人工老化小?？Х确N子的紅外光譜鑒別

甘玉佳，歐全宏，鄭鈞文，周湘萍，劉 剛*，時有明

（1.云南師范大學物理與電子信息學院，云南 昆明 650500；2.曲靖師范學院物理與電子工程學院，云南 曲靖 655011）

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基本生產(chǎn)資料，種子活力是種子質(zhì)量的重要指標，高活力種子具有更大的生長潛能和優(yōu)勢［1］。種子老化是指種子活力自然衰退，隨貯藏時間的延長而發(fā)生的復(fù)雜生理生化變化［2］。種子老化很大程度上取決于種子貯藏的環(huán)境條件，貯藏條件惡劣將加速種子衰老和劣變［3］。傳統(tǒng)的種子老化檢測方法耗時較長、會對種子造成損傷、需要專業(yè)人員操作［4］，因此快速、無損、操作簡單的測定方法成為當前種子老化檢測發(fā)展的重要趨勢。紅外光譜技術(shù)在農(nóng)作物種子檢測中具有簡單、快速、靈敏、綠色、成本低及操作簡便等優(yōu)點［5］。劉杰等（2021）［6］利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對人工加速老化水稻種子進行檢測，可以快速、有效區(qū)分不同老化程度的水稻種子。Andrade G C 等（2020）［7］利用衰減全反射紅外光譜（ATR-FTIR）對2 個玉米雜交品種加速老化過程中生化變化進行識別，并建立評估活力的模型。Czekus B 等（2019）［8］通過傅里葉變換紅外光譜技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)研究2 個品種藜麥種子中的有機物差異。田雪等（2022）［9］利用FTIR 法結(jié)合曲線擬合和主成分分析對3 種小米及其9 個不同產(chǎn)區(qū)進行了鑒別和分類。Fioresi D B等（2021）［10］利用紅外光譜對阿拉比卡和羅布斯塔咖啡種子之間的差異進行了研究，證明了兩者的紅外光譜存在差異。

咖啡是世界上交易最廣泛的商品之一，特別是阿拉比卡咖啡豆（俗稱小?？Х龋┮蚱漤樆?、溫和且醇厚的風味受到消費者的喜愛，占全球咖啡種植面積的70%以上。云南省主要咖啡種植區(qū)域為保山市、普洱市、臨滄市、德宏傣族景頗族自治州等地。保山市隆陽區(qū)于1952年開始大規(guī)模種植小?？Х龋瑑?yōu)異的氣候條件、適宜的土壤環(huán)境及充足的日照，使該地產(chǎn)出的小粒咖啡豆品質(zhì)極佳，在國際上被稱為“中國云南小?？Х取?，是我國極少數(shù)被世界公認的農(nóng)特產(chǎn)品之一［11］。國內(nèi)咖啡市場普遍存在咖農(nóng)盲目種植的現(xiàn)象，嚴重削弱了咖啡產(chǎn)業(yè)的市場競爭力，阻礙了咖啡產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［12］?？Х确N子在常溫下最多能儲存2～6 個月，之后活力會迅速喪失，影響種子田間健植率和植株生產(chǎn)性能［13］。目前，國內(nèi)外對咖啡種子的研究更多是對商業(yè)咖啡品質(zhì)評價、咖啡中化學成分檢測和不同基因型、品種及產(chǎn)地鑒別等，很少有針對咖啡種子老化測定的研究。

本研究采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對不同老化程度的小粒咖啡種子進行檢測，獲得其紅外指紋圖譜，結(jié)合曲線擬合、主成分分析和系統(tǒng)聚類分析對不同老化程度的小粒咖啡種子進行分析，建立小粒咖啡種子快速、無損的老化檢測方法，對優(yōu)質(zhì)小粒咖啡的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種質(zhì)資源保護有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究試驗所用材料為小粒種咖啡（Coffea arabicaL.）種子，于2022年3月收獲，采自云南省保山市潞江鎮(zhèn)新寨村（25°03′N，109°34′E），平均海拔1 300 m。種子含水量約7%（用鹵素水分儀測得，儀器為廈門米德電子科技有限公司生產(chǎn)，型號：QL-100B），千粒重為172.62 g。

1.2 方法

1.2.1 人工加速老化

將咖啡果脫殼后，用水洗凈表面的膠質(zhì)體，自然晾曬4 d，挑選顆粒飽滿的種子進行處理。參照殷勤等（2016）［13］的方法，對咖啡種子進行人工加速老化，采用杭州綠博儀器有限公司生產(chǎn)的LH-150S種子老化箱，設(shè)置老化箱恒定溫度為40 ℃，相對濕度為98%。老化時間分別為0、2、4、6、8 d，老化完成后將種子在室溫下晾3～4 d，確認種子含水量降至原狀態(tài)后進行光譜檢測。

