基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的青蒿治療腎陰虛型糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松機(jī)制研究

賴立勇，夏天爽，岳小強(qiáng)，辛海量 （1.海軍軍醫(yī)大學(xué)：a.藥學(xué)院生藥學(xué)教研室；b.中醫(yī)系, 上海 00433；.海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科, 上海 00003）

作者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)青蒿治療腎陰虛型糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松（GIOP）的潛在作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)和初步驗(yàn)證。研究結(jié)果表明，青蒿治療腎陰虛型GIOP 具有多靶點(diǎn)-多通路的特點(diǎn)，可以通過多條途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化，其中PI3K/AKT 信號(hào)通路是一條重要的通路，青蒿治療腎陰虛型骨質(zhì)疏松可能與其能夠促進(jìn)PI3K/AKT 信號(hào)通路，促進(jìn)AKT 的磷酸化有關(guān)。

前言

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis, OP）是一種以骨密度（bone mineral density, BMD) 降低、骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)破壞為主要特點(diǎn)的全身代謝性骨病，以骨脆性增加、易發(fā)生骨折為主要特征[1]。隨著老齡化的加劇，OP 的發(fā)生率越來越高，在我國(guó)50 歲以上的人群中，OP 的發(fā)生率為19.2%，其中女性為32.1%，男性為6.0%[2]。OP 可分為原發(fā)性O(shè)P 和繼發(fā)性O(shè)P，在繼發(fā)性O(shè)P 中，糖皮質(zhì)激素性O(shè)P（glucocorticoidinduced osteoporosis, GIOP）的發(fā)生率排在第一位[3]，目前骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種以骨密度（BMD) 降低、骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)破壞為主要特點(diǎn)的全身代謝性骨病，以骨脆性增加、易發(fā)生骨折為主要特征[1]。隨著老齡化的加劇，OP 的發(fā)生率越來越高，在我國(guó)50 歲以上的人群中，OP 的發(fā)生率為19.2%，其中女性為32.1%，男性為6.0%[2]。OP 可分為原發(fā)性O(shè)P 和繼發(fā)性O(shè)P，在繼發(fā)性O(shè)P 中，GIOP 的發(fā)生率排在第一位[3]，GIOP 治療上西醫(yī)使用的藥物有鈣制劑、活性維生素 D、雙磷酸鹽類以及雌激素等，這些藥物不僅忽略了糖皮質(zhì)激素這個(gè)罪魁禍?zhǔn)?，還有可能產(chǎn)生一系列的副作用[4]，尋找安全有效且有針對(duì)性的藥物顯得尤為重要。

中醫(yī)認(rèn)為糖皮質(zhì)激素是“純陽(yáng)”之品[5]，使用過量易傷陰津；腎主骨，腎虛是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵病機(jī)，因此，腎陰虛證是GIOP 的一個(gè)主要證型，臨床研究也證明，腎陰虛證是GIOP 患者的一個(gè)易患證型[6]。青蒿為菊科蒿屬植物黃花蒿植物Artemisia annuaL.的干燥地上部分，分布遍及全國(guó)，味苦、辛，性寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清虛熱、除骨蒸的作用[7]，對(duì)于過量使用糖皮質(zhì)激素造成的陰虛火旺、煩躁不安，有一定的療效，臨床上也常用青蒿加減處方治療糖皮質(zhì)激素使用過度，造成陰虛火旺、虛火上炎的病癥[8-9]，同時(shí)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青蒿在多種骨丟失模型動(dòng)物上，可以促進(jìn)骨組織的再生，提高骨密度[10]，青蒿在治療骨質(zhì)疏松方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，目前關(guān)于青蒿治療OP，特別是在GIOP 方面的研究尚有限，為此，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論知識(shí)，研究青蒿治療腎陰虛型GIOP 的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，以期明確中藥青蒿抗腎陰虛型GIOP 的作用及機(jī)制，為骨質(zhì)疏松的臨床治療提供新思路和方法。

1 材料與方法

1.1 GIOP 相關(guān)靶點(diǎn)篩選

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.Genecards.org）、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://omim.org）和Drugbank 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://go.drugbank.com） 中，以“glucocorticoid induced osteoporosis”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得GIOP 的靶點(diǎn)基因，去除兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的重復(fù)結(jié)果，獲得GIOP 疾病靶點(diǎn)基因。

