鈣網(wǎng)蛋白通過調節(jié)線粒體功能和線粒體合酶促進胃癌細胞轉移*

李寧， 張美航， 孟愛國， 王沂， 劉海穎， 王彤

（1華北理工大學附屬醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 063000；2華北理工大學人事處，河北 唐山 063000；3華北理工大學研究生學院，河北 唐山 063000）

胃癌是我國較為常見的惡性上消化道腫瘤之一，我國新發(fā)和死亡胃癌患者人數(shù)眾多，隨著早期手術和靶向治療，胃癌5年存活率顯著提高，但其死亡率仍位于全球腫瘤統(tǒng)計的前五位，轉移和復發(fā)仍然是臨床面臨的關鍵問題［1-2］，因此尋找調控胃癌轉移的關鍵因子是實現(xiàn)胃癌靶向治療，提高生存率的關鍵。

鈣離子是細胞內多功能信號分子，參與多種腫瘤的發(fā)生［3］。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin， CALR）是一種存在于內質網(wǎng)中的鈣結合蛋白，參與鈣離子穩(wěn)態(tài)、免疫反應、細胞黏附和遷移、基因表達調控、細胞凋亡等多種細胞生物學過程［4-5］。Ye等［6］的研究顯示，CALR在膽囊癌組織中表達升高，與膽囊癌細胞增殖、凋亡以及化療耐藥有關。Han等［7］的研究報道，敲減鈣網(wǎng)蛋白會導致細胞內游離Ca2+水平失衡，并泄漏到線粒體中，從而激活腫瘤細胞死亡機制。雖然已經有研究報道了CALR在腫瘤進展中的作用，但是其在胃癌轉移過程中的作用機制并不清楚。本研究擬通過胃癌AGS和HGC-27細胞和裸鼠腹腔種植轉移模型，探討CALR在胃癌轉移中的作用及機制，為胃癌細胞靶向治療提供參考資料。

材料和方法

1 實驗對象

收集2019年1月~2021年1月華北理工大學附屬醫(yī)院病理科胃癌根治術患者胃癌組織及相應的癌旁組織標本各65例，以及16例大網(wǎng)膜轉移組織樣本作為研究對象?；颊咝g前均未接受其他治療，本研究患者已簽署知情同意書，并通過華北理工大學醫(yī)學倫理委員會批準。本實驗所用胃癌AGS和HGC-27細胞系購自國家模式與特色實驗細胞資源庫。SPF級雄性BALB/c裸鼠10只，4~5周齡，18~22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2021-0006，飼養(yǎng)于華北理工大學動物中心。

2 主要試劑

F-12K培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自Gibco；CALRsiRNA和CALR過表達質粒（pcDNA3.1-CALR）均由上海生工生物工程股份有限公司合成；CALR抗體、肌漿/內質網(wǎng)Ca2+轉運ATP酶A2（ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+transporting 2，ATP2A2）抗體、ATP酶Na+/K+轉運亞基beta 3（ATPase Na+/K+transporting subunit beta 3，ATP1B3）抗體、ATP合酶-偶聯(lián)因子6（ATP synthase-coupling factor 6，ATP5J）抗體和β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自Proteintech；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、pCMV-Mito-AT1.03（線粒體ATP熒光探針）檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、LipofectamineTM8000轉染試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；4%多聚甲醛溶液、0.1%結晶紫染液均購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室購自Corning。

