響應(yīng)面優(yōu)化QuEChERS-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析茶飲料中合成著色劑＊

韋志超，于喆源，楊 博，彭 東

（甘肅省張掖市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，甘肅 張掖 734000）

食用色素是以改善食品色澤為目的的重要食品添加劑，由于該類添加劑具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、易于調(diào)色、性質(zhì)穩(wěn)定以及成本低廉等優(yōu)勢(shì)，在食品加工中被廣泛使用[1-3]。食用色素其專業(yè)名稱為食用合成著色劑，是一種非營(yíng)養(yǎng)成分，多以煤焦油中提煉出的苯胺染料為原料研制而成，含有R-N=N-R鍵、苯環(huán)或氧雜蒽等結(jié)構(gòu)[4-7]。為了防止濫用合成著色劑，世界各國(guó)都通過立法嚴(yán)格控制食物中人工合成著色劑的用量[8-10]。我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[11]中對(duì)可以作為食品添加劑使用的合成著色劑品種、應(yīng)用范圍以及最高限量均有具體規(guī)定。

茶文化在中國(guó)擁有悠久的歷史和豐富的內(nèi)涵，茶飲料作為一種飲用便捷，同時(shí)兼具傳統(tǒng)茶葉提神解渴功效的飲品，越來越受到消費(fèi)者的青睞。其含有的茶多酚、黃酮等諸多生理活性物質(zhì)，有抗氧化、抗癌、降低血糖血壓、防治心血管疾病以及抗衰老等多種保健功能[12-13]。市場(chǎng)上部分商人為了追求利益，提高產(chǎn)品的賣相，超范圍在茶飲料中添加合成著色劑，尤其在深受年輕群體歡迎的奶茶類和果茶類飲料更是此類問題的頻發(fā)地帶。

目前對(duì)人工合成著色劑的檢測(cè)方法主要采用聚酰胺吸附法[14-15]，利用聚酰胺的化學(xué)性質(zhì)，在酸性環(huán)境下吸附合成著色劑，在堿性環(huán)境下解吸合成著色劑。此純化過程步驟繁瑣、操作費(fèi)時(shí)，對(duì)于含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等成分的奶茶樣品，合成著色劑提取率較低[16]，同時(shí)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法采用254 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，測(cè)定時(shí)易受樣品基質(zhì)的干擾[17]。QuEChERS作為一種新的前處理方法，具有快速、簡(jiǎn)單、便宜、有效、可靠和安全的特點(diǎn)，其原理是利用吸附劑與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的[18-20]。因此，為了提高茶飲料中人工合成著色劑分析效率，本研究嘗試采用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法，采用常見5種合成著色劑平均回收率為表征指標(biāo)，通過優(yōu)化QuEChERS前處理方法中十八烷基鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）及提取劑pH[21-23]，確定針對(duì)茶飲料檢測(cè)的最佳方案，以期建立一種經(jīng)濟(jì)高效的茶飲料中合成著色劑的定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），成都科??；乙酸（分析純）、乙酸銨（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氨水（分析純），無水乙醇（分析純），上海國(guó)藥集團(tuán)；檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、亮藍(lán)，均為標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL），F(xiàn)irst Standard公司；C18、PSA填料，上海麥克林；實(shí)驗(yàn)用水為密理博純水系統(tǒng)（美國(guó)）制得的超純水。

樣品：市售茶飲料。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6460液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫公司；GL323-2SCN型千分之一天平，美國(guó)賽多利斯公司；HN-30AL超聲清洗機(jī)，上海漢諾公司；MV5高通量平行濃縮儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；Milli-Q型超純水器，美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別吸取上述5種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，制成含上述合成著色劑1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品中間液；吸取中間液0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0 mL，用超純水定容至10 mL，制成濃度分別為20、40、80、100、200、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱（2.1 mm×10 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量3 μL；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min。流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。

電離方式：電噴霧離子源（ESI+）；掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；干燥氣溫度：300 ℃；去溶氣流速：11 L/min；池出口電壓:4 kV；去簇電壓:100 V；碰撞氣：高純氮?dú)猓?9.999%）。5種合成著色劑的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 5種合成著色劑定性、定量離子對(duì)和質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3.3 樣品的處理

