藏紅花醛對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥相關(guān)肝損傷小鼠模型的作用及其機(jī)制

陳 意， 陳羿帆， 杜毅超，2， 譚 鵬，2， 李童希， 白俊杰， 付文廣，2

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科（肝膽胰方向）， 四川 瀘州 646000； 2 四川省院士（專家）工作站， 四川瀘州 646000

膿毒癥是一種臨床常見的感染性疾病，可導(dǎo)致多種器官功能損傷或衰竭，其中肝臟是常見的受累器官。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠刺激肝細(xì)胞釋放多種促炎癥因子（如TNF-α、IL-1、IL-6 等），引起血清凝集素的釋放，并激活全身性炎癥反應(yīng)，從而形成內(nèi)毒素血癥［1-2］。研究［3-5］表明，LPS 可以模擬膿毒癥誘發(fā)的急性肝損傷，因此LPS 誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型在相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用。目前，膿毒癥誘導(dǎo)急性肝損傷的病因被認(rèn)為有炎癥和免疫反應(yīng)、細(xì)胞缺氧、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等。在膿毒癥相關(guān)肝損傷（sepsis related liver injury，SRLI）中，LPS與Toll樣受體4和CD14的結(jié)合對(duì)細(xì)胞核因子-κB（NF-κB）的活化起重要作用，而NF-κB 的活化則是LPS 誘導(dǎo)肝損傷的主要機(jī)制，其潛在機(jī)制涉及炎癥和細(xì)胞凋亡［6-7］。研究［8-10］表明，氧化應(yīng)激因子通過(guò)激活核因子NF-E2 相關(guān)因子2（nuclear factor NF-E2-related factor 2，Nrf2）可上調(diào)血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表達(dá)，通過(guò)HO-1 的抗炎、抗氧化和抗凋亡蛋白的保護(hù)作用，影響各種感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展。藏紅花醛作為藏紅花的主要化學(xué)成分之一，其抗氧化、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗炎和抗凋亡等功能已被重視，現(xiàn)有研究［11-13］指出藏紅花醛可有效保護(hù)腦、心肌、骨骼肌和視網(wǎng)膜等組織免受氧化損傷。然而，其在SRLI 中的應(yīng)用目前未見報(bào)道，深入研究其抗氧化作用效果并了解其作用機(jī)制可為膿毒癥相關(guān)急性肝損傷的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32 只雄性C57BL/6 小鼠購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。小鼠分組單籠飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF 動(dòng)物房，使用許可證號(hào)：SYXK（川）2018-065，溫度控制于（25±2）℃，濕度控制為（45±5）%，自由飲食飲水飼養(yǎng)，環(huán)境明暗12 h/12 h循環(huán)。

1.2 試驗(yàn)材料 人正常肝細(xì)胞L02 細(xì)胞株購(gòu)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；LPS 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；藏紅花醛購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；RIPA 裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）購(gòu)自Solarbio 公司；蘇木精-伊紅（HE）染液試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒和TUNEL 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)自Merck Millipore 公司。試劑：Nrf-2（批號(hào)：16396-1-AP）、HO-1（批號(hào)：66743-1-Ig）和β-actin（批號(hào)：81115-1-RR）抗體均購(gòu)自Proteintech 公司（中國(guó)，武漢）；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)、分組與給藥 采用簡(jiǎn)單隨機(jī)法將32 只雄性C57BL/6 小鼠分為4 組，每組8 只：適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，分為對(duì)照組（生理鹽水）、單藥組（藏紅花醛60 mg/kg）、模型組（LPS 10 mg/kg）、治療組（藏紅花醛60 mg/kg+LPS 10 mg/kg），對(duì)照組給予生理鹽水1 次，單藥組和治療組每天給予藏紅花醛1次，連續(xù)給藥7天。為誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，在最后一次給藥2 h 后將模型組和治療組的小鼠分別經(jīng)腹腔注射LPS（10 mg/kg）。12 h 后，給予戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，從而取得小鼠肝臟樣本和血液樣本。下腔靜脈血室溫下放置2 h，血清分層后低溫4 000 r/min 離心10 min，隨后提取上層血清放入4 ℃冰箱中備用。取部分小鼠肝組織置于4%多聚甲醛中固定，用于行HE、免疫組化染色及TUNEL檢測(cè)，剩余部分肝臟在液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與給藥 取人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞，加入10%胎牛血清，培養(yǎng)于含5%青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將其接種于6 孔板，設(shè)置對(duì)照組、單藥組、模型組、治療組。接種12 h 后，細(xì)胞完全貼壁，用新鮮培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基。向?qū)φ战M（生理鹽水）、單藥組（藏紅花醛100 μmol/L）、模型組（生理鹽水）、治療組（藏紅花醛100 μmol/L）分別加入相應(yīng)的藥物，藥物加入后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。向模型組和治療組中加入LPS（100 ng/mL），繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h。

