蠟樣芽胞桿菌腸毒素FM(CwpFM)流行情況及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展

單 強(qiáng), 劉 寧, 王 雪, 朱要宏, 王九峰, 楊貴燕

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 北京 海淀 100193)

蠟樣芽胞桿菌是一種存在于食物、土壤和環(huán)境中的食源性致病菌,能形成耐高溫、脫水和其他物理壓力的內(nèi)生孢子來抵抗惡劣環(huán)境。蠟樣芽胞桿菌也是一種常見的食品生產(chǎn)環(huán)境細(xì)菌,其孢子無法被巴氏消毒殺死且具有很強(qiáng)的黏附性,可傳播到各種食品中,對(duì)食品安全和人類健康造成極大威脅。當(dāng)蠟樣芽胞桿菌作為一種機(jī)會(huì)性致病菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi),可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的感染[1]。但蠟樣芽胞桿菌并不都是致病菌,在合理的毒性范圍內(nèi)可作為益生菌來使用[2]。如何區(qū)分菌株是益生菌還是致病菌是一個(gè)關(guān)鍵問題。有研究發(fā)現(xiàn),蠟樣芽胞桿菌所分泌的腸毒素FM(Enterotoxin FM,EntFM),也被稱作細(xì)胞壁肽酶FM(Cell wall peptidase FM,CwpFM),可作為生物標(biāo)記物來區(qū)分致病菌,但關(guān)于CwpFM毒性作用機(jī)制的研究目前仍不足[3]。本綜述總結(jié)了蠟樣芽胞桿菌及其CwpFM的流行情況,整理了其作用機(jī)制的研究進(jìn)展,為進(jìn)一步了解CwpFM的毒性作用提供參考依據(jù),為探究CwpFM的作用機(jī)制提供新思路。

1 蠟樣芽胞桿菌毒力因子CwpFM

蠟樣芽胞桿菌通過產(chǎn)生一系列毒力因子,包括成孔毒素、嘔吐毒素、溶血素、腸毒素、蛋白酶和磷脂酶等,引發(fā)嘔吐或腹瀉型食物中毒(圖1)[4]。蠟樣芽胞桿菌可以分泌溶血素BL(Hemolysin BL,Hbl)和非溶血型腸毒素(Nonhemolytic enterotoxin,Nhe)2種成孔毒素,Hbl和Nhe為三組分組成毒素,有研究發(fā)現(xiàn),這2種毒素通過在細(xì)胞膜上打孔導(dǎo)致鉀離子外流,激活含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎性小體進(jìn)而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[5,6]。細(xì)胞毒素K(Cytotoxin K,Cyt K)被認(rèn)為是引起腹瀉綜合征的潛在致病因子,有研究發(fā)現(xiàn),其對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2有很強(qiáng)的毒性[7]。嘔吐毒素(Cereulide)是一種小分子親脂性十二環(huán)肽,結(jié)構(gòu)性質(zhì)穩(wěn)定,能耐高溫和蛋白水解,并可在酸性環(huán)境下存活。溶血素I是熱不穩(wěn)定蛋白,其溶血活性可被膽固醇抑制,而溶血素II和溶血素III是不依賴膽固醇的溶血素。溶血素II有孔形成活性,可通過活化Caspase3或Caspase8誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞和人單核細(xì)胞凋亡[8]。Agata等在1995年發(fā)現(xiàn)腸毒素T,其在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物表現(xiàn)出Vero細(xì)胞毒性,且在血管通透性測(cè)定中呈陽性,注射小鼠后可致死[9]。CwpFM是一種蠟樣芽胞桿菌潛在的細(xì)胞壁肽酶,可維持細(xì)菌形態(tài)和運(yùn)動(dòng)性,與細(xì)菌生物膜形成、上皮細(xì)胞粘附、巨噬細(xì)胞空泡化和細(xì)菌毒力有關(guān)[10]。有研究表明,致病菌株的CwpFM含有一段特定的固有無序連接子,位于細(xì)菌Src同源3結(jié)構(gòu)域3(Three bacterial Src homology 3 domains,SH3b3)和催化新型脂蛋白C/蛋白量為60 kDa(New lipoprotein C/protein of 60 kDa,NLPC/P60)結(jié)構(gòu)域之間,能夠作為一個(gè)標(biāo)記來很好地區(qū)分致病性菌株和非致病性菌株[3]。

