基于雙樣本孟德爾隨機(jī)化的特應(yīng)性皮炎與圓錐角膜因果關(guān)系研究

魏熙翔 楊暉 尹雪 傅征 熊薇薇

作者單位：廈門市兒童醫(yī)院 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院廈門醫(yī)院眼科，廈門 361000

圓錐角膜（Keratoconus，KC）是一種非炎癥性角膜營(yíng)養(yǎng)不良癥，其特征為進(jìn)行性角膜變薄和擴(kuò)張，導(dǎo)致視力損失。KC通常呈雙側(cè)發(fā)病，并主要影響年輕人[1]。盡管其具體原因尚不完全清楚，但遺傳、環(huán)境因素以及過敏性疾病可能在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用[2]。過敏性疾病廣泛影響著發(fā)達(dá)國(guó)家多達(dá)三分之一的人口，包括皮膚（如特應(yīng)性皮炎）、呼吸道（如哮喘、變應(yīng)性鼻炎）和眼睛（如變應(yīng)性結(jié)膜炎），而研究發(fā)現(xiàn)很多KC患者也患有特應(yīng)性皮炎[3-4]。

特應(yīng)性皮炎是一種慢性炎癥性皮膚病，通常與異常免疫系統(tǒng)反應(yīng)和遺傳因素相關(guān)。其癥狀包括皮膚干燥、瘙癢等，常見于嬰兒和兒童，但也可能持續(xù)至成年期[5-6]。盡管特應(yīng)性皮炎和KC是2種不同的疾病，但眾多研究表明它們之間可能存在某種關(guān)聯(lián)。在一般人群中，KC的患病率約為1/2 000[7]。而對(duì)于特應(yīng)性皮炎患者，K C 的患病率可達(dá)0.5%～39%[8]。然而，由于觀察研究中存在偏倚和混雜因素，二者的因果效應(yīng)仍不明確。明確特應(yīng)性皮炎與KC之間的因果效應(yīng)能有效提高KC的初級(jí)預(yù)防策略。作為一種遺傳流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，孟德爾隨機(jī)化（Mendelian randomization，MR）研究利用遺傳變異作為工具變量（Instrumental variables，IVs），可以有效減少偏倚和混雜對(duì)結(jié)果的影響，從而提高因果推斷的準(zhǔn)確性[9]。

本研究旨在運(yùn)用MR研究方法，探索特應(yīng)性皮炎對(duì)KC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的因果效應(yīng)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

本研究中的特應(yīng)性皮炎和KC的全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-wide association study，GWAS）數(shù)據(jù)來源于FinnGen數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.finngen.fi/fi）。診斷標(biāo)準(zhǔn)基于個(gè)體的自述病史以及國(guó)際疾病分類第9 版和第10 版。在進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析時(shí)，已進(jìn)行年齡、性別和前10 個(gè)基因主成分的校正。特應(yīng)性皮炎患者樣本為7 024例，對(duì)照組為198 740 例，數(shù)據(jù)集為“finn-b-L12_ATOPIC”，對(duì)照組人群與樣本人群具有相似的基線特征（如人種、年齡、生活環(huán)境），但無(wú)特應(yīng)性皮炎；KC患者樣本為311例，對(duì)照組為209 287例，數(shù)據(jù)集為“finn-b-H7_CORNEALDEFORM”，對(duì)照組人群與樣本人群具有相似的基線特征（如人種、年齡、生活環(huán)境），但無(wú)KC。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.2.1 工具變量選擇 利用R軟件從GWAS數(shù)據(jù)中篩選與特應(yīng)性皮炎和KC相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）作為工具變量。主要篩選條件：①P<5×10-8，如果該條件下的工具變量數(shù)目<5個(gè)，則條件放寬為P<5×10-6；②移除連鎖不平衡（r2=0.001，kb=10 000）[10-11]；③使用F統(tǒng)計(jì)量來排除較弱的工具變量，當(dāng)F<10時(shí)，表明該工具變量可能受到較弱工具變量的偏倚影響[10]，因此將其剔除以避免對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.2.2 MR方法選擇 本研究采用逆方差加權(quán)法（Inverse variance weighted，IVW）作為主要分析方法，使用隨機(jī)效應(yīng)模型。該方法假設(shè)所有遺傳變異位點(diǎn)的因果效應(yīng)估計(jì)值相等且無(wú)水平異質(zhì)性，并通過回歸分析獲得每個(gè)位點(diǎn)與表型之間的關(guān)聯(lián)效應(yīng)估計(jì)值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。此外，還采用加權(quán)中位數(shù)法和MR Egger法對(duì)上述結(jié)論進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2.3 敏感性分析 首先，使用IVW法的CochranQ檢驗(yàn)評(píng)估各個(gè)SNP之間的異質(zhì)性，若P<0.05，表明結(jié)果存在異質(zhì)性。其次，采用孟德爾隨機(jī)多態(tài)性殘差和離群值（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier，MR PRESSO）法檢測(cè)SNP異常值，設(shè)置迭代次數(shù)為5 000，若P<0.01，表明存在離群值，需將其剔除并重新進(jìn)行分析。第三，使用MR Egger截距進(jìn)行水平多效性檢驗(yàn)（MR Egger intercept test），若不存在水平多效性，截距應(yīng)為0，并且P>0.05。第四，采用“留一法”進(jìn)行檢驗(yàn)，通過每次排除單個(gè)SNP進(jìn)行分析，以確定是否存在異常的SNP。第五，構(gòu)建漏斗圖和森林圖對(duì)MR的水平多效性進(jìn)行可視化。當(dāng)P<0.05時(shí)，表示MR分析結(jié)果存在潛在的因果關(guān)系，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的統(tǒng)計(jì)分析均使用R軟件4.1.2版本中的“ Two Sample MR”包進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 特應(yīng)性皮炎與KC的MR分析