3 主要方法

3.1 細胞培養(yǎng)與實驗分組 用含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的F-12K基礎培養(yǎng)液和RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2條件下分別對AGS和HGC-27細胞株進行培養(yǎng)，每2~3天傳代1次。按照實驗設計將細胞分為siRNA-NC組（轉染siRNA無義序列）、siRNA-CALR組（轉染CALRsiRNA序列）、pcDNA3.1-NC組（轉染pcDNA3.1空白質粒）和pcDNA3.1-CALR組（轉染CALR過表達質粒），每組實驗重復3次。其中CALRsiRNA（hCALR-446）上游序列為5′-GCACGGAGACUCAGAAUACAATT-3′，下游序列為5′-UUGUAUUCUGAGUCUCCGUGCTT-3′；siRNA無義序列上游序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游序列為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。構建CALR過表達質粒（NM_004343.4），克隆位點為Hind III和XhoI，載體為pcDNA3.1（+）ZB02427。取處于對數(shù)生長期的細胞，接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，細胞融合度達到70%~80%時，嚴格按照LipofectamineTM8000轉染試劑說明書操作進行轉染，轉染6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

3.2 免疫組織化學檢測 將組織樣本用甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片機連續(xù)組織切片，置于載玻片上67 ℃烘烤15 min；按照免疫組化二步法試劑盒說明書和參考文獻［6］步驟進行操作，用二甲苯脫蠟，經梯度乙醇處理，蒸餾水浸泡，抗原修復，滴加Ⅰ抗CALR（1∶100），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline， PBS）清洗3次，滴加Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine， DAB）顯色，蘇木素復染，返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對CALR蛋白表達水平進行定量分析，實驗重復3次。

3.3 Transwell實驗檢測 取各組對數(shù)生長期的細胞，無血清培養(yǎng)液重懸至1×105/mL，Transwell小室上室中加入200 μL細胞懸液，下室內加入600 μL含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，放入24孔板中培養(yǎng)24 h后采用4%多聚甲醛溶液固定20 min，0.1%結晶紫染色20 min，將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下隨機取中央及四周5個視野進行觀察、拍照并計數(shù)，實驗重復3次［8］。

3.4 細胞劃痕實驗檢測 取各組對數(shù)生長期的細胞加入6孔板中，每孔約5×105個細胞，培養(yǎng)24 h后用200 μL吸頭垂直劃橫線，PBS清洗3次，加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，200倍顯微鏡下觀察并拍照，細胞遷移率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%，實驗重復3次［9］。

3.5 細胞內ROS檢測 嚴格按照ROS檢測試劑盒說明書操作，取各組細胞接種于6孔板中，無血清培養(yǎng)液清洗2次，將稀釋好的2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorofluorescin diacetate， DCFH-DA）工作液加入到各組細胞中，37℃孵育20 min，無血清培養(yǎng)液清洗3次，熒光顯微鏡下觀察、拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對各組細胞ROS熒光強度進行定量分析，實驗重復3次。

3.6 線粒體ATP熒光探針檢測 嚴格按照pCMVMito-AT1.03（線粒體ATP熒光探針）檢測試劑盒說明書操作，取各組細胞接種于6孔板中，細胞的融合度達到70%~80%時，按照LipofectamineTM8000轉染試劑說明書操作，將pCMV-Mito-AT1.03質粒轉染到細胞中，48 h后熒光顯微鏡下觀察、拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對各組細胞ATP熒光強度進行定量分析，實驗重復3次。

3.7 JC-1線粒體膜電位檢測 參照線粒體膜電位檢測試劑盒說明書進行操作，取各組處理后的細胞接種于6孔板中，加入1 mL細胞培養(yǎng)液，向各組細胞中加入0.5 mL JC-1染色工作液，混勻后放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min，吸除上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌2次。加入1 mL細胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對各組細胞線粒體膜電位水平進行定量分析，實驗重復3次。

3.8 細胞Western blot法檢測 取各組處于對數(shù)生長期的細胞，PBS清洗2次，加入500 μL細胞裂解液，轉移至離心管中，16 102×g離心20 min后取上清，BCA法測定總蛋白濃度，100 ℃沸水浴5 min 使蛋白變性，上樣、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）、轉膜，0.5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ⅰ抗CALR（1∶1 000）、ATP2A2（1∶1 000）、ATP1B3（1∶1 000）和ATP5J（1：1 000），4 ℃孵育過夜，次日復溫后加入Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，滴加增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence， ECL）液暗室曝光顯影，以β-actin為內參照，采用ImageJ圖像分析軟件測定各條帶灰度值，實驗重復3次［10］。