稱取10 g樣品于50 mL離心管中，加入25 mL無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1），超聲10 min，4000 r/min離心10 min，繼續(xù)添加上述提取劑至40 mL。取上清液10 mL置于另一50 mL離心管中，調(diào)節(jié)pH至中性，加入吸附劑PSA 100 mg和C18 300 mg，渦旋2 min，4000 r/min離心15 min，取10 mL上清液置于蒸發(fā)皿中，蒸至近干，用水定容至2 mL，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后待用。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

（1）C18用量對(duì)合成著色劑提取率的影響

在PSA添加量為100 mg，pH為7.0的條件下，考察不同C18添加量對(duì)平均回收率的影響。

（2）PSA用量對(duì)合成著色劑提取率的影響

在C18添加量為400 mg，pH為7.0的條件下，考察不同PSA添加量對(duì)平均回收率的影響。

（3）提取液pH對(duì)成著色劑提取率的影響

在PSA添加量為100 mg，C18添加量為400 mg的情況下，考察不同提取劑pH對(duì)平均回收率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，選取C18用量、PSA用量、提取液pH三種因素為變量，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以5種合成著色劑平均回收率為響應(yīng)值，通過建立響應(yīng)面，試驗(yàn)因素水平見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.3.6 平均回收率的測(cè)定

在空白樣品中分別加入2 mL的1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，使樣品中的添加量為50 ng/mL。按照“1.3”的方法處理樣品并測(cè)定其每種合成著色劑的含量，并計(jì)算平均回收率。平均回收率公式如下：

式中：Ci為每種合成著色劑的測(cè)量濃度；N為合成著色劑的種類數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，應(yīng)用Microsoft office Excel 2007與Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

按“1.3.4 單因素試驗(yàn)”項(xiàng)下要求，按“1.3 方法”項(xiàng)下相關(guān)要求，分別考察不同C18、PSA添加量和提取劑pH對(duì)合成著色劑平均回收率的影響。具體設(shè)計(jì)見表4。

表4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.1 C18添加量的確定

按“1.3.4 單因素試驗(yàn)”項(xiàng)下要求，在PSA添加量為100 mg，pH為7.0的條件下，分別按“表4”所示，選取不同C18添加量進(jìn)行提取凈化操作，結(jié)果如圖1所示。

圖1 C18添加量對(duì)合成著色劑平均回收率的影響

由圖1可見，隨著添加C18量的增加，合成著色劑平均回收率也不同，呈現(xiàn)先增大后減小并保持的趨勢(shì)。C18是目前QuEChERS法使用最多的一種吸附劑，對(duì)非極性化合物有較強(qiáng)吸附作用，常被用來去除極性溶液中的非極性化合物，對(duì)樣品中油脂等雜質(zhì)有較好的吸附效果，可以減少脂溶性雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾。但當(dāng)C18添加量達(dá)到500 mg時(shí)，合成著色劑回收率呈下降趨勢(shì)。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，選取400 mg添加量為C18添加量的中心值。

2.1.2 PSA添加量的確定

按“1.3.4 單因素試驗(yàn)”項(xiàng)下要求，在C18添加量為400 mg，pH為7.0的條件下，分別按“表4”所示，選取不同PSA添加量進(jìn)行提取凈化操作，結(jié)果如圖2所示。

圖2 PSA添加量對(duì)合成著色劑平均回收率的影響

由圖2可見，隨著PSA添加量的增加，合成著色劑平均回收率呈現(xiàn)先上升后保持的趨勢(shì)。PSA通過氨基的弱離子交換作用和極性基質(zhì)成分形成氫鍵，從而吸附和消除樣品基質(zhì)中的糖類、天然合成著色劑以及脂肪酸。茶飲料中普遍含有糖和天然合成著色劑，通過添加PSA進(jìn)行吸附可以較好地去除該類雜質(zhì)，當(dāng)用量達(dá)到120 mg時(shí)，合成著色劑平均回收率達(dá)到最高。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，選取120 mg添加量為PSA添加量的中心值。

2.1.3 提取劑pH的確定

按“1.3.4 單因素試驗(yàn)”項(xiàng)下要求，在PSA添加量為100 mg，C18添加量為400 mg的條件下，分別按“表4”所示，選取不同提取劑pH進(jìn)行提取凈化操作，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對(duì)合成著色劑平均回收率的影響

