羌藥胃草質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

譚承佳,田 徽,黃御蓮,李玉蓮,劉容西,馬曉燕

(1.綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川綿陽 621000;2.綿陽市中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川綿陽 621006;3.北川羌族自治縣中羌醫(yī)醫(yī)院,四川北川 622750)

0 引言

羌藥胃草為豆科山螞蝗屬植物小槐花(Desmodiumcaudatum(Thunb.) DC.)的干燥全株[1],作為羌族藥、苗族藥、瑤族藥、壯族藥,收錄于《民族藥志》中[2].甘、苦、微寒,歸心、肺和脾經(jīng),具有清熱解毒,祛風(fēng)通疹,消散止痛的功效.內(nèi)服多用于感冒發(fā)燒,腸胃炎,痢疾,小兒疳積,風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛;外用治療毒蛇咬傷,癰癤疔瘡,乳腺炎等疾病的治療[3-5].胃草中主要含有黃酮類、生物堿類、萜類及多酚類及揮發(fā)油類等多種化合物[6-10].目前2010年版《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收載小槐花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1],規(guī)定性狀、顯微鑒別、檢查(水分、總灰分、酸不溶性灰分)、浸出物,活性成分提及主要含黃酮類成分,未做定性鑒別及含量測定規(guī)定,不能全面反映藥材內(nèi)在質(zhì)量,故本實(shí)驗(yàn)在原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,選擇牡荊素、異牡荊素、蘆丁為指標(biāo),采用TLC、HPLC、UV-可見分光光度法對(duì)胃草進(jìn)行定鑒別和黃酮類成分含量測定,以期為完善羌藥胃草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù).

1 材料

1.1 儀器

安捷倫AgiLent 1100分析型高效液相色譜儀(美國安捷倫)、潔盟JP-060型超聲波清洗機(jī)(深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司)、AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)、超純水機(jī)(美國millipore).

1.2 試劑與藥物

牡荊素(批號(hào)MUST-20091710)、異牡荊素(批號(hào)MUST-20070110)對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司);聚酰胺薄層(青島).甲醇、乙腈、甲酸、三乙胺磷酸溶液為色譜純(美國fisher公司);水為超純水;其他試劑均為分析純(四川科隆試劑).

1.3 藥材

胃草共6批(表1),由綿陽師范學(xué)院田徽教授鑒定為豆科山螞蝗屬植物小槐花(Desmodiumcaudatum(Thunb.)DC.)的干燥植株.

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒定

羌藥胃草的根呈圓柱形,長5～15 mm,帶有支根,表面呈現(xiàn)出灰褐色或棕褐色,具細(xì)縱皺紋,有疣狀突起和長圓形的皮孔.質(zhì)堅(jiān)韌不易折斷,橫截面為黃白色且有纖維性.圓柱形的莖,常有分枝,表面為灰棕色,皮孔呈圓形,質(zhì)硬而脆.葉呈三出復(fù)葉互生,小葉大多會(huì)皺縮脫落,展平后呈披針形,頂端漸尖或銳尖,莖部楔形,全緣.氣微,味淡[1,3].

2.2 粉末顯微鑒別

胃草藥材粉末經(jīng)水合氯醛試液加熱,透化,滴加稀甘油裝片,置顯微鏡下觀察,粉末呈米黃色,淀粉粒極多,單粒淀粉粒類球形或橢圓形,直徑8.4～15 μm,臍點(diǎn)裂縫狀或人字狀,層紋不明顯;復(fù)粒淀粉粒由2～4粒組成,臍點(diǎn)和層紋都不明顯.方晶較多,單個(gè)散在,呈棱形、方形或多面形.晶鞘纖維較多,單個(gè)散在.纖維少見,長1.1～1.5 mm,端尖長.孔紋導(dǎo)管較多,可見螺紋、梯紋導(dǎo)管.非腺毛較多,長2.6～3.4 mm,表面有疣狀突起,壁厚[1].見圖1.

注:1～6分別為非腺毛、方晶、淀粉粒、梯紋導(dǎo)管、木纖維、晶鞘纖維(10×40)圖1 胃草粉末顯微特征Fig.1 Microscopic characters of Desmodi- umcaudatum DC.

2.3 牡荊素、異牡荊素的薄層鑒別

取胃草粗粉約4 g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加60%乙醇溶液100 mL,加熱回流1 h,放冷,濾過,回收乙醇至40 mL,加水10 mL,攪勻,石油醚萃取至無色,乙酸乙酯振搖提取2次,每次25 mL,合并乙酸乙酯液,減壓濃縮至干,甲醇溶解定容至5 mL,即得.另精密稱取牡荊素、異牡荊素對(duì)照品適量,分別置兩個(gè)容量瓶中,各加甲醇制成含牡荊素、異牡荊素0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液.分別吸取供試品、牡荊素、異牡荊素對(duì)照品溶液各20 μL,點(diǎn)樣于同一聚酰胺薄層,以乙酰丙酮-95%乙醇-水(2∶2∶3)為展開劑,展開,取出,晾干,噴20 mg/mL的三氯化鋁乙醇溶液,105 ℃加熱5 min后,置紫外光(365 nm)下檢視.供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的亮藍(lán)色斑點(diǎn),并測得牡荊素Rf=0.69,異牡荊素Rf=0.73,展開斑點(diǎn)圓整,不拖尾,供試品與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)點(diǎn)清晰,展開效果較好.見圖2.