1.3.3 血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀（BIOBASE，BK-200），對(duì)上述步驟獲取的小鼠血清行AST及ALT活性測(cè)定。

1.3.4 HE 染色 使用4%多聚甲醛固定肝組織，凝固后包埋于石蠟中，并使用切片機(jī)將石蠟切成4 μm厚的切片，最后進(jìn)行HE 染色。首先使用二甲苯將石蠟切片進(jìn)行脫蠟，然后使用梯度乙醇進(jìn)行復(fù)水處理，以恢復(fù)其原來(lái)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。使用新鮮配制的蘇木素染色時(shí)間3 min，分化時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色情況，細(xì)胞核變藍(lán)后可立即將切片放置于自來(lái)水中沖洗。新鮮的伊紅染色1 min，伊紅染色后需經(jīng)過(guò)從低濃度到無(wú)水的各級(jí)乙醇脫水。將脫水好的切片用二甲苯透明處理以后，再用中性樹脂封片并進(jìn)行光鏡檢查，對(duì)比病變的嚴(yán)重程度，依據(jù)水腫、炎癥反應(yīng)和壞死（點(diǎn)狀、條狀、帶狀）情況進(jìn)行評(píng)估。

1.3.5 免疫組化 將獲取的肝組織切片在二甲苯和梯度乙醇中進(jìn)行脫蠟，然后將其放入緩沖液中，保持2 h 以使抗原決定簇獲得充分暴露。再將其浸泡于3%過(guò)氧化氫溶液中，在室溫下孵育10 min，然后將其封閉，并用PBS 沖洗3 次，加入1∶200 稀釋的HO-1 工作液4 ℃孵育過(guò)夜，次日沖洗干凈，滴加對(duì)應(yīng)種屬的二抗工作液（HRP 標(biāo)記）室溫孵育30 min，清洗，DAB 顯色2～5 min 至顯微鏡觀察到棕黃色顆粒，使用去離子水終止反應(yīng)。使用蘇木素染液輕度復(fù)染1.5～2 min，再清洗，采取梯度乙醇脫水，浸泡于二甲苯，烘干，以中性樹膠封片，送入顯微鏡觀察、記錄并分析圖像。

1.3.6 Western Blot 檢測(cè) 從少量?jī)龃娴母谓M織中提取樣本，通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平研究肝臟狀態(tài)。首先，將RIPA 細(xì)胞裂解液（含1%PMSF）加入樣本并使用勻漿機(jī)對(duì)其進(jìn)行勻漿，然后將其放置于冰上約30 min，并以4 ℃、12 000 r/min 的速度進(jìn)行離心20 min，最后吸取上清液，然后行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定、變性、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離以及轉(zhuǎn)印。待蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上后，用5%脫脂奶粉（溶于TBST）在室溫下封閉1 h；然后加入一抗（HO-1，1∶2 000 稀釋；Nrf-2，1∶2 000 稀釋；β-actin，1∶4 000 稀釋），在4 ℃搖床條件下孵育過(guò)夜；次日洗膜后，加入1∶5 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的二抗工作液，在室溫下孵育1 h；洗膜后使用ECL 發(fā)光液對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯色，并在成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)，利用ImageJ 軟件對(duì)檢測(cè)到的條帶進(jìn)行灰度分析，以β-acting 作為內(nèi)參進(jìn)行校正，對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.3.7 TUNEL標(biāo)記檢測(cè) 小鼠肝組織行常規(guī)石蠟切片，采用TUNEL 標(biāo)記檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡及其變化［14］。使用碧云天（中國(guó)）的TUNEL 凋亡試劑盒，按照產(chǎn)品使用說(shuō)明書進(jìn)行染色。

1.3.8 ROS 活性檢測(cè) 按照碧云天生物技術(shù)有限公司提供的ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，并在熒光顯微鏡下觀察和拍照記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件和Graphpad Prism9 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖，計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝生化指標(biāo)比較 對(duì)照組與單藥組相比較，給藥后兩者ALT 水平相當(dāng)，兩者變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，模型組小鼠注射LPS 之后，ALT 水平明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，治療組ALT 水平較模型組明顯降低（P＜0.001）。與模型組比較，治療組AST 水平較模型組明顯降低（P＜0.01）（圖1）。

圖1 小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶水平的差異Figure 1 The differences of transaminase levels in mice serum

