阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征大鼠實驗干預模型構(gòu)建方法的研究進展

余鳴濤 詹 璐

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnoea syndrome，OSAHS）指的是在睡眠中反復出現(xiàn)上呼吸道阻塞，從而導致氧飽和度反復下降和碎片化睡眠，其特征性的缺氧方式為慢性間歇性缺氧[1]。OSAHS 在2～8 歲兒童中的患病率約為2%，發(fā)病主要與上呼吸道阻塞和塌陷有關，導致夜間氣體交換發(fā)生不同程度的改變。實驗干預大鼠模型是目前OSAHS 研究領域主要采用的模型，其中主要分為經(jīng)典的慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）模型和近年來進展迅速的上呼吸道阻塞模型，對于大鼠OSAHS 模型建立，特別是對于兒童OSAHS 大鼠模型建立的研究很少。本文主要總結(jié)了幾種近年具有代表性的OSAHS 實驗干預大鼠模型造模方法，以期為兒童OSAHS 大鼠模型的建立提供思路。

1 CIH 模型

CIH 模型指的是利用間歇性低氧來模擬阻塞性睡眠呼吸暫停中反復發(fā)生的短暫缺氧和復氧。暴露于間歇性低氧的大鼠表現(xiàn)出血壓增高和左心室肥大，與人類OSAHS 患者中的病理相符合。CIH 大鼠模型在每次低氧事件中都會引起“憋醒”，最終破壞整體睡眠結(jié)構(gòu)，抑制快眼動睡眠并誘發(fā)“困倦”，這與人類OSAHS 患者的臨床表現(xiàn)非常相似，因此CIH 大鼠模型常用于模擬臨床中的OSAHS 人類患者[2]。

1.1 低氧艙中氮氧循環(huán)的方法 將大鼠置于可調(diào)節(jié)氣體濃度的低氧艙中，先在低氧艙中加氮氣至氧氣濃度為7%，維持缺氧1 min，加氧氣至氧濃度為20%，維持復氧0.5 min。上述步驟為一循環(huán)，每個循環(huán)1.5 min，每天09∶00～17∶00 重復上述循環(huán)。整個試驗持續(xù)56 d。第0、14、28、42 和56 天監(jiān)測大鼠血壓，以血壓大于150 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）作為成功建立動物模型的標準[3-4]。

此種類型的模型建立較為簡單，在造模試驗操作中的可行性較高，符合OSAHS 患者間歇缺氧和復氧的生理特點。但本試驗只是考慮了單一的間歇性缺氧的因素。研究表明，OSAHS 與中樞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的區(qū)別在于上呼吸道阻塞的因素，但此造模方法只是通過模擬間斷的低氧血癥從而模擬OSAHS 的病理生理，未模擬出上呼吸道阻塞的因素。同時，雖然普遍認為OSAHS 會導致高血壓，但血壓升高是一個特異性低的指標，將血壓升高設立為證明造模成功的標志是否準確尚無定論[2]。在臨床中，患者年齡段、性別、基礎身體條件的不同往往會導致OSAHS 的發(fā)生率、癥狀及預后有很大的區(qū)別[5]。此外，OSAHS 的一項重要特征為其發(fā)生在睡眠中的間歇性缺氧。已經(jīng)有學者指出，OSAHS 的這種特殊表現(xiàn)方式與神經(jīng)機制有關，CIH 模型雖然可以模擬睡眠紊亂，但需要進行多導睡眠監(jiān)測等評估睡眠狀態(tài)的方式證明[6]。