圖1 蠟樣芽胞桿菌的毒力因子[4]

2 蠟樣芽胞桿菌及其CwpFM的流行情況

蠟樣芽胞桿菌是一種常見的食源性致病菌,在我國(guó)乳制品中的分離率呈上升趨勢(shì)[11]。有研究發(fā)現(xiàn),我國(guó)的牛奶和乳制品中蠟樣芽胞桿菌的分離率介于10.80%～42.22%,CwpFM的檢測(cè)率介于71.93%～100%[12-17]。而在即食食品、生菜和環(huán)境中,蠟樣芽胞桿菌的分離率介于35.12%～40.00%,食物和環(huán)境中CwpFM的分離率高達(dá)91.20%～100%[18,19]。由此可見,我國(guó)乳制品和食品中蠟樣芽胞桿菌的分離率很高,且這些蠟樣芽胞桿菌大部分都攜帶CwpFM基因。在韓國(guó)的食品Sunsik中,蠟樣芽胞桿菌的分離率高達(dá)35.00%～41.94%,CwpFM的分離率為100%[20,21]。而在發(fā)酵酒精飲料和豆豉發(fā)酵產(chǎn)品中,蠟樣芽胞桿菌的分離率介于29.09%～53.41%,CwpFM的分離率介于81.60%～100%[22,23]。從綠葉萵苣、食品、環(huán)境和臨床樣本中所分離的597株蠟樣芽胞桿菌的CwpFM分離率介于77.21%～86.14%[24-26]。從哥倫比亞的食物、木薯淀粉和食品粉末樣品中,共分離得到262株蠟樣芽胞桿菌,CwpFM的分離率介于62.00%～92.90%[27-29]。而在其他國(guó)家的食品和環(huán)境中,CwpFM的分離率也同樣高達(dá)70.60%～100%[30-32]。不同地區(qū)食品和環(huán)境中蠟樣芽胞桿菌及其CwpFM的分離情況如表1所示,蠟樣芽胞桿菌在國(guó)內(nèi)和國(guó)外食物中的分離率均很高,這可能對(duì)人類食品造成一定的安全隱患,且大部分蠟樣芽胞桿菌中都攜帶有CwpFM基因。

表1 不同地區(qū)食品和環(huán)境中蠟樣芽胞桿菌及其CwpFM的分離情況

3 蠟樣芽胞桿菌CwpFM的作用機(jī)制

CwpFM基因長(zhǎng)度為1 269 bp,編碼分子量為45 kDa的蛋白質(zhì)。CwpFM在動(dòng)物模型中可引起腸毒素癥狀,可增加家兔血管通透性,對(duì)小鼠有致死作用,并表現(xiàn)出Vero細(xì)胞毒性,但其不具備溶血酶活性和卵磷脂酶活性[33]。為了誘導(dǎo)有效感染,蠟樣芽胞桿菌必須在宿主腸道定殖并持續(xù)存在。有研究表明,蠟樣芽胞桿菌黏附于上皮細(xì)胞,并在固液和液氣界面形成生物膜[34]。生物膜是一種多細(xì)胞細(xì)菌群落,由附著在細(xì)胞表面并嵌入胞外聚合物基質(zhì)中的微生物組成。細(xì)菌和真核細(xì)胞的黏附通常對(duì)于易感宿主的感染至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn),與野生型蠟樣芽胞桿菌菌株相比,敲除CwpFM基因的菌株對(duì)Hela細(xì)胞的黏附力降低了10倍,且與野生型菌株相比,敲除CwpFM基因的菌株傳播能力下降,遷移區(qū)直徑減少了約73.50%;而回補(bǔ)菌株與野生型菌株具有相同的傳染力[10]。

