宏基因組二代測序在器官移植后肺部感染中的應(yīng)用進展

董志蘭 周開華

肺部感染是一種發(fā)病率及死亡率均較高的疾病,而實體器官移植(solid organ transplantation,SOT)受者由于手術(shù)應(yīng)激、長期口服免疫抑制劑等危險因素的存在,術(shù)后極易發(fā)生肺部感染,且一旦發(fā)生,病情進展迅速,病死率高[1]。移植受者免疫力低下,容易發(fā)生機會性感染、混合感染及罕見細菌感染,可急劇加重病情并導(dǎo)致不良后果,因此快速、準確的微生物學(xué)診斷對于早期治療、改善預(yù)后極其重要。常規(guī)的病原體檢測方法包括肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)培養(yǎng)、血培養(yǎng)、痰培養(yǎng)及涂片、抗原抗體檢測、病毒核酸檢測等,而這些方法的靈敏度、特異度不能滿足臨床需求。隨著技術(shù)的發(fā)展,宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)作為一種新型檢測技術(shù),越來越多地應(yīng)用于感染性疾病的診治,尤其適用于復(fù)雜、罕見、新型和非典型病原體的檢測[2],特別是對于某些RNA病毒,mNGS可能是唯一可行的檢測方法[3]。本文將對mNGS在實體器官移植后肺部感染診治方面的應(yīng)用情況、研究進展,以及面臨的挑戰(zhàn)進行綜述。

一、器官移植術(shù)后肺部感染現(xiàn)狀

上個世紀60年代開始的實體器官移植,在提高生活質(zhì)量的前提下延長壽命,現(xiàn)仍然是許多終末期器官疾病患者的重要治療選擇[4]。隨著外科技術(shù)的不斷提高,由手術(shù)引起的相關(guān)并發(fā)癥明顯減少,但供體本身攜帶致病菌、長期服用免疫抑制劑及受者自身疾病較多等因素使感染率大大增加。即使采用各種預(yù)防和治療措施,感染仍然是SOT受者發(fā)病和死亡的主要原因[5],而肺臟是各種并發(fā)癥最容易發(fā)生的部位[6],極易進展為重癥肺炎,甚至引起多器官功能不全。器官移植受者免疫功能低下,可能會出現(xiàn)特殊病原體甚至是罕見致病菌感染,具有常見病原體的非典型性表現(xiàn),并且更容易合并混合感染。這類感染的評估是耗時的,也是資源密集型的,需要大量的微生物診斷試驗來確定病原體或排除感染。而傳統(tǒng)病原體檢測的檢出率低,培養(yǎng)耗時長,根據(jù)臨床相關(guān)研究,高達60%的感染性疾病的病原體仍然未知[7],這給臨床醫(yī)師帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

二、mNGS技術(shù)概述

mNGS作為一種新型的高通量檢測技術(shù),可廣泛分析臨床樣品的微生物組,具有標(biāo)本檢測直接、病原體覆蓋廣等優(yōu)點。2014年有研究報告了1例14歲病因不明的病例,病程中反復(fù)發(fā)熱、抽搐,且伴有腦積水,通過mNGS檢測出鉤端螺旋體病,經(jīng)過精準治療后得到改善,為mNGS在臨床的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[8]。mNGS對常見病原體的檢出率高,同時在罕見或未知病原體檢測方面也具有一定優(yōu)勢,現(xiàn)已成為病因診斷中常用且有效的診斷方法[9-11]。隨著檢測技術(shù)的不斷提高,mNGS可用于篩選致病菌的耐藥突變信息,協(xié)助合理選擇抗生素,指導(dǎo)臨床精準治療[12]。