在排除存在連鎖不平衡的SNP后，本研究共選取了與特應(yīng)性皮炎相關(guān)的19個(gè)SNP作為工具變量，并確保這些工具變量不受弱工具變量的影響（F均>10）。經(jīng)過將特應(yīng)性皮炎數(shù)據(jù)與KC數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，最終納入了19個(gè)SNP作為工具變量（表1）。IVW的分析結(jié)果顯示，特應(yīng)性皮炎與KC之間存在顯著的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)[OR=1.46，95%可信區(qū)間（Confidence interval，CI）：1.08～1.97，P=0.013]。加權(quán)中位數(shù)法（OR=1.27，95%CI：0.82～1.96，P=0.275）和MR Egger法（OR=1.13 ，95%CI：0.53～2.40，P=0.753）未能檢測(cè)到特應(yīng)性皮炎與KC之間的顯著因果關(guān)系。敏感性分析表明，特應(yīng)性皮炎與KC之間的SNP沒有顯著的異質(zhì)性（CochranQ檢驗(yàn)，Q=16.25，P=0.575）；MR PRESSO的結(jié)果顯示未檢測(cè)到異常的SNP（P>0.05）。散點(diǎn)圖結(jié)果表明，與特應(yīng)性皮炎和KC密切相關(guān)的SNP具有穩(wěn)定性。盡管加權(quán)中位數(shù)法和MR Egger法未能檢測(cè)到特應(yīng)性皮炎與KC之間的顯著因果關(guān)系，但2種方法的結(jié)果與IVW的方向一致，且OR均>1，結(jié)合IVW的分析結(jié)果，表明特應(yīng)性皮炎可增加KC的風(fēng)險(xiǎn)（圖1）。漏斗圖結(jié)果顯示SNP呈對(duì)稱分布，MR分析未顯示多效性（圖2）。MR Egger截距測(cè)試結(jié)果顯示MR分析未呈現(xiàn)水平多效性（截距值為0.045，P=0.478）。通過“留一法”敏感性分析，未發(fā)現(xiàn)單個(gè)SNP對(duì)整體結(jié)果產(chǎn)生較大影響（圖3）。

表1.與特應(yīng)性皮炎有關(guān)的SNP信息Table 1.The SNP information associated with atopic dermatitis

圖1.特應(yīng)性皮炎與圓錐角膜因果關(guān)系的散點(diǎn)圖Figure 1.Scatter plot illustrating the causal relationship between atopic dermatitis and keratoconus SNP, single nucleotide polymorphism; MR, Mendelian randomization.