1.2 睡眠中的氮氧循環(huán)方法 將大鼠置于可調(diào)節(jié)氣體濃度的低氧艙中，12 h/12 h 光暗循環(huán)。向低氧艙內(nèi)通氮氣，至艙內(nèi)氧濃度為9%，持續(xù)1.5 min，氧濃度在之后1.5 min 內(nèi)逐漸恢復到21%。上述操作為1 個循環(huán)，每次循環(huán)持續(xù)時間為3 min。在大鼠睡眠時間中不斷重復上述循環(huán)，每天8 h，每周7 d，持續(xù)3 周。通過觀察CIH 大鼠左心室舒張壓降低和冠狀動脈阻力增加，冠狀動脈內(nèi)皮細胞損傷和內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙，冠狀血管中內(nèi)皮縮血管肽（ET）-1 和內(nèi)皮素A 受體（endothelin A receptor）的表達增加來判斷大鼠實驗模型建立成功[7]。

此種造模方法主要控制了“睡眠”的變量，更符合OSAHS 的病理生理特征。造模成功的判定標準更具體客觀全面，與人類患者心室重構(gòu)、心肌細胞損傷的臨床病理及OSAHS 引發(fā)冠狀動脈高壓及左心室重構(gòu)的表現(xiàn)相對應，從而判斷其模型成功建立。缺陷在于大鼠睡眠狀態(tài)的準確性難以保證，試驗中并沒有一個定量或定性的指標可以判斷大鼠的睡眠狀態(tài)，通過嚙齒類動物的晝夜規(guī)律來進行粗略的睡眠與清醒的判定不夠準確，衡量阻塞性睡眠呼吸暫停嚴重程度的關鍵指標是呼吸暫停低通氣指數(shù)（AHI），當患者夜間大部分時間處于清醒狀態(tài)時，AHI 會產(chǎn)生極大的影響，導致臨床記錄數(shù)據(jù)的錯誤而影響醫(yī)生的評估，在大鼠模型中亦是如此，因此在造模中也應當將睡眠因素納入考量范圍內(nèi)[8]。

1.3 智能低氧艙氮氣與空氣循環(huán)輸入方法 將大鼠置于有智能集成系統(tǒng)控制的低氧艙中（同時裝有氣體傳感器、氧氣檢測儀），設定空氣和氮氣的通氣壓力0.2 MPa，空氣流量300 L/h，氮氣流量500 L/h。先通入空氣至艙內(nèi)氧濃度為21%，維持40 s，再通入氮氣，使艙內(nèi)氧濃度為5%，維持40 s，緩沖時間各5 s。上述步驟為一循環(huán)，每次循環(huán)時間為80 s，相當于每小時36 個循環(huán)，從而模擬每小時36 次的低氧事件，與臨床中的重度OSAHS 程度相對應。上述循環(huán)每天持續(xù)8 h，時間為9∶00～17∶00，連續(xù)飼養(yǎng)9 周。每日實驗開始前都進行低氧濃度測定以減少實驗誤差。當大鼠肝臟組織病理切片觀察到中央靜脈區(qū)、肝血竇及肝細胞索區(qū)大量脂質(zhì)積聚、白色的脂肪空泡形成大小不一；肝小葉和門管區(qū)均肝細胞脂質(zhì)染紅顯著來確認OSAHS 大鼠模型造模成功[9]。

