菌落濃度對肉桂酸鉀及苯甲酸鈉抑菌效果影響的分析

余春平，馬齊兵

（武漢能邁科實業(yè)有限公司，湖北 武漢 430000）

食品防腐劑是一類可防止食品在貯存、流通過程中受到微生物增殖而引起變質(zhì)的化合物，大部分防腐劑僅具有抑制微生物生長的作用，無殺菌作用，因此食品中初始菌落總數(shù)的高低可能會影響防腐劑的抑制作用。

肉桂酸又名桂皮酸、3 - 苯丙烯酸，是中藥肉桂的有效活性成分。肉桂酸具有良好的抑菌、抗腫瘤、消炎等活性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)中。肉桂酸幾乎不溶于水，實際應(yīng)用時常使用鉀鹽，即肉桂酸鉀[1]。

采用天然抑菌劑和防腐劑對食品進(jìn)行防腐保鮮是食品加工過程中的常用手段，食品預(yù)處理也是重要的環(huán)節(jié)。苯甲酸鈉和山梨酸鉀因價格低廉且具有廣譜的抑菌效果，食品行業(yè)將其作為首選防腐劑[2]，以大腸桿菌為指示菌，以天然抑菌物質(zhì)肉桂酸鉀、傳統(tǒng)防腐劑苯甲酸鈉為例，就初始菌落濃度對抑菌效果的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

大腸桿菌（CMCC（B） 44103）；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，奧博星生物提供；75%乙醇、95%乙醇，武漢興和達(dá)商貿(mào)有限公司提供；氫氧化鈉、氯化鈉，天力化學(xué)試劑公司提供；苯甲酸鈉，萬邦化工公司提供；肉桂酸鉀，武漢能邁科實業(yè)有限公司提供。

BBS-DDC 型超凈工作臺，歐萊博科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；DGL-35B 型高壓蒸汽滅菌鍋、FA1004 型電子天平，力辰儀器公司產(chǎn)品；DHP-360 型恒溫培養(yǎng)箱，永光明醫(yī)療儀器公司產(chǎn)品；SZ-93 型自動雙重純水蒸餾器，亞榮生化儀器公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化培養(yǎng)

以大腸桿菌為試驗指示菌，按許春芳等人[1]大腸桿菌活化培養(yǎng)的方法制備工作菌種。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、生理鹽水、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA） 制備方法參考GB/T 39101—2020。

1.2.3 不同濃度菌懸液的制備

（1） 無菌操作下取適量工作菌種溶解于100 mL NB 中，混合均勻，得大腸桿菌菌懸液。

（2） 預(yù)先按照GB 4789.2 中的操作方法進(jìn)行大腸桿菌的菌落計數(shù)，于波長600 nm 處測定各濃度菌懸液的吸光度，根據(jù)對應(yīng)的菌落計數(shù)值與吸光度建立相關(guān)性。根據(jù)相關(guān)性，將菌懸液調(diào)整至一定吸光度。

（3） 將上述菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至10-1，10-2，10-3，制備成不同濃度菌懸液1（5×106CFU/mL），2（5×107CFU/mL），3（5×108CFU/mL）、4（5×109CFU/mL） 備用。

1.2.4 防腐劑溶液的配制

用生理鹽水配制80 g/kg 苯甲酸鈉、肉桂酸鉀溶液；將2 組防腐劑用生理鹽水逐級稀釋至40 g/kg，10 g/kg。于121 ℃下高溫滅菌15 min，備用。

1.2.5 檢測平板制備

將滅菌后的NA 培養(yǎng)基冷卻至45～50 ℃，放置到50 ℃水浴鍋中備用，使用前表面噴上酒精，移入超凈臺；將制備的不同濃度菌懸液（按照1%添加量） 加入到NA 中制備成工作NA，緩慢地?fù)u勻避免產(chǎn)生氣泡，用滅菌的容器量取20 mL 工作NA 緩慢倒入滅菌平皿，輕輕搖動使之鋪平，不能產(chǎn)生氣泡，待冷卻凝固后備用。

1.2.6 測定

用打孔器在工作平板上等距離打3 個孔（6 mm），量取樣品20 μL，緩慢加入到孔中，每個樣品做2 個平行。將平板移入4～6 ℃冰箱擴散2 h，取出平板放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 或至抑菌圈清晰，測量抑菌圈的直徑，取平均值[3-4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌效果

在菌懸液濃度為3（5×108CFU/mL） 的培養(yǎng)基中，分別統(tǒng)計不同濃度下肉桂酸鉀、苯甲酸鈉抑菌圈直徑。

肉桂酸鉀、苯甲酸鈉抑菌圈見圖1，不同含量肉桂酸鉀、苯甲酸鈉對大腸桿菌抑菌作用見圖2。

圖1 肉桂酸鉀、苯甲酸鈉抑菌圈

圖2 不同含量肉桂酸鉀、苯甲酸鈉對大腸桿菌抑菌作用

由圖1 可知，在該菌懸液含量下，除10 g/kg 的肉桂酸鉀和苯甲酸鈉無抑菌圈，其余2 個含量均有抑菌圈，且肉桂酸鉀抑菌圈直徑在2 種含量下均大于苯甲酸鈉，因此推測在相同菌落數(shù)條件下，同等含量的肉桂酸鉀抑菌性大于苯甲酸鈉。