1.2 腎陰虛相關(guān)靶點(diǎn)篩選

根據(jù)全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合虛證與老年病研究專業(yè)委員會(huì)[11]1986 年對(duì)虛證辯證標(biāo)準(zhǔn)的修訂，陰虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)：主證：①五心煩熱（palms and soles）；②咽燥口干（dry throat and thirst ）；③舌紅或少苔、無(wú)苔（red tongue or less fur or without fur）；④脈細(xì)數(shù)（thin and rapid pulse）。次證：①午后升火（tidal fever）；②便結(jié)而尿短赤（constipation and scanty dark urine）；③盜汗（night sweating）。診斷條件：具備主證3 項(xiàng)，次證1 項(xiàng)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)各癥狀關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選出4 個(gè)主證檢索結(jié)果中至少出現(xiàn)3 次的靶點(diǎn)，與次證檢索結(jié)果交叉分析后得到陰虛靶點(diǎn)。腎虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)為：①腰脊酸痛（soreness and weakness of waist）；②脛酸膝軟或足跟痛（soreness and weakness of knees or heel pain）；③耳鳴或耳聾（tinnitus or deaf）；④發(fā)脫或齒搖（alopecia or toothmobilit）y；⑤尿后有余瀝或失禁（urinary incontinence or poor urination）；⑥性功能減退、不育、不孕（sexual dysfunction and infertility or sterility）。診斷條件：具備3 項(xiàng)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)各癥狀關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選出至少出現(xiàn)3 次的靶點(diǎn)為腎虛靶點(diǎn)。將陰虛靶點(diǎn)與腎虛靶點(diǎn)交叉分析后獲得腎陰虛靶點(diǎn)。將GIOP 疾病靶點(diǎn)與腎陰虛靶點(diǎn)交叉分析后獲得腎陰虛型GIOP靶點(diǎn)。

1.3 青蒿化學(xué)成分篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP：http://tcmspw.com/tcmsp.php）上，以Herb：青蒿、OB≥30%、DL≥0.18 為條件進(jìn)行檢索，確定青蒿的活性成分。

1.4 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)并添加基因名

利用TCMSP 的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模型，進(jìn)一步預(yù)測(cè)青蒿活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.Uniprot.org/）對(duì)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)添加基因名。最后利用微生信在線軟件（http://www.bioinformatics.com.cn/）將腎陰虛型GIOP 靶點(diǎn)基因與青蒿靶點(diǎn)基因進(jìn)行交集分析，并繪制出韋恩圖。

1.5 構(gòu)建基因蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治?/h3>

將“青蒿-腎陰虛型GIOP”共同靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入String 在線軟件（https://string-db.org /），選擇種屬為“Homo sapiens”，設(shè)置最小互作得分為0.4，構(gòu)建出PPI 網(wǎng)絡(luò)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中進(jìn)行可視化分析，并利用CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，以度中心度（DC）和介度中心度（BC）均大于上四分位數(shù)的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，進(jìn)一步分析。

1.6 GO 和KEGG 功能富集分析

為進(jìn)一步闡述青蒿對(duì)腎陰虛型GIOP 的作用機(jī)制，將“青蒿-腎陰虛型GIOP”共同靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://metascape.org/gp/index.html）進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 功能富集分析，并通過微生信在線軟件繪制相關(guān)柱狀圖和氣泡圖。

1.7 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

青蒿購(gòu)于河北安國(guó)市場(chǎng)，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生藥學(xué)教研室辛海量副教授鑒定，密封存放于干燥陰涼處。稱取青蒿粉末1g，加入60%乙醇50 ml，室溫冷浸7 d，過濾得濾液，55 ℃旋蒸濃縮后，55 ℃烘干備用[12-13]。

其他試劑及生產(chǎn)廠家：地塞米松（大連美侖）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；DMEM 培養(yǎng)基等細(xì)胞培養(yǎng)試劑（天津?yàn)螅?；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（南京建成）；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒、MTT（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PI3K、AKT、p-AKT、GADPH抗體（CST 公司）。