2.2 HE 染色結(jié)果比較 HE 染色顯示，對(duì)照組和單藥組肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，界限清楚，肝小葉輪廓清晰，以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞有序排列呈放射狀，相互連接成肝細(xì)胞條索，表現(xiàn)出良好的結(jié)構(gòu)完整性，未見明顯的細(xì)胞變性、壞死及脂肪變性。模型組肝組織細(xì)胞排列不規(guī)律，肝細(xì)胞腫脹，存在大量的血管破裂和紅細(xì)胞彌散，細(xì)胞形態(tài)異常；治療組肝組織HE 染色，可見有部分肝細(xì)胞明顯收縮變性，肝小葉輪廓不規(guī)則、細(xì)胞排列紊亂，界限大致清楚，部分肝小葉間隔增大，可見肝細(xì)胞腫脹，可見少量血管破裂和紅細(xì)胞彌散（圖2）。

圖2 各組小鼠肝組織HE染色結(jié)果比較（×200）Figure 2 The difference of liver tissue after HE staining in each group（×200）

2.3 免疫組化結(jié)果比較 通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠肝臟中HO-1 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對(duì)照組和單藥組小鼠肝組織HO-1 的表達(dá)維持在正常水平，只可見輕微的陽(yáng)性細(xì)胞。在模型組中，HO-1 的表達(dá)出現(xiàn)輕度升高，而在治療組則表現(xiàn)出明顯的升高（圖3）。

圖3 各組小鼠肝組織免疫組化檢測(cè)HO-1蛋白水平比較（×200）Figure 3 The protein levels of HO-1 detected by immunohistochemical staining（×200）

2.4 Western Blot結(jié)果比較 通過(guò)Western Blot分析各組小鼠肝組織樣本中Nrf2 和HO-1 的表達(dá)水平。對(duì)照組中Nrf2 的表達(dá)量很低，單藥組中同樣可見Nrf2 少量表達(dá)，模型組與對(duì)照組和模型組比較可見Nrf2 表達(dá)水平略微高于前兩組，在給予LPS 后模型組Nrf2 升高更加明顯，模型組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。經(jīng)藏紅花醛+LPS 處理后的治療組中Nrf2 表達(dá)量相較于模型組明顯升高（P＜0.001）。在對(duì)肝組織HO-1 檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中僅見極低量的HO-1 表達(dá)，單藥組中可見微量HO-1 表達(dá)。經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后，模型組小鼠肝組織HO-1 表達(dá)有所上升，而治療組小鼠經(jīng)藏紅花醛+LPS 處理后肝組織HO-1 表達(dá)水平相較于模型組明顯升高（P＜0.001）（圖4）。

圖4 各組小鼠肝組織Nrf2和HO-1表達(dá)量比較Figure 4 The expression levels of Nrf2 and HO-1 in liver tissue of mice in each group

2.5 TUNEL 檢測(cè)結(jié)果比較 TUNEL 檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組。與模型組相比，給予藏紅花醛藥物干預(yù)后，治療組小鼠肝組織細(xì)胞凋亡率明顯降低，對(duì)照組和單藥組無(wú)明顯異常（圖5）。

圖5 TUNEL檢測(cè)各組小鼠肝組織中細(xì)胞凋亡情況（×200）Figure 5 Cell apoptosis in liver tissue of mice were detected by TUNEL assay（×200）

2.6 ROS 檢測(cè)結(jié)果比較 通過(guò)使用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)ROS 的產(chǎn)生量在對(duì)照組和單藥組中均低，而在模型組中明顯升高。與模型組相比，治療組中ROS的產(chǎn)生量明顯減少（圖6）。

圖6 各組L02細(xì)胞中ROS產(chǎn)生量的比較（×200）Figure 6 Comparison of ROS production in L02 cells in each group（×200）

3 討論

對(duì)膿毒癥病理生理學(xué)的研究至關(guān)重要，有助于深入了解免疫反應(yīng)失調(diào)如何導(dǎo)致器官功能障礙，從而優(yōu)化患者的管理和治療，并發(fā)現(xiàn)新的潛在治療方法。膿毒癥可對(duì)心血管系統(tǒng)（包括微循環(huán)系統(tǒng)）、呼吸系統(tǒng)［15］、腎臟系統(tǒng)［16］、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和消化系統(tǒng)［17］造成損害，其中肝臟是膿毒癥常常累及的器官。早期出現(xiàn)的肝功能障礙是膿毒癥患者死亡的重要預(yù)警信號(hào)，其重要性高于呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)癥狀，且現(xiàn)有治療措施無(wú)法有效緩解肝損傷。近年研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是SRLI 過(guò)程中重要因素［18］，如何抑制氧化應(yīng)激是該病治療研究的重要方向。藏紅花醛具有強(qiáng)抗氧化作用［19］，本研究通過(guò)Nrf-2/HO-1信號(hào)通路探索藏紅花醛抗氧化作用的分子機(jī)制，為抗氧化途徑治療SRLI提供理論基礎(chǔ)。