3.9 胃癌裸鼠腹腔移植瘤模型 將裸鼠隨機分為2組，每組5只，取生長狀態(tài)良好的預培養(yǎng)HGC-27細胞懸液（2×106個細胞），對照組為轉染siRNA無義序列的HGC-27細胞，實驗組為轉染CALRsiRNA序列的HGC-27細胞，胰蛋白酶消化，離心，取細胞懸液注入裸鼠腹腔，兩組裸鼠均飼養(yǎng)在相同的SPF環(huán)境和營養(yǎng)條件下，21 d后處死裸鼠，剝離腫瘤，按公式（長×寬2/2）計算腫瘤體積［11］。

3.10 組織Western blot法檢測 取裸鼠胃癌種植瘤組織，勻漿后加入200 μL組織裂解液，16 102×g離心20 min后取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。100 ℃沸水浴 5 min使蛋白變性后存儲，其余操作同3.8，實驗重復3次［10］。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗；多組樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 胃癌組織、大網(wǎng)膜轉移組織和癌旁組織中CALR蛋白表達水平

免疫組化結果顯示，與癌旁組織比較，胃癌組織和大網(wǎng)膜轉移組織中CALR蛋白表達水平顯著增高（P<0.05），見圖1。

2 CALR表達與胃癌患者臨床病理特征的關系

CALR陽性表達與胃癌患者的性別和年齡無關（P>0.05），而與浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移、大網(wǎng)膜轉移及存活狀態(tài)有關（P<0.05），見表1。

表1 CALR表達與胃癌患者臨床病理特征的關系Table 1. Relationship between CALR expression and clinical pathological features in gastric cancer patients

3 CALR對AGS和HGC-27細胞侵襲的影響

siRNA-CALR組AGS和HGC-27侵襲細胞數(shù)量較siRNA-NC組顯著減少（P<0.05），pcDNA3.1-CALR組AGS和HGC-27侵襲細胞數(shù)量較pcDNA3.1-NC組顯著增加（P<0.05），見圖2。

Figure 2. Effect of CALR on invasion ability in AGS and HGC-27 cells （scale bar=50 μm） was detected by Transwell assay. Knockdown of CALR expression significantly inhibited the invasion of AGS and HGC-27 cells， whereas overexpression of CALR significantly promoted the invasion of AGS and HGC-27 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs siRNA-NC group； #P<0.05 vs pcDNA3.1-NC group.圖2 CALR對AGS和HGC-27細胞侵襲的影響

4 CALR對AGS和HGC-27細胞遷移的影響

siRNA-CALR組AGS和HGC-27細胞遷移率較siRNA-NC組顯著降低（P<0.05），而pcDNA3.1-CALR組AGS和HGC-27細胞遷移率較pcDNA3.1-NC組顯著升高（P<0.05），見圖3。

Figure 3. Effect of CALR on migration ability in AGS and HGC-27 cells （scale bar=200 μm） was detected by the cell scratch test.Knockdown of CALR expression significantly inhibited the migration of AGS and HGC-27 cells， whereas overexpression of CALR significantly promoted the migration of AGS and HGC-27 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs siRNA-NC group； #P<0.05 vs pcDNA3.1-NC group.圖3 CALR對AGS和HGC-27細胞遷移的影響

5 CALR對AGS和HGC-27細胞ROS水平的影響

pcDNA3.1-CALR組AGS和HGC-27細胞ROS熒光強度較pcDNA3.1-NC組顯著降低（P<0.05），而siRNA-CALR組AGS和HGC-27細胞ROS熒光強度較siRNA-NC組顯著升高（P<0.05），見圖4。