1.8 原代成骨細(xì)胞的分離

以二次消化法從新生大鼠顱骨蓋中分離獲得原代成骨細(xì)胞[14]。

1.9 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

以含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)成骨細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.10 成骨細(xì)胞增殖及ALP 檢測(cè)

取3-8 代的成骨細(xì)胞計(jì)算其數(shù)目，配制成細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml 細(xì)胞懸液接種于96 孔板。24 h后分別更換為含藥培養(yǎng)液（DEX: 10 μmol/L；AE:100、50、25 μg/ml）。給藥48 h 后采用MTT 法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖情況。

取3-8 代的成骨細(xì)胞計(jì)算其數(shù)目，配制成細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml 細(xì)胞懸液接種于24 孔板。24 h后分別更換為含藥培養(yǎng)液（給藥濃度同上）。培養(yǎng)過程中每3 d 更換1 次含藥培養(yǎng)液。第8d 裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，于4 ℃、13 800×g離心5 min。用對(duì)硝基苯磷酸二鈉法測(cè)定細(xì)胞ALP 活性。

1.11 Western blot 法檢測(cè)PI3K、AKT、p-AKT 蛋白的表達(dá)

將3-8 代的成骨細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。采用Westernblot 技術(shù)對(duì)PI3K、AKT 和p-AKT 水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腎陰虛型GIOP 相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到GIOP 相關(guān)靶點(diǎn)基因1 741 個(gè)，通過OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到GIOP 相關(guān)靶點(diǎn)基因311 個(gè)，通過Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到GIOP 相關(guān)靶點(diǎn)基因30 個(gè)，將3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果合并后去除重復(fù)基因后，最終獲得2039 個(gè)。通過Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得陰虛靶點(diǎn)基因876 個(gè)，腎虛靶點(diǎn)基因4 603 個(gè)，交叉分析后獲得腎陰虛靶點(diǎn)基因836 個(gè)。將腎陰虛靶點(diǎn)基因和GIOP 靶點(diǎn)基因交叉分析后獲得522 個(gè)腎陰虛型GIOP 靶點(diǎn)基因（圖1）。

圖1 “青蒿-腎陰虛型GIOP”交集靶點(diǎn)基因

2.2 青蒿活性成分篩選

通過TCMSP 平臺(tái)共檢索到青蒿中OB≥30%，DL≥0.18 的活性成分22 個(gè)，見表1。

2.3 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和基因名添加

通過TCMSP 和UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得214 個(gè)青蒿活性成分靶點(diǎn)基因。將其與腎陰虛型GIOP 疾病靶點(diǎn)基因交叉分析（圖1），“青蒿-腎陰虛型GIOP”交集靶點(diǎn)基因共有98 個(gè)。

2.4 靶點(diǎn)基因蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治?/h3>

運(yùn)用String 在線軟件構(gòu)建出“青蒿-腎陰虛型GIOP”共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），共有98 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1935 條相互關(guān)系，見圖2。利用CytoNCA 插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的DC，BC 上四分位數(shù)為59、101.492 48，故以DC≥59、BC≥101.492 48 為篩選條件，篩選青蒿治療腎陰虛型GIOP 的核心靶點(diǎn)，共得到17 個(gè)核心靶點(diǎn)，如表2。

表2 “青蒿-腎陰虛型GIOP”核心靶點(diǎn)信息

2.5 GO 和KEGG 功能富集分析

GO 富集分析獲得5 612 個(gè)細(xì)胞生物學(xué)過程，其中BP 分析獲得4 649 個(gè)條目，MF 分析獲得585 個(gè)條目，CC 分析獲得378 個(gè)條目，根據(jù)富集的基因數(shù)進(jìn)行降序排列，分別選取前10 個(gè)條目建立BP、MF、CC 三合一柱狀圖（圖3）。生物學(xué)過程（BP）主要涉及激素應(yīng)答、性腺發(fā)育、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)等，細(xì)胞成分（CC）包括細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、膜筏等，分子功能（MF）包括信號(hào)受體調(diào)節(jié)活性、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、激酶結(jié)合等。