本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)既往文獻(xiàn)［20-23］明確藏花醛對(duì)肝損傷保護(hù)作用的使用技術(shù)方法：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，藏紅花醛的有效劑量為20～200 mg/kg，經(jīng)腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑給藥，因此本研究選擇藏紅花醛60 mg/kg 作為治療組，并通過(guò)腹膜內(nèi)途徑給藥。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，濃度范圍為1～800 μmol/L 的藏紅花醛對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，因此本研究實(shí)驗(yàn)濃度定為100 μmol/L。

本研究建立藏紅花醛預(yù)處理的SRLI 小鼠模型，結(jié)果顯示，藏紅花醛預(yù)處理后小鼠血清AST、ALT 水平降低，小鼠肝組織病理學(xué)損傷減輕，提示藏紅花醛可有效減輕肝損傷，對(duì)小鼠肝功能有一定的保護(hù)作用，與既往相關(guān)研究［20，24-25］結(jié)論一致。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 處理后肝組織蛋白中Nrf-2/HO-1 表達(dá)量明顯增加，肝組織中細(xì)胞凋亡加重，免疫組化結(jié)果一致。LPS處理后ROS產(chǎn)生量明顯增加，提示ROS參與氧化應(yīng)激過(guò)程。脂肪氧化可產(chǎn)生過(guò)量的ROS，ROS 與細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA 氧化損傷。氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡是序貫發(fā)生的，與本研究TUNEL 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M中觀察到的結(jié)果一致。氧化應(yīng)激性疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，當(dāng)ROS的異常產(chǎn)生強(qiáng)于細(xì)胞和組織的抗氧化防御系統(tǒng)時(shí)，即發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)受損，過(guò)量的ROS 可導(dǎo)致細(xì)胞損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞凋亡。目前已知Nrf2-ARE（抗氧化反應(yīng)元件）是十分重要的抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路之一，該通路在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)防過(guò)程中發(fā)揮重要作用［26］。Nrf2 能夠在ROS 刺激下轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，并與ARE相互作用，啟動(dòng)下游抗氧化保護(hù)性基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括HO-1，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用［27］。HO-1是機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激過(guò)程中重要的成員之一。完整的Nrf2/HO-1 信號(hào)通路是其發(fā)揮抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡等多種效應(yīng)的基礎(chǔ)，最終對(duì)疾病的轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生重大影響［28］。藏紅花醛具有明確的抗氧化作用，其對(duì)Nrf-2/HO-1 通路的影響亟需深入研究。本研究顯示，藏紅花醛處理后肝組織蛋白中Nrf-2/HO-1 表達(dá)量明顯增加，L02 細(xì)胞中ROS 產(chǎn)生量明顯減少。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，藏紅花醛處理后細(xì)胞凋亡減輕。筆者團(tuán)隊(duì)推測(cè)，藏紅花醛處理后，肝組織中Nrf-2/HO-1 的表達(dá)量升高與ROS 的減少存在一定聯(lián)系。現(xiàn)有研究［29-32］表明，藏紅花醛在骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸癌、缺血心肌疾病、哮喘、精神分裂癥等疾病中表現(xiàn)出治療作用，主要機(jī)制為減少ROS產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花醛處理后再使用LPS 刺激能夠使Nrf2/HO-1 信號(hào)通路被激活，蛋白表達(dá)量增加，Nrf2/HO-1 發(fā)揮抗氧化作用，對(duì)ROS 的清除作用增強(qiáng)，從而減少ROS對(duì)細(xì)胞的凋亡作用，與本研究治療組中觀察到的結(jié)果一致。

綜上所述，經(jīng)藏紅花醛預(yù)處理后，當(dāng)機(jī)體遭遇氧化應(yīng)激因素時(shí)，Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的激活可以提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑水平，減少肝細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生，從而抑制LPS 誘導(dǎo)的SRLI 中的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。因此，藏紅花醛有望成為預(yù)防急性肝損傷的潛在藥物。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021 年11 月19 日經(jīng)由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：20211119-047，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳意負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；陳意、陳羿帆參與動(dòng)物造模及實(shí)驗(yàn)；李童希、白俊杰、杜毅超、譚鵬負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；付文廣負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。