因10 g/kg 時無抑菌圈，80 g/kg 時太高，選擇40 g/kg 作為固定濃度（濃度4%），檢測不同濃度菌落數(shù)對肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌性影響。

2.2 不同濃度菌懸液對肉桂酸鉀、苯甲酸鈉的抑菌性影響

繪制不同濃度大腸桿菌下4%濃度肉桂酸鉀和苯甲酸鈉的抑菌圈大小折線圖。

不同菌落濃度下肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌效果見圖3。

圖3 不同菌落濃度下肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌效果

由圖3 可知，隨著菌落濃度的增加，肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌圈直徑均減小，抑菌能力下降，且在菌落濃度為4（5×109CFU/mL） 時，抑菌圈消失抑菌效果較弱，證明肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌性和菌落初始數(shù)具有相關(guān)性，且初始菌落數(shù)越高其抑菌性越低。在菌落濃度低于4（5×109CFU/mL） 時，肉桂酸鉀的抑菌性均強于苯甲酸鈉，推測肉桂酸鉀對初始菌落數(shù)的耐受性更強。

2.3 不同菌懸液濃度對肉桂酸鉀、苯甲酸鈉復(fù)配物抑菌效果的影響

防腐劑在實際應(yīng)用中會根據(jù)食品性質(zhì)進(jìn)行復(fù)配，以求達(dá)到更好的防腐效果。復(fù)配后的防腐劑具有綜合防腐性好、價格低廉等優(yōu)點。研究驗證了肉桂酸鉀與苯甲酸鈉復(fù)配對不同濃度菌懸液抑菌效果的影響。根據(jù)國家食品安全法規(guī)定，肉桂酸鉀屬于食品用香料，除GB 2760 規(guī)定不能使用食品香料目錄中的食品，其他食品均可按照需求適量添加，因此肉桂酸鉀與苯甲酸鈉進(jìn)行復(fù)配，可按照需求制定肉桂酸鉀的量[5]。

將肉桂酸鉀與苯甲酸鈉按照1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1 的比例進(jìn)行復(fù)配，得到5 組復(fù)配物。按照上述抑菌圈測定方法，測定在不同濃度大腸桿菌菌懸液濃度下4%濃度的5 組復(fù)配物的抑菌圈大小。

不同濃度菌懸液下5 組復(fù)配物的抑菌效果見表1，不同濃度菌懸液下5 組復(fù)配物的抑菌效果柱形圖見圖4。

表1 不同濃度菌懸液下5 組復(fù)配物的抑菌效果/CFU·mL-1

圖4 不同濃度菌懸液下5 組復(fù)配物的抑菌效果柱形圖

由表1 和圖4 可知，5 組復(fù)配物在不同菌落濃度下，其抑菌效果均呈現(xiàn)下降趨勢，且在濃度為4（5×109CFU/mL） 時均無抑菌圈。在濃度為1（5×106CFU/mL） 時，復(fù)配比例為2∶1 時抑菌效果最佳；當(dāng)濃度為2（5×107CFU/mL） 時，復(fù)配比例為3∶1 時其抑菌效果最佳。從試驗數(shù)據(jù)推斷，雖復(fù)配比例和抑菌效果不呈正比例關(guān)系，但肉桂酸鉀在復(fù)配時其添加比例超過50%時，在不同濃度菌液下的抑菌性更高。

3 結(jié)論

通過檢測肉桂酸鉀及苯甲酸鈉對不同菌落濃度大腸桿菌的抑菌率，確定了菌落濃度對肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌性影響具有相關(guān)性：隨著菌落濃度升高，肉桂酸鉀和苯甲酸鈉抑菌性相對減弱；另外，當(dāng)防腐劑濃度一致時，肉桂酸鉀對大腸桿菌的抑菌性優(yōu)于苯甲酸鈉。研究為肉桂酸鉀的抑菌性能提供了試驗依據(jù)，并驗證了菌落濃度越高，對防腐劑抑菌效果的影響越大，防腐效果變差。為肉桂酸鉀和防腐劑應(yīng)用在食品中提供了數(shù)據(jù)參考，給“控制初始菌落數(shù)是食品防腐保鮮工藝中的重要因素”提供了依據(jù)。在實際應(yīng)用中，肉桂酸鉀可配合苯甲酸鈉進(jìn)行使用，其復(fù)配比例按照肉桂酸鉀含量大于50%進(jìn)行復(fù)配，其抑菌效果更好。