1.2.2 FTIR測量

將咖啡種子的羊皮紙殼剝掉，同時去除干凈生咖啡豆的銀皮，用研磨機研磨成粉末，并與適量KBr粉末混合均勻進行壓片，以純溴化鉀片為背景，采集咖啡樣品的紅外光譜。采用的紅外光譜儀是Perkins Elmer 公司Frontier 型傅里葉變換紅外光譜儀，配有氘代硫酸三甘肽晶體（DTGS）探測器。光譜采集范圍為4 000～400 cm-1，16 次掃描，分辨率為4 cm-1，以未老化種子為對照，測20 個樣品，其他老化時間的種子各測10 個樣品，3 次重復(fù)測量取平均值，光譜采集使用Spectrum 10.03 軟件。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用OMNIC 8.2 軟件對所得原始光譜進行預(yù)處理，包括基線校正、13 點平滑、縱坐標歸一化和導(dǎo)數(shù)譜圖等；用Origin 2018 軟件進行主成分分析（PCA）和峰值擬合分析，用SPSS 24 軟件進行系統(tǒng)聚類分析（HCA）。

建立PCA 模型時，采用1 750～1 500 cm-1范圍的紅外光譜數(shù)據(jù)，HCA 模型選取1 800～800 cm-1范圍的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 傅里葉變換紅外光譜分析

由圖1 可以看出，不同老化天數(shù)的咖啡種子的原始紅外光譜峰整體相似，種子在老化的過程中差異不大。

表1 列出了不同老化天數(shù)的咖啡種子的主要吸收峰及歸屬，可以看出，小?？Х燃t外光譜峰主要由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖峰組成。

表1 人工老化小粒咖啡的紅外譜峰位置及其歸屬

圖2 為人工老化小?？Х确N子的傅里葉變換紅外光譜峰強比。圖2（a）中所有特征峰強度比A2926/A3010、A2855/A3010、A1745/A3010、A1461/A3010、A1380/A3010的值整體隨著人工老化時間的增加顯示升高趨勢，分別由老化前的2.50、1.66、0.93、0.97、1.06 升高到老化8 d 后的3.36、2.04、1.38、1.52、1.66，說明小?？Х戎兄|(zhì)的相對含量可能隨著老化時間的增加而產(chǎn)生正相關(guān)變化。圖2（b）中A1118/A3010、A1055/A3010顯示出相同的變化趨勢，先增強后減弱然后明顯增強，分別由未老化時的1.16、1.25 升高到老化8 d 的2.46、2.88；A1646/A3010的特征峰強度隨著老化時間先降低后增強，由未老化時的1.57 逐漸降為老化6 d 的1.25，隨后老化8 d 升高到2.00，表明蛋白質(zhì)和多糖在老化的過程中也產(chǎn)生了變化。

圖2 人工老化小?？Х确N子的紅外光譜峰強比

2.2 二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜

圖3（a）、圖3（b）分別為人工老化小?？Х确N子在蛋白質(zhì)和脂肪（1 800～1 600 cm-1范圍）、多糖（1 200～950 cm-1范圍）特征區(qū)域的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜，在這2 個區(qū)域，人工老化小?？Х任辗鍞?shù)量隨老化天數(shù)增加而減少。其中1 800～1 700 cm-1區(qū)域的吸收峰主要由脂質(zhì)中C=O 伸縮振動引起，所有人工老化樣品在該區(qū)域均出現(xiàn)2 個特征峰，分別在1 745 cm-1和1 711 cm-1附近，其中1 745 cm-1為脂類物質(zhì)最典型的特征吸收峰。

1 700～1600 cm-1區(qū)域主要是蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶，受C=O 伸縮振動的影響。不同老化小?？Х确N子吸收峰位置在該區(qū)域出現(xiàn)了差異，老化2 d 和4 d的種子在1 696 cm-1附近出現(xiàn)了吸收峰，而只有老化8 d 的小?？Х确N子在1 642 cm-1附近的峰消失，說明該峰與蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶有關(guān)。其他共有的吸收峰出現(xiàn)在1 658、1 609 cm-1附近，1 700～1 660 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰包含β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 660～1 650 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰為α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 650～1 640 cm-1范圍內(nèi)吸收峰為無序結(jié)構(gòu)，1 640～1 600 cm-1范圍內(nèi)包含β-折疊結(jié)構(gòu)，以上結(jié)構(gòu)均屬于蛋白質(zhì)二階結(jié)構(gòu)。