圖2.特應(yīng)性皮炎對(duì)圓錐角膜因果影響的漏斗圖Figure 2.Funnel plot depicting the causal impact of atopic dermatitis on keratoconus βIV, the effect size of the allele; 1/SEIV, the standard error of the effect size of the allele; MR, Mendelian randomization.

圖3.特應(yīng)性皮炎對(duì)圓錐角膜因果影響的“留一法”敏感性分析結(jié)果Figure 3.Sensitivity analysis results of the causal impact of atopic dermatitis on keratoconus using the "leave-one-out" approach The black dots represented the causal effect estimate when excluding the SNP and using the remaining SNPs as instrumental variables; the horizontal black lines represented the 95% confidence intervals of the causal estimate.SNP, single nucleotide polymorphism; MR, Mendelian randomization; AD,atopic dermatitis; KC, keratoconus.

2.2 KC與特應(yīng)性皮炎的MR分析

在排除存在連鎖不平衡的SNP后，本研究共選取了與KC相關(guān)的8 個(gè)SNP作為工具變量，并確保這些工具變量不受弱工具變量的影響（均F>10）。經(jīng)過將特應(yīng)性皮炎數(shù)據(jù)與KC數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，最終納入了8 個(gè)SNP作為工具變量（表2）。IVW的分析結(jié)果顯示，KC與特應(yīng)性皮炎之間不存在顯著的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)（OR=0.98，95%CI：0.94～1.01，P=0.294）。加權(quán)中位數(shù)法（OR=0.97，95%CI：0.93～1.00，P=0.134）和MR Egger法（OR=0.97，95%CI：0.91～1.02，P=0.359）未能檢測(cè)到KC與特應(yīng)性皮炎之間的顯著因果關(guān)系。敏感性分析表明，圓錐角膜與特應(yīng)性皮炎之間的SNP不存在顯著的異質(zhì)性（CochranQ檢驗(yàn)，Q=10.98，P=0.146）；MR PRESSO的結(jié)果顯示未檢測(cè)到異常的SNP（P>0.05）。散點(diǎn)圖結(jié)果表明，與KC和特應(yīng)性皮炎密切相關(guān)的SNP具有穩(wěn)定性（圖4）。漏斗圖結(jié)果顯示SNP呈對(duì)稱分布，MR分析未顯示多效性（圖5）。MR Egger截距測(cè)試結(jié)果顯示MR分析未呈現(xiàn)水平多效性（截距值為0.009，P=0.661）。通過“留一法”敏感性分析，未發(fā)現(xiàn)單個(gè)SNP對(duì)整體結(jié)果產(chǎn)生較大影響（圖6）。

表2.與圓錐角膜有關(guān)的SNP信息Table 2.The SNP information associated with keratoconus

圖4.圓錐角膜與特應(yīng)性皮炎因果關(guān)系的散點(diǎn)圖Figure 4.Scatter plot illustrating the causal relationship between keratoconus and atopic dermatitis SNP, single nucleotide polymorphism; MR, Mendelian randomization.

圖5.圓錐角膜對(duì)特應(yīng)性皮炎因果影響的漏斗圖Figure 5.Funnel plot depicting the causal impact of keratoconus on atopic dermatitis βIV, the effect size of the allele; 1/SEIV, the standard error of the effect size of the allele; MR, Mendelian randomization.

3 討論

既往的觀察性研究表明，KC與特應(yīng)性皮炎存在一定的關(guān)聯(lián)。1977年發(fā)表在《英國(guó)眼科雜志》上的一篇文章指出，在KC患者中，約有35%表現(xiàn)出特應(yīng)性傾向（包括花粉熱、哮喘和濕疹），而在健康對(duì)照組中，僅有12%表現(xiàn)出這種傾向（P<0.001）[12]。40 年后，Thyssen等[13]對(duì)超過18 歲的丹麥人進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)重度過敏性皮炎患者患KC的風(fēng)險(xiǎn)比為10.01（95%CI：5.02～19.96）。最近的研究也發(fā)現(xiàn)，在特應(yīng)性皮炎嚴(yán)重性評(píng)分（SCORAD指數(shù)）較低的患者中，未觀察到KC的出現(xiàn)[14-15]。因此，可以推測(cè)KC可能發(fā)生在特應(yīng)性反應(yīng)的較晚階段。