Figure 4. Effect of CALR on ROS fluorescence intensity in AGS and HGC-27 cells （scale bar=20 μm） was detected using an ROS detection kit. The ROS fluorescence intensity of AGS and HGC-27 cells was significantly increased after CALR siRNA interference， whereas the ROS fluorescence intensity of AGS and HGC-27 cells was significantly decreased after CALR overexpression. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs siRNA-NC group； #P<0.05 vs pcDNA3.1-NC group.圖4 CALR對AGS和HGC-27細胞ROS熒光強度的影響

6 CALR對AGS和HGC-27細胞ATP水平的影響

與siRNA-NC組比較，siRNA-CALR組AGS和HGC-27細胞ATP水平顯著降低（P<0.05），與pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-CALR組AGS和HGC-27細胞ATP水平顯著升高（P<0.05），見圖5。

Figure 5. Effect of CALR on mitochondrial ATP fluorescence intensity in AGS and HGC-27 cells （scale bar=20 μm） was detected by mitochondrial ATP fluorescent probe. The mitochondrial ATP fluorescence intensity of AGS and HGC-27 cells was significantly decreased after CALR siRNA interference， whereas the ATP fluorescence intensity of AGS and HGC-27 cells was significantly increased after CALR overexpression. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs siRNA-NC group； #P<0.05 vs pcDNA3.1-NC group.圖5 CALR對AGS和HGC-27細胞線粒體ATP熒光強度的影響

7 CALR對AGS和HGC-27細胞線粒體膜電位水平的影響

siRNA-CALR組AGS和HGC-27細胞線粒體膜電位水平較siRNA-NC組顯著降低（P<0.05），而pcDNA3.1-CALR組AGS和HGC-27細胞線粒體膜電位水平較pcDNA3.1-NC組顯著升高（P<0.05），見圖6。

Figure 6. Effect of CALR on the mitochondrial membrane potential in AGS and HGC-27 cells（scale bar=20 μm） were detected by JC-1 Kit. The mitochondrial membrane potential level of the siRNA-CALR group was significantly decreased， while the mitochondrial membrane potential level of the pcDNA3.1-CALR group was significantly increased. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs positive control group； *P<0.05 vs siRNA-NC group； #P<0.05 vs pcDNA3.1-NC group.圖6 CALR對AGS和HGC-27細胞線粒體膜電位水平的影響

8 CALR對AGS和HGC-27細胞ATP2A2、ATP1B3和ATP5J蛋白表達的影響

siRNA-CALR組AGS和HGC-27細胞中CALR、ATP2A2、ATP1B3和ATP5J蛋白表達水平較siRNANC組均顯著降低（P<0.05），而pcDNA3.1-CALR組AGS和HGC-27細胞中CALR、ATP2A2、ATP1B3和ATP5J蛋白表達水平較pcDNA3.1-NC組均顯著升高（P<0.05），見圖7。

9 CALR對胃癌裸鼠腹腔移植瘤體積的影響

與siRNA-NC組比較，siRNA-CALR組胃癌裸鼠腹腔移植瘤體積顯著減?。≒<0.05），見圖8。

Figure 8. Effect of CALR on the tumor volume of transplanted tumors in nude mice with gastric cancer. A： nude mouse model of gastric cancer HGC-27 cell transplantation tumor （red arrows indicate the location of the transplanted tumor）； B： the volume of HGC-27 cell transplantation tumors. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs siRNA-NC group.圖8 CALR對胃癌裸鼠移植瘤體積的影響

10 CALR對胃癌裸鼠腹腔移植瘤組織中ATP2A2、ATP1B3和ATP5J蛋白表達的影響

與siRNA-NC組比較，siRNA-CALR組胃癌裸鼠腹腔移植瘤組織中CALR、ATP2A2、ATP1B3和ATP5J蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），見圖9。

Figure 9. The protein expression of CALR， ATP2A2， ATP1B3 and ATP5J in nude mice with gastric cancer. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs siRNA-NC group.圖9 CALR對胃癌裸鼠移植瘤組織中ATP2A2、ATP1B3和ATP5J蛋白表達的影響

