參麻頸復(fù)方對腦缺血損傷小鼠的腦保護作用及其機制研究

劉景雪，何瑞華，陶 霞，黃 瑾 （.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科, 上海, 00437；.海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科, 上海, 00003）

腦血管疾病是僅次于心腦血管疾病和癌癥的第三大病癥，其中腦缺血是常見的腦血管疾病之一。腦缺血的患病率和死亡率仍處于上升趨勢，嚴(yán)重影響人們的健康。目前，西醫(yī)對于腦缺血的主要治療方式是溶栓和取栓，但有嚴(yán)格的溶栓時間窗和較大的取栓風(fēng)險，并且缺血后造成神經(jīng)功能的損傷沒有有效的藥物治療[1]。中醫(yī)藥在腦缺血的預(yù)防和治療中具有潛在作用，以氣虛為本、血瘀為標(biāo)作為主要病因[2]。查閱近幾年文獻發(fā)現(xiàn)，益氣活血化瘀方藥在防治腦缺血中表現(xiàn)出多方面和整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢。

參麻頸復(fù)方是臨床名老中醫(yī)經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)具有活血通絡(luò)，益氣養(yǎng)血，寧神安腦，健筋壯骨之效。該方由首烏藤、丹參、山茱萸（制）、天麻、當(dāng)歸、川芎等組成，臨床應(yīng)用廣泛。首烏藤有養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)之效[3]，丹參有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、除煩安神之效[4]，當(dāng)歸有補血調(diào)經(jīng)、活血散寒、消腫止痛生肌、潤腸通便之效[5]，川芎、陳皮的補氣之效輔佐以上藥物活血功效運行，而且川芎具有活血化瘀之效，是傳統(tǒng)中醫(yī)防治中風(fēng)選擇最多的配方之一[6]。本研究評估參麻頸復(fù)方對小鼠腦缺血損傷的改善作用，并進一步探討其對骨髓來源內(nèi)皮祖細胞干預(yù)發(fā)揮防治腦缺血損傷的機制，為中藥方劑治療腦缺血提供新的思路、尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及試劑

細胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司）；倒置熒光顯微鏡（Leica 公司）；Odssey 紅外熒光顯像（Li-Cor 公司）；酶標(biāo)儀（芬蘭 Labsystens Dragon 公司）；渦旋混合器（江蘇天翎儀器有限公司）；超凈臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；電子天平JA2003（上海天平儀器廠）。

圖1 各組小鼠神經(jīng)功能學(xué)評分(n=8)

圖2 各組小鼠腦梗體積比較(n=8)

圖3 各組小鼠黏附細胞數(shù)目比較(n=10)

圖4 各組小鼠遷移細胞數(shù)目比較(n=10)

圖5 各組小鼠細胞形成小管數(shù)目比較(n=10)

圖6 各組小鼠細胞中相關(guān)蛋白表達(n=11)

參麻頸復(fù)方顆粒（岳陽醫(yī)院自制制劑，批準(zhǔn)文號：滬藥制字Z05050324）；尼莫地平片（天津市中央藥業(yè)有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京西濃科技有限公司）；VEGF 抗體（abcam 公司）；BDNF 抗體（abcam 公司）；GAPDH 內(nèi)參抗體（abcam 公司）；Tubulin 內(nèi)參抗體（abcam 公司）；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（EGM-2 Single Quots，Lonza 公 司)；波 連 蛋 白（vitronection，BD 公司）。

1.2 實驗動物及分組

實驗動物為SPF 級C57BL/6 雄性小鼠30 只（上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司，許可證：SCXK（滬）2017-0012），體重為18-20 g，6-7 周齡。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將30 只小鼠隨機分為模型對照組（Control 組）、參麻頸組（SMJ 組）、尼莫地平組（NMDP 組），10 只/組。實驗過程中對于實驗小鼠的所有處理均符合倫理學(xué)規(guī)定。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備動物模型

采用電凝法制備局灶性腦缺血模型[7]，用濃度為12%的水合氯醛對小鼠進行腹腔注射，劑量控制在350 mg/kg。小鼠麻醉后，仰臥位固定在手術(shù)臺。借助顯微鏡，用顯微鑷沿顳肌纖維束的方向鈍性分離肌肉，直到顴骨及麟骨暴露，顯微鑷夾住顴骨固定小鼠頭部，用牙科鉆重點打磨顴骨和麟骨的交叉部位，骨殼變薄并有裂縫時，停止打磨，用撬棒沿已暴露的動脈血管剝離骨片，直至小鼠左側(cè)大腦中動脈與伴行的迷走神經(jīng)分叉暴露；在顯微鏡下，找準(zhǔn)紋狀體外側(cè)動脈近心端，用雙極電凝器凝斷左側(cè)大腦中動脈后，將電凝器緩慢移出，顯微鏡下再次確認是否凝斷。最后用顯微鑷將皮膚和肌肉歸置原位，以便于縫合。小鼠完全蘇醒后，觀察精神狀態(tài)，若出現(xiàn)站立不穩(wěn)、左側(cè)肢體偏癱、提尾向一側(cè)轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)功能損害癥狀，即為造模成功。