三、mNGS在器官移植后肺部感染中的應(yīng)用進展

1 細菌感染

細菌是SOT后肺部感染的常見病原體之一,SOT術(shù)后早期感染為醫(yī)院獲得性肺炎,常見病原體主要是腸桿菌屬,尤其是不動桿菌屬、銅綠假單胞菌、厭氧菌;在SOT后一年以上的肺部感染多為社區(qū)獲得性肺炎,流感嗜血桿菌、機會性病原體感染。對于細菌常規(guī)的病原體檢測方法是涂片和培養(yǎng),需要較長時間才能獲得結(jié)果,且培養(yǎng)需要特定的條件,覆蓋的病原體范圍有限,罕見菌檢出陽性率低。SOT患者屬于免疫力低下人群,肺部感染時病原體復(fù)雜多樣,進展迅猛,極易造成進行性缺氧、急性呼吸衰竭,因此快速識別病原體是治療成功的關(guān)鍵。Lian等[13]的研究顯示,mNGS在早期肺移植患者中的檢出率高于常規(guī)微生物檢測(88.24%vs76.47%)。Ju等[14]的一項回顧性研究表明,mNGS檢測顯示肺移植后肺部感染最常見的病原體是細菌,并且能在較短的時間內(nèi)識別病原菌,為肺部感染的診斷提供更準確、及時的信息。Parize[15]報道了一項使用mNGS檢測免疫缺陷患者樣本的多中心前瞻性研究,結(jié)果顯示mNGS的檢出率(36%vs11%)和陰性預(yù)測值均高于常規(guī)培養(yǎng)。Li等[16]在免疫力低下患者中比較了mNGS和常規(guī)檢測,結(jié)果顯示mNGS對細菌感染(92.9%vs50%)和合并感染(68.8%vs48.3%)的敏感度要高得多。Huang等[17]對137例免疫力低下患者進行了回顧性研究,結(jié)果顯示mNGS識別肺部感染病原菌顯著高于傳統(tǒng)檢測方法(89%vs25.73%)。結(jié)核分枝桿菌是一種特殊的細菌,范琳教授團隊對納入的205例疑似結(jié)核病患者進行了回顧性分析,比較了mNGS與其他診斷方法(抗酸染色涂片、培養(yǎng)、X-pert)對結(jié)核病的診斷價值,結(jié)果顯示mNGS診斷肺結(jié)核的敏感度高于培養(yǎng)法(59%vs26%)和涂片法(59%vs15%),但與Xpert(59%vs52%)無顯著差異[18]。有研究探討了BALF-mNGS對肺結(jié)核的診斷價值,研究結(jié)果顯示BALF-mNGS的敏感度顯著高于BALF涂片法和BALF培養(yǎng)法。TB-DNA和Xpert檢測在肺結(jié)核診斷中起著重要作用,但對于免疫力低下人群的肺結(jié)核多為混合感染,診斷困難且病情進展較快,mNGS作為一種新型檢測手段,在肺結(jié)核的診斷中具有其獨特優(yōu)勢。

2 病毒感染

SOT受者免疫力低下,一些潛在的病毒易發(fā)生機會性感染,同時病毒易發(fā)生變異,臨床表現(xiàn)多樣,診治困難,而常規(guī)檢測方法的病毒培養(yǎng)、核酸檢測都是基于已知病原體,對特殊及未知的病毒都難以檢出。而mNGS可獲得完整的基因組序列,不僅可檢測各種病毒,同時還能監(jiān)測病毒變異。一項回顧性研究納入了32例免疫功能低下患者和21例免疫功能正常的肺炎患者,同時接受mNGS和常規(guī)檢測,結(jié)果提示,在免疫功能低下患者中最常見的病原體為巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV),而EB病毒、呼吸道合胞病毒和腸道病毒也較為常見[19]。CMV感染后可直接導(dǎo)致CMV綜合征或終末器官病變,也可影響免疫系統(tǒng)功能,增加被其他病原體和病毒感染的風(fēng)險,有研究表明免疫力低下患者更多的是混合感染,細菌-真菌-病毒感染是免疫功能低下患者中最常見的組合感染[20]。Peng[21]報道了60例嚴重免疫缺陷患者疑似肺炎,并分析了mNGS與常規(guī)檢測對肺炎的診斷療效,最后得出結(jié)論,mNGS對肺部的病毒感染比常規(guī)檢測更有效。Lewandowska[22]收集了不明病原體肺移植患者的呼吸樣本進行重新分析,并且對mNGS檢測出的病原菌進行PCR驗證,mNGS在4例肺移植患者中檢測到病毒感染,而多重PCR檢測均為陰性,凸顯了mNGS在多項臨床檢測均為陰性的免疫功能低下患者的病原體檢測中具有優(yōu)勢。一例關(guān)于肺移植術(shù)后感染的報道顯示,由于人鼻病毒與人腸道病毒序列同源性高,且缺乏特異性引物,多重PCR結(jié)果顯示人鼻病毒感染,而mNGS準確鑒定為人腸道病毒C104感染,顯示了mNGS的無偏倚優(yōu)勢和識別罕見病毒株的能力[23]。Ren等[24]報道新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)的發(fā)現(xiàn)經(jīng)過,在5例重癥肺炎患者的mNGS檢測中均發(fā)現(xiàn)未知β-CoV,其核酸相似度為99.9%,根據(jù)基因測序確認為2019-nCoV。mNGS可快速識別病原體,為疫情防控和監(jiān)測起到了重要的作用。新冠病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)已升級為全球大流行,如果感染者的免疫功能正常,病毒一般可以自行消除;而SOT受者免疫功能低下,一般不能及時清除病毒,一旦合并感染時可能導(dǎo)致重癥肺炎甚至?xí)鹚劳?。因?mNGS在SOT受者病毒感染的診斷中也具有廣闊前景。