1 200～950cm-1區(qū)域特征峰主要受歸屬為多糖和糖苷鍵C-O 基團、C-O-C 鍵的伸縮振動、C-H 鍵和C-OH 鍵的彎曲振動的影響［22］。該區(qū)域人工老化8 d的樣品差異明顯，老化0、2、4 d 的種子都在多糖區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)了1 182、1 159、1 119、1 098、1 079、1 055、1 030、991、959 cm-1附近的9 個峰，老化6 d 的種子缺少1 182 cm-1附近吸收峰，而老化8d 的種子只有1 163、1 114、1 083、1 038、991、958 cm-1這6 個峰。隨著老化時間的增加，除老化8 d 外，其他不同老化時間的小粒咖啡種子在1 159、1 098 cm-1附近的吸收峰向高波數(shù)位置移動，在1 119、1 030、991、959 cm-1附近的吸收峰向低波數(shù)位置移動，這些峰位置發(fā)生變化可能與多糖的結(jié)構(gòu)或含量變化有關(guān)。

2.3 曲線擬合分析

根據(jù)不同老化時間小?？Х确N子在該區(qū)域的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜確定出現(xiàn)的吸收峰位置和個數(shù)，對其原始紅外光譜1 770～1 500 cm-1范圍進行曲線擬合，經(jīng)基線校正后采取高斯分布進行分解，得到的擬合結(jié)果R2值均在0.999 以上，每個老化時間下的各種樣品光譜均進行了8 次擬合。擬合結(jié)果如圖4所示，計算出特征峰峰面積百分比的平均值，統(tǒng)計結(jié)果見表2 和圖5。

表2 人工老化小粒咖啡種子在1 770～1 500 cm-1范圍內(nèi)曲線擬合子峰的面積百分比

圖4 人工老化小?？Х确N子紅外光譜在1 770～1 500 cm-1范圍的曲線擬合光譜

圖5 為不同老化時間下小?？Х确N子脂質(zhì)特征峰（1 740 cm-1）、蛋白質(zhì)特征峰（1 648、1 586 cm-1）和咖啡因特征峰（1 608 cm-1）的峰面積百分比。結(jié)果顯示，老化0 d 的小?？Х确N子1 740 cm-1處特征峰的面積百分比為5.22%，老化2～6 d 逐漸增加到14.58%，老化8 d 又減少到6.95%。從圖5 中子峰面積百分比的變化可以看出，蛋白質(zhì)含量最高，1 648 cm-1處的特征峰峰面積百分比在老化0 d時為47.83%，老化6 d 后逐漸減小到28.38%，隨后急劇增加到56.48%。1 586 cm-1處的峰面積百分比在老化0 d 時為7.92%，老化6 d 后降低到1.21%，老化8 d 后增加到9.41%，2 個蛋白質(zhì)特征峰隨老化時間的峰面積變化趨勢一致，該趨勢與原始光譜中蛋白質(zhì)特征峰峰強比變化趨勢一致，而且蛋白質(zhì)含量最高，說明蛋白質(zhì)是小粒咖啡種子的重要組成成分。1 608 cm-1處峰面積百分比從老化0 d的6.75%增加到老化4 d 的18.69%，老化6～8 d減小到3.18%。

2.4 主成分分析

為了分析數(shù)據(jù)中隱含的結(jié)構(gòu)信息，了解不同老化時間對小?？Х确N子引起的差異，選用20 個未老化小粒咖啡種子和其他老化處理后各10 個樣本光譜，對不同老化程度的小?？Х确N子在1 750～1 500 cm-1區(qū)域的傅里葉變換紅外光譜進行主成分分析。

由圖6 可知，前2 個主成分累計貢獻率達99.3%，其中PC1 占總貢獻率的93.9%，PC2 占總貢獻率的5.4%，這代表了前2 個主成分可以有效區(qū)分不同老化程度的小?？Х确N子。根據(jù)圖中的分類情況可以看出，不同老化時間處理下的小?？Х确N子顯示出了清晰的聚類，每個時間的樣品都準確分為一類，老化8 d 的種子與未老化種子最接近，老化6 d的樣品與未老化樣品離得最遠。