討論

胃癌細胞轉移是導致胃癌患者復發(fā)率高、生存率低的主要原因，盡管針對胃癌的靶向藥物研發(fā)取得了顯著的成果，但胃癌的預后效果并不理想。近年來，內質網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)信號在癌癥發(fā)展中的作用逐漸被證實，鈣離子穩(wěn)態(tài)調節(jié)異?？纱碳ぜ毎惓Ｔ鲋?，最終導致腫瘤的發(fā)生［12-13］。研究證明，CALR參與多種腫瘤的發(fā)生和轉移機制，在乳腺癌中，CALR高表達可顯著促進乳腺癌細胞的侵襲和遷移［14］。在肺癌中，CALR高表達可顯著促進A549 細胞的增殖和裸鼠移植瘤的生長速度［15］。本研究結果也顯示，CALR在胃癌組織和大網(wǎng)膜轉移組織中高表達，可顯著促進兩種不同分化程度胃癌細胞的侵襲和遷移，與胃癌患者TNM分期和生存期有關，此外，動物實驗還顯示，抑制CALR表達可顯著抑制胃癌裸鼠移植瘤的體積和生長速度，這些研究說明，CALR在胃癌轉移中的關鍵作用，提示CALR可能是胃癌細胞轉移潛在的治療靶點。

線粒體作為細胞能量代謝的調控中心，通過調控ROS的產生和細胞能量代謝來維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。線粒體功能障礙可以通過激活ROS途徑促進胃癌細胞的進展和順鉑耐藥，在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［16-18］。近期有研究表明，內質網(wǎng)和線粒體間存在脂質轉移途徑，揭示了內質網(wǎng)與線粒體功能的密切聯(lián)系［19］。Han等［7］的研究也證實，敲減CALR后內質網(wǎng)釋放的鈣離子被線粒體攝取，進而影響癌細胞的線粒體功能。本研究細胞實驗結果顯示，CALR過表達可促進胃癌細胞ATP產生，提高線粒體膜電位水平，抑制ROS生成，而干擾CALR表達可顯著抑制ATP產生，降低線粒體膜電位水平，促進ROS生成，提示，調節(jié)CALR表達可以影響線粒體功能，并且伴隨著胃癌細胞轉移能力的改變。我們推測CALR可能調節(jié)內質網(wǎng)-線粒體能量代謝的作用路徑，并且通過調節(jié)ROS影響胃癌細胞轉移，本研究雖然觀察了線粒體膜電位的變化，但是并沒有關注鈣離子水平的改變，未來我們將進一步展開研究。

ATP2A2、ATP1B3、ATP5J是ATP合酶相關蛋白，通過調控內質網(wǎng)對鈣離子攝取，參與ATP酶分子調節(jié)和線粒體能量傳導，進而影響線粒體功能［20-22］。本研究結果顯示，CALR可以調控ATP合酶相關蛋白ATP2A2、ATP1B3、ATP5J的表達，進而影響AGS、HGC-27細胞線粒體功能，尤其是在動物實驗中，敲減CALR可顯著抑制胃癌細胞腹腔種植瘤的生長，并顯著降低ATP2A2、ATP1B3、ATP5J的表達。我們從體內和體外實驗中，揭示了CALR在內質網(wǎng)-線粒體能量代謝路徑中的作用，表明CALR可能成為有效防治胃癌細胞轉移的靶點。

綜上所述，CALR在人胃癌組織和大網(wǎng)膜轉移組織中過表達，CALR可通過調節(jié)線粒體膜電位和ATP合酶相關蛋白（ATP2A2、ATP1B3和ATP5J）表達介導線粒體功能，進而影響胃癌細胞的轉移，敲減CALR可抑制胃癌細胞腹腔種植瘤的生長，本研究為靶向內質網(wǎng)-線粒體能量代謝路徑提供了新的依據(jù)。［1］Sung H， Ferlay J， Siegel RL， et al. Global cancer statistics 2020： globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）：209-249.