本造模方法的創(chuàng)新點是其通過改變低氧事件的發(fā)生頻率從而實現(xiàn)了OSAHS 大鼠模型的可分度，OSAHS 診斷標準中的一條是AHI≥5，AHI 5～15 為輕度，16～30 為中度，＞30 為重度。此外，其采用了智能集成系統(tǒng)的低氧艙，并設定了與通氣對應的艙內(nèi)氧氣濃度，大大降低了人工成本。低氧艙內(nèi)氣體改變的緩沖時間控制在5 s 以內(nèi)，確保了試驗的精確性。在低氧艙中通入的氣體為空氣及氮氣混合輸入，總實驗事件達9 周，更符合大多數(shù)OSAHS 患者的自然生態(tài)和生理特性。這些操作可能使造模試驗的環(huán)境與臨床中人體的環(huán)境條件更為相似。但試驗對于設備的要求較苛刻，需要可編程邏輯控制器、電腦自動控制和自動數(shù)據(jù)采集裝置，主機與低氧艙和氣路控制系統(tǒng)之間需要統(tǒng)一協(xié)調(diào)工作。而且本試驗忽略了睡眠與上呼吸道坍塌這兩種重要的神經(jīng)和解剖因素。本質(zhì)上，該試驗仍是以缺氧為核心，包括后期評估造模成功也是利用缺氧對肝臟損傷的機制判斷。但OSAHS 作為一種累及多系統(tǒng)和器官的綜合征性疾病，將致病因素局限于缺氧，忽略諸如肥胖、上氣道阻塞、睡眠等因素，不夠嚴謹。另外，本試驗僅對低氧艙環(huán)境進行氧濃度檢測，缺乏對大鼠的血氧飽和度定期檢測，因此無法準確判斷大鼠的血氧飽和度降低到了90%以下[5]。

總的來說，CIH 被認為是OSASH 毒性較大的刺激之一，CIH 模型是目前應用最廣泛的OSAHS 模型。CIH 模型可調(diào)節(jié)間歇性低氧的濃度、頻率和復氧時間，從而誘發(fā)不同程度的OSAHS[10]。此模型最早由Fletcher 等人在1992 年的一項研究中率先建立，發(fā)現(xiàn)在人類OSAHS 和大鼠CIH 中都存在全面性高血壓的共同表型，從而為大鼠模型作為研究OSAHS 病理后遺癥的提供了早期證據(jù)[11]。但CIH 模型無法準確控制大鼠的上氣道壓力，無法模擬氣道阻塞或塌陷的情況，以及無法模擬高碳酸血癥。OSAHS 是發(fā)生于睡眠中的間歇性低氧，而CIH 模型不能精確地在大鼠睡眠中給予CIH 刺激，制造睡眠呼吸紊亂模型。不同CIH 造模試驗對于復氧氣體選擇不同，有研究稱用空氣進行復氧更符合OSAHS 患者的日常生理情況，但目前尚無證據(jù)表明用空氣或氧氣復氧會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響[12]。

2 上呼吸道阻塞模型

上呼吸道阻塞模型指的是圍繞阻塞性睡眠呼吸暫停所伴隨的上呼吸道塌陷和胸腔負壓來建立大鼠模型，這是CIH 模型無法模擬的。

2.1 透明質(zhì)酸注射方法 大鼠軟硬腭交界處是產(chǎn)生OSAHS 的最佳注射部位，不會完全堵塞呼吸道，導致呼吸暫停、間歇性缺氧和睡眠中覺醒，并誘發(fā)與人類OSAHS 相同的胸內(nèi)負壓變化。試驗開始時，大鼠腹腔注射麻醉，在模型組大鼠軟硬腭交界處注射0.1 mL透明質(zhì)酸鈉凝膠（15 mg/mL）1 次，建立人為上呼吸道阻塞，飼養(yǎng)3 個月。模型大鼠在睡眠期間出現(xiàn)嗜睡、疲勞、打鼾的表現(xiàn)，負壓持續(xù)時間高于正常時間，發(fā)生4～10 次/h 的呼吸暫停事件；模型組的血氧分壓、血氧含量和血氧飽和度顯著低于對照組；通過光鏡和電鏡觀察到模型組大鼠氣管表面覆蓋復雜的柱狀纖毛上皮細胞，皮下黏膜輕度水腫，并且周圍的氣管腺（漿液腺）增多，分泌物滯留，心肌細胞排列紊亂，出現(xiàn)空泡變性，部分心肌細胞出現(xiàn)濃縮和凝固性壞死，伴有彌漫性腫脹、肌漿溶解、橫紋不清、間質(zhì)血管充血，表明心肌肌原纖維受損，證明造模成功[13]。