3 真菌感染

真菌感染具有危害性強、無典型臨床表現(xiàn)的特點,且診斷方法缺乏特異性,導(dǎo)致肺部發(fā)生真菌感染時難以診斷,漏診率較高,而SOT受者屬于免疫抑制個體,發(fā)生侵襲性真菌感染(invasive fungal infections,IFIs)的風(fēng)險更高[25],早期準確檢出病原菌對于改善預(yù)后十分重要。傳統(tǒng)的真菌診斷依賴于組織染色、體外培養(yǎng)、血清學(xué)檢測,這些方法不靈敏且耗時,且大多數(shù)抗原抗體檢測缺乏敏感度和特異度;在免疫功能低下的患者中,IFIs的診斷更困難,此類患者癥狀更為隱蔽,而且免疫反應(yīng)被抑制后,血清學(xué)檢測敏感度降低,故而傳統(tǒng)方法只能識別相對狹窄的真菌類別,費時且容易漏檢,同時也導(dǎo)致了經(jīng)驗廣譜抗菌藥物的濫用。mNGS依賴于對樣本中已經(jīng)存在的DNA進行測序,可以在短時間內(nèi)完成,相關(guān)研究顯示mNGS比常規(guī)檢測到更多的真菌種類,具有更高的敏感度和特異度,在免疫力低下患者中,曲霉菌和耶氏肺孢子菌是最常見的真菌[26]。Lu等[27]探討了mNGS在耶氏肺孢子菌診斷中的應(yīng)用價值,發(fā)現(xiàn)mNGS的靈敏度和檢測速度均優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。根據(jù)一項針對HIV陰性免疫功能低下患者的研究,BALF-mNGS診斷肺孢子菌的敏感度和特異度分別為97.40%和85.12%,明顯高于BALF鏡檢和血清G試驗,且平均檢測時間也明顯短于常規(guī)方法[28]。Lin對69例疑似肺炎的免疫功能低下患者進行了回顧性分析,結(jié)果顯示mNGS對真菌檢測的診斷準確率高于常規(guī)檢測(78%vs57%),在亞組分子中更顯示了mNGS對肺孢子菌肺炎患者具有較高的敏感度(100%vs28%)[19]。Zhan等將62例mNGS曲霉菌陽性患者分為兩組,免疫功能低下患者侵襲性肺曲霉菌病診斷的符合率明顯高于非免疫功能低下患者[29]。綜上所述,mNGS在鑒定真菌特別是在非典型真菌類群方面也具有較好的檢測效能。

4 其他病原體感染

SOT受者長期服用免疫抑制劑,易出現(xiàn)各種機會性感染,Ramirez等[30]研究顯示,免疫功能正常組發(fā)生諾卡菌、非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)感染概率明顯低于免疫功能低下組。諾卡菌是一種罕見的機會性感染,主要影響肺部,它還可能導(dǎo)致其他器官的感染。Luu等[31]報道了1例影像學(xué)提示肺部多部位病變,通過血液mNGS檢出諾卡菌感染,與肺活檢病理結(jié)果一致,mNGS可以無創(chuàng)、及時地識別病原菌,有助于諾卡菌的臨床診斷和治療。NTM的發(fā)生可能與肺部基礎(chǔ)疾病、器官移植后使用的免疫抑制劑有一定相關(guān)性,隨著科技的進步,器官移植以及免疫抑制劑應(yīng)用越來越多,NTM患病率不斷升高,mNGS是菌種鑒定分辨率最高的手段,在NTM疾病的診斷中發(fā)揮著重要的作用。軍團菌肺炎也是一種罕見的肺部感染,病死率很高,宿主對軍團菌的主要防御機制是細胞免疫。隨著免疫治療的興起,免疫抑制藥物對軍團菌肺炎發(fā)病率的影響不容忽視[32]。mNGS技術(shù)可以在識別軍團菌感染的同時還能對合并感染病原體進行鑒定,特別是對易合并多種病原體感染的免疫抑制患者的抗感染治療具有關(guān)鍵的指導(dǎo)作用[33]。Wang等[34]研究了mNGS在混合型肺部感染中的應(yīng)用,結(jié)果顯示mNGS的敏感度遠高于常規(guī)檢測(97.2%vs13.9%),且可以檢測到范圍更廣的病原體種類。器官移植患者肺部感染的病原體是復(fù)雜多樣的,與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比,mNGS在檢測特殊病原體、新發(fā)病原體、復(fù)雜混合感染病原體方面更具優(yōu)勢,有助于臨床診治。