參麻頸組在手術(shù)前通過灌胃方式給予6.88 g?kg-1的參麻頸復(fù)顆粒；尼莫地平組給予2.16 mg/kg 溶液灌胃；模型對照組給予等量蒸餾水灌胃，每日1 次，共14 d。

1.3.2 神經(jīng)行為學(xué)功能評分

術(shù)后第3 d，由觀察者在不知分組情況下記錄神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，并采用參考文獻[7]評分方法，如提尾懸空試驗等[8]，評估神經(jīng)行為學(xué)功能評分。

提尾懸空試驗：提起小鼠尾巴末端使其懸空，觀察小鼠頭部偏轉(zhuǎn)。以小鼠身體的中線為基準(zhǔn)，頭部偏離中線超過10 度記為成功的偏轉(zhuǎn)，每只小鼠重復(fù)提尾懸空試驗：提起小鼠尾巴末端使其懸空，觀察小鼠頭部偏轉(zhuǎn)。以小鼠身體的中線為基準(zhǔn)，頭部偏離中線超過10 度記為成功的偏轉(zhuǎn)，每只小鼠測20 次，并且每次測定的時間間隔不少于1 min，以保證小鼠得到充足的休息。小鼠的偏轉(zhuǎn)率計算按以下公式：擺動頻率（%）=（T-10）/10×100%。

T 為實驗小鼠頭部向手術(shù)對側(cè)偏轉(zhuǎn)的次數(shù)。

平衡木試驗：記錄小鼠由木棍一端順利通過平衡木80%長度所用的時間。在正式試驗前對小鼠進行3 次訓(xùn)練，正式試驗時每只小鼠重復(fù)測定3 次，對每只小鼠均間隔5 min 后進行下一次實驗。

1.3.3 腦組織TTC 染色

行為學(xué)評分測完后，小鼠脫頸處死，取腦組織，放1×PBS 中清洗干凈，將腦組織放在腦片模具中，共切7 片，每片2 mm，放2%的TTC 溶液中，并在37 ℃水浴鍋中染色10 min，染色結(jié)束后放4%多聚甲醛固定6 h，按照腦片大小順序排好拍照，腦片使用Image J 統(tǒng)計軟件測定小鼠的腦梗死體積。

1.3.4 細胞功能測定

取腦組織的同時，提取小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細胞，培養(yǎng)至第7d 時，收集和處理細胞，對細胞黏附、遷移及形成小管能力進行測定。

細胞黏附實驗：用胰酶消化細胞,按照3×105個/ml 細胞接種于預(yù)先包被人纖維粘連蛋白的96 孔板中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h 后棄掉未黏附細胞，再用4%多聚甲醛固定，以Hochest 33 258 染料染色后于倒置顯微鏡下拍照。

細胞遷移實驗：調(diào)整細胞濃度3×105個/ml，Transwell 小室置于24 孔板，按分組下室加600 μl配好的下室溶液，細胞懸液接種于上室各100 μl,置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用PBS 清洗2 次，棄上清液，在2%多聚甲醛固定15 min。棄上清，PBS 清洗2 次，上室轉(zhuǎn)移至含600 μl Hochest 33 258 染料的孔中，避光染色15 min。棄上清，PBS 浸泡5 min,棄上清，光學(xué)顯微鏡下拍照，以Image J 軟件計算各組遷移細胞數(shù)。

小管形成實驗：調(diào)整各組細胞至3×105個/ml，每孔100 μl 的細胞懸液加到鋪有基質(zhì)膠的孔中，最后將96 孔板移至培養(yǎng)箱孵育6 h，在光學(xué)顯微鏡下拍照，以Image J 軟件計算各組小管形成數(shù)量。