此試驗大鼠均造模成功，無感染、無結(jié)節(jié)形成或發(fā)生其他并發(fā)癥，安全性佳。通過在麻醉大鼠咽部注射透明質(zhì)酸鈉以模擬OSAHS 患者睡眠時上氣道阻塞的病理生理模型，建立的模型特征與臨床相符：OSAHS 患者通常具有上呼吸道狹窄的體征（頸圍增大、巨舌癥、扁桃體肥大等），特別是在兒童中，通常存在氣道部分阻塞。

OSAHS 中患者一般表現(xiàn)為總體持續(xù)，局部間斷的上呼吸道反復塌陷，模擬反復的阻塞過程可能是此試驗改良的一個方向。此外，它忽略了不同個體間的上呼吸道張力的差異，造模大鼠會出現(xiàn)4～10 次/h的呼吸暫停，但無法定量控制其變量而模擬不同的分度。在臨床中，常常根據(jù)鼻咽側(cè)位片將腺樣體肥大進行分度，也許可以對大鼠進行同樣的X 線評估而對呼吸道阻塞程度進行分級而研究腺樣體肥大，扁桃體肥大對OSAHS 的分級是未來研究的方向[14]。

2.2 氣管切開術(shù)方法 大鼠肌注麻醉，在垂直平面上切開1.5 cm 的切口后，解剖頸部中線的組織到達氣管，切開氣管，至少10 s 后放置氣管插管（模擬呼吸暫停發(fā)作）。在此過程中，監(jiān)測大鼠氧飽和度。當飽和度降低到85%以下（缺氧期）時，測量聽力指標，同時保證在實驗過程中至少有1 次呼吸暫停使大鼠氧飽和度降低到85%以下，產(chǎn)生呼吸暫停，并立即進行重新測量氧飽和度及聽力水平。通過實驗過程中確保大鼠氧飽和度降低到85%以下，并觀察到至少1次的呼吸暫停，以及發(fā)現(xiàn)模型組大鼠前后聽力水平不一致來驗證模型的成功建立[15]。

氧飽和度在OSAHS 中是一項重要評價指標，把氧飽和度探頭直接伸入氣管內(nèi)以確定在大鼠體內(nèi)有缺氧事件的發(fā)生，符合目前對于OSAHS 的診斷標準，是最為精確評價方式[16]。本試驗1 次或多次的精準氧飽和度下降可能更能模擬輕度窒息患者或重度OSAHS 患者的生理狀態(tài)，然而大多數(shù)的OSAHS 都表現(xiàn)為輕中度。此外，驗證造模成功的方法僅是通過前后氣管中氧飽和度水平和聽力水平判斷，未體現(xiàn)出OSAHS 所致的全身性損害，較局限。OSAHS 是一種慢性疾病，造成的多系統(tǒng)損害需要長期累積[17]。從實驗角度上，本方法對大鼠的創(chuàng)傷性較大，會造成實驗動物的死亡，無法與藥物治療結(jié)合，無法建立可長期觀察的大鼠模型。

2.3 鼻阻塞方法 將大鼠分為對照組、單側(cè)鼻阻塞組和雙側(cè)鼻阻塞組，麻醉后，使用高頻電刀電灼阻塞模型組和單側(cè)鼻阻塞組的左鼻孔，1 周后同樣方法阻塞模型組的右側(cè)鼻孔。對照組大鼠不進行處理。4 周后，大鼠麻醉處死，收集下頜骨，切片行蘇木精-伊紅及免疫組化染色和蛋白質(zhì)印跡法分析。通過觀察到兩組鼻阻塞組大鼠的牙周膜厚度變窄，不連續(xù)，骨小梁紊亂，骨髓腔較大，骨吸收陷窩較單側(cè)組進一步增多，骨吸收陷窩內(nèi)含有破骨細胞；LC3 陽性面積率顯著增大；細胞自噬標記物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增大，sequestosome 1/p62 蛋白水平顯著降低；缺氧誘導因子-1α 蛋白的相對表達量顯著升高來評判造模成功[18]。