注:S為供試品CW-1;1、2為牡荊素、異牡荊素對(duì)照品圖2 牡荊素、異牡荊素TLC色譜圖Fig.2 TLC Chromatography of vitexin; isovitexin

2.4 水分、總灰分、酸不溶性灰分、乙醇浸出物含量測定

照《中國藥典》2020年版通則項(xiàng)下,對(duì)水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物進(jìn)行檢查,結(jié)果見表2.

2.5 含量測定

2.5.1 牡荊素的HPLC含量測定[11-13]

(1)液相色譜條件.色譜柱:Diamonsil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.5%甲酸(7∶93);檢測波長360 nm;流速1.0 mL/min;柱溫30℃.色譜圖見圖3.理論塔板數(shù)按牡荊素計(jì),不低于3 000.

圖3 牡荊素HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of vitexin

(2)溶液制備.①對(duì)照品溶液制備:精密稱取牡荊素對(duì)照品適量,加50%乙腈溶解制成0.101 mg/mL的溶液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得.②供試品溶液制備:取胃草粗粉5 g,精密稱定,置于圓底燒瓶,精密加入80%甲醇50 mL,稱定重量,至80 ℃水浴加熱回流1.5 h,取出放冷,加80%甲醇補(bǔ)重,搖勻,濾過,濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得.

(3)含量測定方法學(xué)考察.①線性范圍考察:分別精密吸取“2.5.1(2)”溶液制備項(xiàng)下對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 μL進(jìn)樣,照“2.5.1(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定峰面積,以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸,得牡荊素方程為y=3 307.4x-31.51(r=0.999 9),牡荊素在0.101～0.505 μg范圍內(nèi),線性關(guān)系良好.②精密度考察:精密吸取“2.5.1(2)”溶液制備項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL,照“2.5.1(1)”色譜條件項(xiàng)下進(jìn)樣測定6次,測得牡荊素峰面積RSD值為1.84%,結(jié)果表明儀器精密度良好.③穩(wěn)定性考察:精密吸取“2.5.1(2)”溶液制備項(xiàng)下供試品溶液10 μL,分別于0、4、8、12、24 h照“2.5.1(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定峰面積,測得牡荊素峰面積RSD值為1.88%,表明溶液放置24 h穩(wěn)定.④重復(fù)性考察:取同一批胃草粗粉(WC-1)6份,照“2.5.1(2)”溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液,照“2.5.1(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定峰面積.計(jì)算牡荊素含量為0.104 3 mg/g,RSD值為1.36%,重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果良好.⑤加樣回收率考察:取胃草(WC-1)粗粉6份,每份約2.5 g,精密稱定,分別加入牡荊素對(duì)照品溶液(0.258 8 mg/mL)1 mL,照“2.5.1(2)”溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液,照“2.5.1(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定峰面積.計(jì)算回收率.結(jié)果見表3.

表3 牡荊素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests for vitexin

(4)含量測定.取6批胃草藥材,照“2.5.1(2)”溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液,照“2.5.1(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL,測定峰面積,計(jì)算含量.結(jié)果表明,WC-1～6號(hào)藥材中牡荊素含量分別為0.113 0、0.116 3、0.115 9、0.113 9、0.116 1、0.114 0 mg/g,平均含量0.114 9 mg/g.

2.5.2 總黃酮含量測定

(1)顯色方法.精密量取“2.5.2(2)”溶液制備項(xiàng)下樣品溶液適量,置于25 mL的容量瓶中,加60%的乙醇稀釋至12.5 mL,加0.7 mL5%的亞硝酸鈉溶液,搖勻,放置5 min,加10%的硝酸鋁溶液0.7 mL,搖勻,放置6 min,再加1.0 moL/L的氫氧化鈉溶液5 mL,混勻,用60%的乙醇溶液定容至刻度,放置10 min后,以相應(yīng)試劑為空白,照《中國藥典》2020年版四部(通則0401)紫外-可見分光光度法,在510 nm處測定吸光度值.

(2)溶液制備.①對(duì)照品溶液制備:精密稱取蘆丁對(duì)照品適量,加甲醇制成0.15 mg/mL的對(duì)照品溶液.②供試品溶液制備:取胃草藥材粗粉約2 g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加60%乙醇200 mL,稱重,回流提取60 min,放冷,補(bǔ)重,濾過,取續(xù)濾液,即得.