1.3.5 Western blot 檢測

細胞樣本同“1.3.4”項中相同來源，六孔板放在冰枕上，用預(yù)冷PBS 潤洗細胞兩次，棄上清液；向板內(nèi)加入60 μl 已配置好的細胞裂解液，在冰枕上裂解15 min，收集細胞液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP 管中，使用高速離心機在12 000 r/min，4 ℃離心15 min，將離心后的上清液收集到新的離心管中并放到-80 ℃冰箱保存。應(yīng)用紫外分光光度計測量蛋白濃度后，進行蛋白定量，95 ℃ 5 min 蛋白滅活后，-20 ℃保存待用。SDS-PAGE 凝膠電泳：初始電壓調(diào)為50 V，電泳至Marker 中紅色條帶分離出，將電壓調(diào)為 120 V，直至Marker 顯示跑到膠的底部時停止電泳。轉(zhuǎn)膜：恒流200 mA 轉(zhuǎn)膜，不同目的蛋白按其分子量大小設(shè)置轉(zhuǎn)膜時間。封閉：用5%脫脂牛奶封閉1 h。封閉之后用1%牛奶配置的一抗4 ℃孵育過夜。第2 天，用1%牛奶配制的二抗室溫孵育1 h，NC 膜放到Odyssey 掃膜儀上進行掃描，保存掃描照片，使用Quantity One 軟件統(tǒng)計蛋白的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用Graphpad prism 5.0 分析數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)均以表示，兩組之間的差異采用非配對T 檢驗進行分析，多組數(shù)據(jù)間的差異采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能學(xué)評分

小鼠造模成功后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為站立不穩(wěn)、左前肢屈曲內(nèi)收，肌張力下降。與對照組比較，尼莫地平組小鼠的神經(jīng)功能有明顯改（P<0.01）；與對照組比較，參麻頸組小鼠的爬桿時間（P<0.05）和對側(cè)偏轉(zhuǎn)率（P<0.01）均有顯著降低，表明小鼠給予參麻頸復(fù)方后，能有效保護缺血后神經(jīng)功能的缺損（圖1）。

2.2 各組小鼠腦梗體積變化

用TTC 染色后結(jié)果顯示：對照組小鼠術(shù)后腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶。與對照組比較，給參麻頸組小鼠腦缺血后腦梗體積顯著減少（P<0.01）；給予尼莫地平的小鼠與參麻頸組相比，其腦梗體積雖有減少，但無統(tǒng)計學(xué)差異（圖2）。

2.3 各組小鼠內(nèi)皮祖細胞黏附功能比較

細胞黏附實驗結(jié)果顯示：對照組相比于另外兩組，黏附細胞數(shù)目減少。預(yù)先給予參麻頸的小鼠，在發(fā)生腦缺血后，小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細胞黏附于96 孔板中細胞數(shù)目，明顯高于對照組（P<0.01）；給予尼莫地平組，其細胞數(shù)目也比對照組增多（P<0.01）；而尼莫地平組和參麻頸組兩組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

2.4 各組小鼠內(nèi)皮祖細胞遷移功能比較

遷移實驗結(jié)果顯示：與參麻頸組和尼莫地平組比較，模型對照組細胞遷移至Transwell 板上室下面的數(shù)目可見減少。與對照組比較，給予參麻頸復(fù)顆粒后的腦缺血小鼠，其骨髓來源內(nèi)皮祖細胞遷移數(shù)顯著增加（P<0.05）；給予尼莫地平的小鼠與對照組比較，其遷移細胞數(shù)目增加（P<0.01）；參麻頸組和尼莫地平組，兩組結(jié)果有差異但無統(tǒng)計意義（圖4）。

2.5 各組小鼠內(nèi)皮祖細胞形成小管能力比較

從圖中可看出，對照組小鼠內(nèi)皮祖細胞形成小管的數(shù)目減少。與對照組比較，參麻頸組內(nèi)皮祖細胞形成小管數(shù)目有明顯增加（P<0.05），尼莫地平組小管形成數(shù)目更為突出（P<0.01）；尼莫地平組形成的小管狀態(tài)也優(yōu)于參麻頸組（圖5）。

2.6 各組小鼠內(nèi)皮祖細胞中相關(guān)蛋白的表達水平

Western blot 檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，參麻頸組（P<0.01）和尼莫地平組（P<0.01）小鼠內(nèi)皮祖細胞內(nèi)BDNF 蛋白表達增加，而參麻頸組和尼莫地平組之間結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖6）。

3 討論

缺血性中風(fēng)是一種以動脈粥樣硬化為基礎(chǔ)的中樞系統(tǒng)不可逆損傷；它是由阻塞頸內(nèi)動脈、椎動脈或者腦血管的血栓形成引起的，這一過程減少了血液供應(yīng)，導(dǎo)致細胞代謝紊亂和衰老，并進一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[9-10]。腦缺血后導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損傷，并造成神經(jīng)功能障礙，包括偏癱、肢體痙攣和認知障礙等，從而降低患者的生活質(zhì)量[11]。目前，西醫(yī)臨床治療存在局限性，使得該疾病的殘疾率仍然很高，以及帶來的社會經(jīng)濟負擔(dān)也在繼續(xù)增加。中醫(yī)藥博大精深，很多研究者一直都在致力于尋找改善腦缺血所致神經(jīng)功能障礙的中醫(yī)療法。