蠟樣芽胞桿菌CwpFM是一種潛在的細(xì)胞壁肽酶,是NLPC/P60肽酶家族中的一員。NLPC/P60作為炭疽桿菌的一種毒力因子,是炭疽桿菌分泌體的一部分,可在被感染動(dòng)物的血液中檢測(cè)到[35]。有研究報(bào)道,CwpFM基因是以單拷貝形式存在于蠟樣芽胞桿菌群大多數(shù)成員的染色體上[24]。NLPC/P60蛋白是一個(gè)可以修飾細(xì)胞壁的細(xì)胞壁肽酶家族,其大多數(shù)蛋白除含有自身催化位點(diǎn)外,還有與細(xì)胞壁的多肽、碳水化合物和脂質(zhì)相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域,如Src同源3(Src homology 3,SH3)、溶解素基序(Lysin motif,LysM)和肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。細(xì)菌細(xì)胞壁肽酶參與多種過程,如生長(zhǎng)過程中肽聚糖的修飾、細(xì)胞壁的周轉(zhuǎn)、細(xì)胞分裂過程中子細(xì)胞的分離和運(yùn)動(dòng)、細(xì)菌的黏附和侵襲以及生物膜的形成等,從而直接影響細(xì)菌的致病性[36]。細(xì)菌的細(xì)胞壁是由肽聚糖組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。肽聚糖的主要結(jié)構(gòu)特征是由短肽交聯(lián)的線性聚糖鏈,通過承受膨脹來保持細(xì)胞的完整性。在蠟樣芽胞桿菌中,非交聯(lián)的莖附著的核心結(jié)構(gòu)是L-丙氨酸-γ-D-谷氨酸-L-賴氨酸-D-丙氨酸-D-丙氨酸(L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala),在外界環(huán)境的影響下,肽聚糖內(nèi)核進(jìn)行O-乙酰化和N-去乙?；然瘜W(xué)修飾,也可以結(jié)合甘氨酸和非經(jīng)典D-氨基酸。細(xì)胞壁的生物合成受到高度調(diào)控,且其可塑性需要通過不斷調(diào)整來適應(yīng)細(xì)菌細(xì)胞周期或不斷變化的環(huán)境,保證細(xì)胞壁不被破壞[37]。細(xì)菌細(xì)胞壁水解酶參與細(xì)菌的黏附和侵襲,在宿主細(xì)胞和生物被膜形成的起始階段中存在,與細(xì)菌的致病性有關(guān),由其產(chǎn)生的細(xì)胞壁片段可作為信號(hào)分子來觸發(fā)細(xì)菌信息交流、免疫反應(yīng)和抗生素耐藥性的產(chǎn)生[38]。

有研究證明,蠟樣芽胞桿菌的CwpFM影響細(xì)菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和生物膜的形成,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞空泡化[10]。Boonchai等發(fā)現(xiàn),CwpFM蛋白刺激會(huì)使Vero細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生形態(tài)學(xué)變化,且CwpFM蛋白具有細(xì)胞毒性,CwpFM基因中所含有的4個(gè)重復(fù)序列“TCAAAC”可能與蠟狀芽胞桿菌的細(xì)胞毒性有關(guān)[39]。來自致病蠟樣芽胞桿菌菌株的CwpFM含有20個(gè)內(nèi)在無序的特定片段,插入SH3b3和催化NLPC_P60結(jié)構(gòu)域之間,可作為生物標(biāo)記物來區(qū)分蠟樣芽胞桿菌的致病性和非致病性[3]。然而,現(xiàn)階段對(duì)CwpFM在蠟樣芽胞桿菌感染中的具體作用途徑研究甚少。

4 小結(jié)

綜上所述,蠟樣芽胞桿菌廣泛存在于食物和環(huán)境中,給人類和動(dòng)物的健康和食品安全造成極大的隱患。當(dāng)蠟樣芽胞桿菌通過環(huán)境接觸到食物后,可產(chǎn)生內(nèi)生孢子且很難被殺死。當(dāng)其被人類或動(dòng)物食用后會(huì)發(fā)生腹瀉或嘔吐等多種疾病。而目前在蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)生的腸毒素中,大多數(shù)的研究集中于Hbl和Nhe。本文對(duì)CwpFM的流行情況進(jìn)行總結(jié)后發(fā)現(xiàn),CwpFM在蠟樣芽胞桿菌中攜帶率非常高,而現(xiàn)有的研究對(duì)其作用模式的分子描述尚不深入。要想充分了解蠟樣芽胞桿菌的危害,就必需了解其毒力因子的致病機(jī)制,因此需要對(duì)CwpFM的作用機(jī)制進(jìn)行深入探究,從而更加全面認(rèn)識(shí)CwpFM,并將其可能產(chǎn)生的危害降到最低,以保障人類的健康。