動凋亡途徑，損害組織器官[20]。PERK/eIF2α/CHOP 信號通路是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路之一。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在較多未折疊蛋白時，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白會與PERK 分離，從而激活PERK，隨后eIF2α 通過磷酸化阻斷蛋白質(zhì)合成，但持續(xù)的應(yīng)激會增加ATF4 的翻譯，促進(jìn)CHOP 的表達(dá)，進(jìn)而激活PERK/eIF2α/CHOP 信號通路，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3-4，21]。本研究MTT 結(jié)果顯示，與模型組比較，給予GSK2606414 干預(yù)后的IEC 細(xì)胞存活率明顯升高，其中GSK2606414 4.0 μmol/L 組作用最顯著，提示抑制PERK 蛋白可提高小腸上皮細(xì)胞活性，木犀草素可能通過調(diào)控PERK 蛋白來減少細(xì)胞凋亡，并增加細(xì)胞活性。Western blot 檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，經(jīng)木犀草素干預(yù)處理后的NEC 大鼠腸道組織、血清以及IEC 細(xì)胞中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP 表達(dá)水平均明顯降低，而加入GSK2606414 后木犀草素對PERK/eIF2α/CHOP 信號通路的抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)，進(jìn)一步說明木犀草素可通過抑制PERK/eIF2α/CHOP 信號通路來減少NEC 腸道組織細(xì)胞的凋亡、壞死。

綜上所述，木犀草素可有效改善新生大鼠NEC，其作用機(jī)制可能與下調(diào)TNF-α、IL-6 以及p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP 表達(dá)水平進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，這為臨床NEC 的治療提供理論參考。