圖7（a）、（b）分別為PC1 和PC2 的載荷圖。PC載荷圖表示不同變量的相關(guān)權(quán)重，顯示了一些對分類具有高度相關(guān)性和貢獻度的特征峰。在PC1 載荷圖中，1 750～1 500 cm-1范圍出現(xiàn)的峰都為正峰，在1 684、1 548 cm-1左右出現(xiàn)較強的峰，說明這些峰與PC1 具有正相關(guān)性。在PC2 載荷圖中，1 750～1 684 cm-1和1 545～1 500 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)正峰，說明這些峰與PC2 具有正相關(guān)性，1 684～1 545 cm-1范圍內(nèi)為負峰，該區(qū)域的吸收峰與PC2 有負相關(guān)關(guān)系，其中最強峰出現(xiàn)在1 589 cm-1附近。

以上結(jié)果表明，不同老化時間下的小粒咖啡種子間存在差異，2 個主成分中較強的峰都歸屬于蛋白質(zhì)吸收峰，由此推斷，小?？Х戎械鞍踪|(zhì)含量的差異是主成分判別中的主要依據(jù)，在PC1 和PC2 的不同程度老化分類中承擔主要貢獻，印證了曲線擬合中蛋白質(zhì)是小?？Х戎兄匾M成成分的結(jié)果。

2.5 系統(tǒng)聚類分析

圖8 為人工老化小粒咖啡種子在1 800～800 cm-1范圍內(nèi)紅外光譜的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果。用SPSS 24對人工老化小粒咖啡種子樣品（未老化以及老化2、4、6、8 d 各取5 個，共25 個光譜樣本）在1 800～800 cm-1范圍內(nèi)進行聚類分析，聚類方法為組間連接，區(qū)間選擇歐氏距離。未老化小粒咖啡種子聚為一類且與其他樣品的相距最遠，距離為25，老化4 d小?？Х确N子單獨聚為一類；老化2、6、8 d 小?？Х确N子各自聚為一類，并聚集在一起；老化2 d 和老化6 d 小粒咖啡種子距離最近，說明這兩種樣品在成分或物質(zhì)含量上最相似。系統(tǒng)聚類分析和主成分分析均能對不同老化時間小?？Х确N子進行較好的分類，表明多元統(tǒng)計分析可以用來分析人工老化小粒咖啡種子。

圖8 人工老化小?？Х确N子紅外光譜的系統(tǒng)聚類分析

3 結(jié)論

本研究利用傅里葉變換紅外光譜法、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜、曲線擬合分析結(jié)合多元統(tǒng)計學方法對人工老化小?？Х确N子進行分析。光譜結(jié)果顯示，人工老化小?？Х确N子的紅外光譜主要物質(zhì)的吸收峰整體相似。根據(jù)紅外光譜的吸收峰強度可得，隨著老化時間的增加，脂類物質(zhì)特征峰峰強比明顯增加，糖類物質(zhì)特征峰峰強比表現(xiàn)為先增后減再增，而蛋白質(zhì)特征峰峰強比變化趨勢為先減小后增加。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜顯示，人工老化小?？Х确N子在1 800～1 600 cm-1和1 200～950 cm-1范圍內(nèi)的峰數(shù)量隨著老化時間的增加而減少，部分吸收峰隨老化時間發(fā)生峰移。曲線擬合在1 770～1 500 cm-1范圍內(nèi)進行分析，不同老化時間的小粒咖啡種子的子峰位置和面積百分比存在差異，人工老化小?？Х确N子中脂質(zhì)和咖啡因所對應(yīng)峰的相對含量呈現(xiàn)先增后減趨勢，蛋白質(zhì)所對應(yīng)峰的相對含量呈現(xiàn)先減后增趨勢，且面積百分比最大。多元統(tǒng)計方法顯示，在1 750～1 500 cm-1范圍內(nèi)的主成分分析和在1 800～800 cm-1范圍內(nèi)的系統(tǒng)聚類分析均能實現(xiàn)5 個不同老化時間的小?？Х确N子獨立聚類。主成分分析載荷圖顯示，對不同老化小?？Х确N子分類貢獻最大的吸收峰歸屬于蛋白質(zhì)，證明了老化過程中蛋白質(zhì)是主要的變化物質(zhì)之一。系統(tǒng)聚類分析不僅可以根據(jù)其結(jié)果得到不同樣品之間的接近程度，且分類效果比主成分分析更好。結(jié)果表明，紅外光譜法結(jié)合多元統(tǒng)計分析可以快速、有效地區(qū)分不同老化程度的小?？Х确N子。