(3)含量測定方法學(xué)考察.①線性范圍考察:分別精密移取“2.5.2(1)”溶液制備項(xiàng)下對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 mL,照“2.5.2(1)”項(xiàng)下方法顯色,測定吸光度,以吸光度(Y)對(duì)蘆丁對(duì)照品濃度(X)進(jìn)行回歸,得蘆丁方程為y=25.333x+0.066(r=0.999 2),蘆丁在0.006～0.03 mg/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好.②精密度考察:精密量取“2.5.2(2)”溶液制備項(xiàng)下對(duì)照品溶液3 mL,照“2.5.2(1)”項(xiàng)下方法顯色,測定6次,計(jì)算吸光度RSD值為0.24%,表明儀器精密度良好.③穩(wěn)定性考察:精密量取“2.5.2(2)”溶液制備項(xiàng)下同一供試品溶液3 mL,于0、0.5、2、1.5、2、3 h照“2.5.2(1)”項(xiàng)下方法顯色,測定,吸光度RSD值為0.5%,表明溶液顯色后在3 h內(nèi)穩(wěn)定.④重復(fù)性考察:取胃草粗粉(WC-1)6份,照“2.5.2(2)”溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密量取3 mL,照“2.5.2(1)”項(xiàng)下方法顯色,測定吸光度,計(jì)算總黃酮含量為2.031 9 mg/g,RSD值為1.14%(n=6),表明重復(fù)性良好.⑤加樣回收率考察:取胃草(WC-1)粗粉6份,各約1 g,精密稱定,分別精密加入蘆丁對(duì)照品溶液(1.5 mg/mL)1.4 mL,照“2.5.2(2)”溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液,照“2.5.2(1)”項(xiàng)下方法顯色,測定吸光度,計(jì)算回收率.結(jié)果表明總黃酮平均加樣回收率(以蘆丁計(jì))為97.2%,RSD值為1.26%(n=6).

(4)總黃酮含量測定.取6批胃草藥材粗粉,照“2.5.2(2)”溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液,照“2.5.2(1)”項(xiàng)下方法顯色,測定吸光度,計(jì)算含量.結(jié)果表明,胃草藥材(WC-1～6號(hào))中總黃酮含量(以蘆丁計(jì))分別為2.062 3、2.069 2、2.079 8、2.059 0、2.048 4、2.065 9 mg/g,平均含量2.064 1 mg/g.

3 討論

3.1 TLC定性鑒別

本實(shí)驗(yàn)選擇胃草中的黃酮類化合物牡荊素、異牡荊素作為指標(biāo)成分,以聚酰胺薄膜為固定相,進(jìn)行溫度、相對(duì)濕度、展開劑等系統(tǒng)耐用性實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)比較了正丁醇-水-醋酸(4∶1∶1)、甲酸-乙酸乙酯-水(1∶8∶1)、乙酰丙酮-95%乙醇-水(2∶2∶3)三種展開劑的展開效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用正丁醇-水-醋酸(4∶1∶1)、甲酸-乙酸乙酯-水(1∶8∶1)系統(tǒng)展開后,牡荊素和異牡荊素分離度較小且有拖尾;使用乙酰丙酮-95%乙醇-水(2∶2∶3)系統(tǒng)展開,背景干擾較小,展開斑點(diǎn)圓整,分離度良好.

3.2 檢查項(xiàng)限量

6批胃草藥材中,水分、總灰分、酸不溶性灰分分別為1.50%～1.83%、4.63%～4.80%、1.16%～1.21%,結(jié)合平均值,參照四川中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1],暫定水分、酸不溶性、總灰分灰分分別不得超過13.0%、2.0%、8.0%.

3.3 浸出物限量

6批胃草藥材中,水溶性浸出物含量為15.64%～16.58%,參照四川中藥材標(biāo)準(zhǔn)收載小槐花標(biāo)準(zhǔn)[1],暫定不得低于10.0%.

3.4 黃酮類成分含量測定

牡荊素、異牡荊素為胃草中黃酮類成分,具有抗心肌缺血、抗炎、降血糖、抗腫瘤等藥理作用[4-5].本實(shí)驗(yàn)選擇牡荊素、異牡荊素作為指標(biāo)成分,采用HPLC測定牡荊素含量在0.113 0～0.116 3 mg/g,平均含量為0.114 9 mg/g.采用UV-Vis法測定胃草中總黃酮含量為在2.048 4～2.079 8 mg/g,平均含量為2.064 1 mg/g.以不合格率低于樣本量的20%設(shè)限,暫定胃草中牡荊素含量不得低于0.09 mg/g,總黃酮含量不得低于1.6 mg/g.

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)測定了胃草藥材中的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量,并參照《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了限量.同時(shí)實(shí)驗(yàn)建立了胃草藥材中的牡荊素、異牡荊素TLC定性鑒別方法;牡荊素的HPLC含量測定方法;總黃酮的UV-Vis含量測定方法.所建立的方法簡便、科學(xué)、準(zhǔn)確,可為完善羌藥胃草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、開發(fā)利用藥材資源提供依據(jù).