中醫(yī)典籍《傷寒雜病論》早就將活血化瘀中藥或中藥復(fù)方用于缺血性疾病的治療?；钛鲋兴帍?fù)方通過多靶點、多途徑的作用方式發(fā)揮整體性作用?，F(xiàn)代研究方法——代謝組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等為中藥復(fù)方作用機制的闡述提供強有力的支持。前期相關(guān)研究顯示，在傳統(tǒng)中藥中，發(fā)現(xiàn)許多成分可以促進血管的生成，如丹參酮，川芎嗪，三七總皂苷等[12-14]，這些是方劑中常用的中藥，也是活血化瘀類草藥的代表。而參麻頸復(fù)方中，大部分的中藥具有活血化瘀作用，是否能夠改善骨髓來源內(nèi)皮祖細胞功能，又能否促進腦缺血損傷后的新血管的生成，需要進一步驗證。

本研究中，參麻頸復(fù)方顆粒預(yù)處理后，小鼠腦缺血所致的神經(jīng)行為學(xué)功能評分顯著改善；TTC 染色梗死體積也顯著減少（P<0.01）。證明參麻頸復(fù)方顆粒對小鼠腦缺血損傷具有保護作用，可改善神經(jīng)功能和減小缺血梗死體積。

越來越多的臨床前研究表明[15]，無論是缺血性腦卒中急性期還是慢性期，均會導(dǎo)致炎癥和腦組織不可逆轉(zhuǎn)的損傷。因此，為了減輕缺血組織的病理損傷，修復(fù)內(nèi)皮功能障礙引起的血管損傷成為缺血性腦卒中治療的主要方向。骨髓來源內(nèi)皮祖細胞是內(nèi)皮愈合和血管生成的關(guān)鍵效應(yīng)因子。內(nèi)皮祖細數(shù)量減少、內(nèi)皮功能障礙與心血管事件風(fēng)險增加息息相關(guān)[16]，這與內(nèi)皮祖細胞介導(dǎo)的血管修復(fù)受損致使血管疾病進展是一致的[17]。為了響應(yīng)缺血信號和血管損傷,骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞被動員到循環(huán)中并募集到內(nèi)皮損傷部位，從而形成新生血管，這也是一種自然的防御機制[18]。

第二部分實驗研究了參麻頸復(fù)方顆粒對腦缺血損傷小鼠內(nèi)皮祖細胞的保護作用。結(jié)果顯示，小鼠腦缺血損傷后，來自骨髓的內(nèi)皮祖細胞黏附在96 孔板和遷移至Transwell 板下室的數(shù)目有顯著減少，給予參麻頸復(fù)方顆粒預(yù)處理后，黏附細胞數(shù)目（P<0.01）和遷移細胞數(shù)目（P<0.05）均有明顯增加。另外，腦缺血損傷可影響血管新生的速度和質(zhì)量，表現(xiàn)為內(nèi)皮祖細胞形成小管的能力，包括形成小管的數(shù)量和小管長度。本研究的結(jié)果中，參麻頸復(fù)方顆粒顯著增加腦缺血損傷小鼠的內(nèi)皮祖細胞形成小管的數(shù)量和長度（P<0.05）。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一組對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、生長、存活和分化至關(guān)重要的蛋白質(zhì)[19]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富、分布最廣的神經(jīng)營養(yǎng)因子。血管內(nèi)皮細胞合成并分泌BDNF，并通過刺激其原肌球蛋白受體激酶B 促進神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞分化、細胞生長、突觸形成和神經(jīng)發(fā)生[20-21]。重要的是，BDNF 在缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷后表現(xiàn)出許多神經(jīng)保護特性[22]。BDNF 通過促進新生血管、調(diào)節(jié)內(nèi)皮一氧化氮生成和抑制凋亡來改善內(nèi)皮細胞功能障礙[23]。

第三部分實驗深入探討了參麻頸復(fù)方顆粒保護小鼠腦缺血損傷的作用，結(jié)果顯示，小鼠腦缺血后，大腦受到損傷，內(nèi)皮祖細胞中BDNF 蛋白表達顯著降低，內(nèi)皮祖細胞功能受損；參麻頸復(fù)方顆粒干預(yù)后，BDNF 蛋白表達水平顯著增加（P<0.01），細胞功能得以改善。這與二甲雙胍上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）中BDNF 的表達逆轉(zhuǎn)高糖狀態(tài)下的細胞損傷相同[23]。由于BDNF 蛋白表達的增加，腦缺血小鼠的神經(jīng)功能得到改善，腦梗死體積減小。

綜上所述，參麻頸復(fù)方顆粒對小鼠腦缺血損傷有保護作用，這一作用可能與促進內(nèi)皮祖細胞中腦源性神經(jīng)因子BDNF 蛋白表達，改善內(nèi)皮祖細胞功能有關(guān)。我們這一研究為參麻頸復(fù)方顆粒在心血管疾病的治療提供了新視角，并進一步驗證了在心腦血管疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用，這可能減緩疾病的進展和改善預(yù)后。