迄今為止，關(guān)于KC與特應(yīng)性皮炎之間的因果關(guān)系仍不明確。本研究采用MR方法較準(zhǔn)確地證明了特應(yīng)性皮炎能增加KC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但是，并不能證明KC能增加患特應(yīng)性皮炎的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究從遺傳的角度證實(shí)特應(yīng)性皮炎是KC的風(fēng)險(xiǎn)因素。盡管尚不清楚特應(yīng)性皮炎如何發(fā)揮這種作用，但過去的研究提出了幾種潛在機(jī)制。首先是揉眼。據(jù)推測(cè)，KC在特應(yīng)性皮炎中的發(fā)病率較高，可能與眼部瘙癢等不適引起的機(jī)械性揉眼有關(guān)[3]。已有研究證明眼部擦揉與KC之間存在聯(lián)系[16]。還有研究提出，眼睛摩擦導(dǎo)致KC的原因包括角膜受熱、炎癥介質(zhì)在淚液中的釋放、酶活性增加、眼壓的升高、角膜細(xì)胞變化以及角膜剪切強(qiáng)度降低或臨時(shí)位移[17]。其次，炎癥和免疫反應(yīng)也是特應(yīng)性皮炎導(dǎo)致KC發(fā)生的一種可能機(jī)制。特應(yīng)性皮炎和KC都涉及異常的炎癥和免疫反應(yīng)。特應(yīng)性皮炎是一種慢性炎癥性皮膚病，與免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)的異常激活有關(guān)。KC的發(fā)展過程涉及角膜層的炎癥和細(xì)胞變化，這可能與特應(yīng)性皮炎引起的全身性炎癥反應(yīng)有關(guān)[18]。此外，遺傳因素也可能起到一定的作用。研究表明，特應(yīng)性皮炎和KC可能共享一些遺傳變異，包括與細(xì)胞骨架、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞黏附相關(guān)的基因[19]。

本研究首次采用MR方法來探索特應(yīng)性皮炎與KC之間的因果關(guān)系。盡管之前已經(jīng)有許多觀察性研究關(guān)注這一關(guān)系，但這些研究可能存在倫理問題，并且即使在調(diào)整了相關(guān)變量的情況下，仍可能存在未知變量引起的偏倚。而通過采用MR方法可以最大限度地減少觀察性研究的局限性。

本研究也存在一些局限性。首先，由于研究數(shù)據(jù)都來自歐洲血統(tǒng)的人群，因此研究結(jié)果不能代表真正隨機(jī)的人口樣本，也不適用于其他種族。其次，盡管本研究已進(jìn)行了各種敏感性分析來驗(yàn)證MR研究的假設(shè)，但仍難以完全排除工具變量的水平多效性。最后，目前的GWAS數(shù)據(jù)樣本量仍不夠充足，如本研究所用的KC GWAS數(shù)據(jù)只包含311個(gè)病例，樣本數(shù)量偏少，未來需要使用更多的GWAS數(shù)據(jù)進(jìn)行更深入的研究。

本研究使用雙向MR方法，研究結(jié)果表明特應(yīng)性皮炎與KC的風(fēng)險(xiǎn)增加存在顯著的因果關(guān)系。相反，沒有證據(jù)支持KC會(huì)增加或減少特應(yīng)性皮炎的風(fēng)險(xiǎn)。本研究認(rèn)為特應(yīng)性皮炎是KC的易感因素，通過潛在的病理生理機(jī)制促進(jìn)了KC的早期發(fā)病。因此，我們強(qiáng)調(diào)早期宣教的重要性，并提出了2項(xiàng)合理的建議：一是增加特應(yīng)性皮炎患者進(jìn)行角膜厚度及角膜地形圖等檢查的頻率，有利于更早發(fā)現(xiàn)KC；二是考慮更早的干預(yù)措施，以防止KC的進(jìn)一步發(fā)展。

利益沖突申明 本研究無(wú)任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 魏熙翔：收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計(jì)及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。楊暉：參與選題、設(shè)計(jì)、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行核修。尹雪：參與選題、設(shè)計(jì)和修改論文的結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行核修。傅征、熊薇薇：參與選題，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行核修