此試驗研究的阻塞部位是鼻部氣道，并且分為單側(cè)阻塞組和雙側(cè)阻塞組，在一定程度上實現(xiàn)了病情的分度。試驗造模方式簡潔明確，可操作性強，對探究頜面部與OSAHS 的關系有意義。在驗證造模成功時采用的是通過采取下頜骨的標本進行細胞學和組織學上的測定來論證造模成功，缺少證明大鼠有血氧飽和度下降和缺氧時事件發(fā)生的指標。

總的來說，上呼吸道阻塞模型主要參照OSAHS的病理生理建立。OSAHS 通常有氣道解剖變窄、氣道組織塌陷，從而影響上氣道口徑和導致咽吸氣肌功能反射障礙。肥胖、頜面部或咽部軟組織異常所導致的上氣道解剖口徑縮小，可造成短暫性呼吸暫?；蛲饬繙p少；睡眠開始時氣道肌肉或咽部肌肉活性的降低也會引起短暫性呼吸暫停，這些因素會造成暫時性的缺氧，之后肌肉活性恢復，上氣道重新開放，缺氧隨之解除[19]。上呼吸阻塞模型更貼近兒童OSAHS 狀態(tài)。兒童OSAHS 最常見的因素是腺樣體和扁桃體肥大所致咽部結(jié)構(gòu)異常，從而發(fā)生睡眠期間上氣道阻塞和塌陷[4，17]。但此類模型無法精準控制氣道阻塞的程度，無法對模型進行OSAHS 嚴重程度分度，方法數(shù)據(jù)量化困難，需要手術(shù)，操作復雜，實驗操作所造成的并發(fā)癥較多，如窒息、傷口感染等。

3 小結(jié)與展望

實驗干預大鼠模型是研究OSAHS 發(fā)病機制、危險因素、病程進展、預防和治療中必不可缺少的，模型的建立至今尚無準確和統(tǒng)一的標準。CIH 模型與上呼吸道阻塞模型各有其獨特的優(yōu)缺點。CIH 模型建立簡便，可行性高，適合長期、慢性研究，上呼吸道阻塞模型更符合兒童OSAHS 的發(fā)病機制，但建立較困難。檢驗造模成功可取心、肝、肺或氣道組織進行前后病理學對照，對比特定蛋白或生物標志物水平，如ET-1、ET 受體、p62 蛋白、HIF-1 因子、載脂蛋白A4 或α-1A 微管蛋白[20]。

歐洲呼吸學會兒童呼吸性睡眠障礙診療工作組將OSAHS 定義為“一種睡眠期間上呼吸道功能障礙的綜合征，特征是打鼾和/或伴有上呼吸道阻力增加或塌陷”[21]。兒童OSAHS 的病因更多會從上呼吸道功能阻塞的方向進行考慮，睡眠因素在其中尤為關鍵?，F(xiàn)對未來兒童OSAHS 模型的建立提出可能的研究方向：通過在大鼠上連接腦電圖和多導睡眠檢測儀，實時檢測其睡眠狀態(tài)及呼吸狀態(tài)，用手術(shù)方法在咽部、上氣道建立可調(diào)節(jié)的梗阻狀態(tài)，通過影像學確定其上呼吸道阻塞分級，定期測定其血氧飽和度，在睡眠時行睡眠監(jiān)測和腦電圖監(jiān)測，記錄AHI 和最低氧飽和度；一定時間后通過測定其生物蛋白，心、肝、氣道部位組織病理切片，四肢血壓，心功能以及肺功能，頜面部結(jié)構(gòu)改變，特別是評價睡眠紊亂狀態(tài)的形成，以多角度確定造模試驗的成功性。相信隨著研究的深入和科技的進步，一定會有創(chuàng)新性的模型出現(xiàn)。