四、存在的問題與挑戰(zhàn)

mNGS技術(shù)理論上能夠無偏倚地檢測各種微生物,但在臨床實際應(yīng)用于肺部感染的診斷中還存在一些問題。(1)背景核酸干擾:mNGS檢測利用鳥槍測序原理,檢測到的讀數(shù)大多來自人類宿主,因此限制了病原體檢測的整體敏感度,難以區(qū)分定植菌和致病菌。(2)污染:mNGS的步驟多,影響因素也就隨之增多,在樣品采集、運輸、處理、上機測序等各個環(huán)節(jié)都容易受試劑、容器、環(huán)境的微生物核酸污染[35]。(3)缺乏統(tǒng)一標(biāo)準:病原體檢測沒有統(tǒng)一的閾值,不同的測序平臺使用不同的數(shù)據(jù)庫,研發(fā)、實驗和解釋方面的專家也不盡相同,最終的結(jié)果由于缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準會有所不同。(4)存在假陽性、假陰性:由于大多數(shù)RNA病原體容易降解,運輸和保存不當(dāng)可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。mNGS檢測可以獲得幾乎所有的病原體信息,但有些病原體不致病,這增加了假陽性率,因此檢測結(jié)果應(yīng)由臨床醫(yī)生和微生物學(xué)家結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他微生物檢測進行判定。(5)測序成本高:mNGS價格昂貴,臨床可及性有待提高,重復(fù)性低;臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)患者具體情況評估是否應(yīng)用mNGS檢測。(6)病原體基因組數(shù)據(jù)庫不完善:mNGS檢測結(jié)果需要與已建立的微生物基因組數(shù)據(jù)庫進行對比,但目前沒有統(tǒng)一、全面、準確的參考數(shù)據(jù)庫,可能會遺漏罕見病原體。(7)細胞內(nèi)細菌和部分真菌檢出率較低:對于一些細胞壁比較厚的病原(如結(jié)核桿菌、軍團菌、布魯氏菌、真菌等),常規(guī)核酸提取方法效能低,需要采用一些特殊的破壁方法,否則會存在漏檢。(8)耐藥基因檢出率低:mNGS閱讀核酸序列相對較短,不容易獲得耐藥基因的全長序列,且耐藥基因之間存在一致性,因此存在無法檢測耐藥基因、無法提供病原體藥敏結(jié)果等問題。

五、小結(jié)與展望

器官移植后肺部感染的患者免疫功能低下,為了縮短經(jīng)驗治療時間,改善預(yù)后,應(yīng)盡早送檢mNGS以發(fā)現(xiàn)復(fù)雜、罕見條件致病菌,同時注意檢測結(jié)果必須結(jié)合常規(guī)檢測結(jié)果、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特點等加以甄別,不能盲目全覆蓋。新型病原體靶向測序技術(shù)(targeted next-generation sequencing, tNGS)的出現(xiàn),不依賴傳統(tǒng)微生物培養(yǎng),直接擴增臨床樣品中的核酸,接著進行高通量測序,再與參考數(shù)據(jù)庫進行比對分析,具有病原譜范圍準確,測序成本經(jīng)濟低的優(yōu)點。相信隨著檢測技術(shù)的不斷完善和發(fā)展,mNGS的測序成本將會降低,對于耐藥基因能準確識別,并形成統(tǒng)一的判斷標(biāo)準,必將為急危重癥和疑難感染患者提供準確的病原體診斷依據(jù),協(xié)助臨床醫(yī)生的診療,從而提高治愈率、減少重癥率、降低死亡率,挽救更多患者的生命。