圖3 BP、MF、CC 三合一柱狀圖

KEGG 富集分析獲得225 個(gè)信號(hào)過程，根據(jù)富集的基因數(shù)進(jìn)行降序排列，選取前20 個(gè)條目建立氣泡圖（圖4），KEGG 富集分析主要涉及的信號(hào)通路有PI3K/AKT 信號(hào)通路，IL-17 信號(hào)通路，AGE/RAGE 信號(hào)通路，MAPK 信號(hào)通路等，說明青蒿治療腎陰虛型GIOP 可能是從多條信號(hào)通路聯(lián)合發(fā)揮作用的，其中PI3K/AKT 信號(hào)通路上富集的共同靶點(diǎn)最多。

圖4 KEGG 氣泡圖

2.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.6.1 青蒿顯著提高DEX 損傷的成骨細(xì)胞的增殖及分化

DEX 損傷成骨細(xì)胞后，其增殖能力及ALP 活性顯著降低。藥物治療后，青蒿提取物可顯著促進(jìn)DEX 損傷的成骨細(xì)胞的增殖，提高ALP 活性，促進(jìn)DEX 損傷的成骨細(xì)胞的增殖（圖5）。

圖5 青蒿對(duì)DEX 損傷的成骨細(xì)胞的增殖(A)及分化(B)影響(n=6，

2.6.2 青蒿對(duì)DEX 損傷的成骨細(xì)胞PI3K/AKT 通路蛋白的影響

藥物處理DEX 損傷的成骨細(xì)胞48 h 后，Western blot 結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組p-AKT/AKT 比值、PI3K 蛋白表達(dá)水平明顯下降，給予青蒿提取物治療后，p-AKT/AKT 比值、PI3K 蛋白表達(dá)水平明顯提高（圖6）。

圖6 青蒿對(duì)DEX 損傷的成骨細(xì)胞PI3K/AKT 通路蛋白的影響(p-AKT/AKT:A-B, PI3K/GAPDH:C-D)(n=3，

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 通路與氧化應(yīng)激有密切的聯(lián)系，一方面，過量的活性氧（ROS）可抑制AKT 的磷酸化[15]，另一方面，磷酸化的AKT 也可以通過Nrf2/HO-1 通路抑制氧化應(yīng)激[16]。在OP 的治療藥物探索過程中，抗氧化是一條重要的線索，如啤酒花中的黃腐酚，杜仲中的綠原酸，黃連中的小檗堿，其抗骨質(zhì)疏松的機(jī)制均與抗氧化有關(guān)[17-19]，現(xiàn)代藥理研究已經(jīng)證明青蒿具有抗氧化，抗炎，調(diào)節(jié)免疫等作用[20-21]，但青蒿中化學(xué)成分眾多，雖然目前多以倍半萜類成分青蒿素含量作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[22]。然而，除了倍半萜類成分外，青蒿中還存在黃酮類成分、有機(jī)酸類成分等等[23]，青蒿的抗腎陰虛型GIOP 的機(jī)制可能與抗氧化有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，倍半萜類成分、黃酮類成分、有機(jī)酸類成分均存在一定的抗氧化效果[24-27]，青蒿的抗腎陰虛型GIOP 的機(jī)制可能與抗氧化有關(guān)。因此，研究青蒿是否在抗OP 方面存在作用，青蒿中哪種單體成分在其抗OP 的過程中起主要作用值得進(jìn)一步探究。

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，初步篩選出了青蒿抗腎陰虛型GIOP 的98 個(gè)共同靶點(diǎn)，通過拓?fù)浞治?，篩選出了17 個(gè)核心靶點(diǎn)。GO 分析和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)這些共同靶點(diǎn)參與了多個(gè)生物學(xué)過程，且參與PI3K/AKT，IL-17，AGE/AGE，MAPK 等多個(gè)信號(hào)通路，其中PI3K/AKT 信號(hào)通路上富集的共同靶點(diǎn)最多。研究表明，PI3K/AKT 信號(hào)通路可通過影響成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制OP 的發(fā)生[28]。本研究體外實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)青蒿可以促進(jìn)DEX損傷的成骨細(xì)胞的增殖和分化，激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，促進(jìn)AKT 的磷酸化，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果，為后續(xù)青蒿抗GIOP 研究提供了科學(xué)依據(jù)。