由圖3可見，待凈化提取液pH對(duì)合成著色劑回收率有較為明顯的影響，在pH為4.0～7.0時(shí)，隨著pH的增加，回收率明顯增加；在pH達(dá)到7.0時(shí)，達(dá)到最大回收率；在pH為7.0～8.0時(shí)，回收率雖然下降，但下降程度較小，但pH在超過8.0時(shí)，回收率明顯下降，尤其是當(dāng)pH為9.0時(shí)，合成著色劑平均回收率僅為21.7%。根據(jù)各吸附劑性質(zhì)，中性及酸性環(huán)境下，被測(cè)合成著色劑在吸附劑中吸附較弱，隨著提取劑的堿化，合成著色劑呈現(xiàn)解離狀態(tài)，在吸附劑上的吸附增強(qiáng)，平均回收率降低。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，選擇pH等于7.0為中心值。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，選取C18用量、PSA用量、提取液pH三種因素為變量，按“1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)”中各個(gè)水平，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以5種合成著色劑平均回收率為響應(yīng)值，進(jìn)行試驗(yàn)。

采用Design-Expert8.0軟件，按照Box-Behnken組合設(shè)計(jì)[24-26]，試驗(yàn)結(jié)果見表5，并進(jìn)行回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 顯著性檢驗(yàn)及方差分析

2.2.1 響應(yīng)曲面分析

采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)值與各因素編碼值進(jìn)行回歸擬合后得到合成著色劑平均回收率與各變量的二次多項(xiàng)式方程模型為：R=0.94+0.014×A+0.031×B+0.38×C-0.035×AB+0.017×AC-0.008×BC-0.044×A2-0.009×B2-0.35×C2。

表6可以看出，方差分析說明，該響應(yīng)面分析模型擬合度良好，失擬項(xiàng)P=0.308 3＞0.05不顯著；模型的均方差P<0.000 1，表明回歸模型極顯著；同時(shí)從決定系數(shù)（R2=0.998 7）和校正系數(shù)（R2=0.996 3）得出，選定的因素與響應(yīng)值之間存在較高的相關(guān)性，模型可以用來解釋和預(yù)測(cè)響應(yīng)值，預(yù)測(cè)值具有較高的可信度；變異系數(shù)CV%=2.85%，表明在該試驗(yàn)條件下，結(jié)果具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性；由回歸模型顯著性分析可知：在選取的3種考察因素中，C18添加量和pH對(duì)合成著色劑的平均回收率有非常顯著的影響。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

通過等高線圖和3D圖可以直觀發(fā)現(xiàn)各因素交互作用對(duì)合成著色劑平均回收率的影響。通過Design-Expert 8.0軟件中響應(yīng)面優(yōu)化分析方法得出C18添加量、PSA添加量和pH各交互因素對(duì)合成著色劑平均回收率的響應(yīng)面圖和等高線圖，如圖4—6所示。

圖4 C18添加量與PSA添加量交互作用的響應(yīng)面及等高線圖

由圖4中的等高線可知，C18添加量與PSA添加量之間交互關(guān)系呈現(xiàn)為橢圓形，且響應(yīng)值等高線具有較密集的分布；從3D坡度圖看，表現(xiàn)為較為陡峭，表明C18添加量與PSA添加量之間的交互作用對(duì)合成著色劑平均回收率影響較大，與方差分析表中的結(jié)論相符合。圖5、圖6中等高線呈現(xiàn)的橢圓均平行于其中一軸，說明影響平均回收率的因素是2個(gè)因素中的其中一項(xiàng)，其交互因素不明顯。具體來說，PSA添加量與pH交互中，pH的大小對(duì)合成著色劑回收率有較為明顯的影響；C18添加量與pH交互中，pH的大小對(duì)合成著色劑回收率有較為明顯的影響。這與表6中得到的結(jié)論相一致。

圖5 PSA添加量與pH交互作用的響應(yīng)面及等高線圖

圖6 C18添加量與pH交互作用的響應(yīng)面及等高線圖

2.2.3 優(yōu)化條件的確定及驗(yàn)證

通過2.2.1得到的二次多項(xiàng)式方程模型，利用Design-Expert 8.0對(duì)最佳提取條件進(jìn)行預(yù)測(cè)可得，合成著色劑提取條件為C18添加量238 mg、PSA添加量132 mg、pH7.63時(shí)，可達(dá)理論最大回收率99.7%?？紤]實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況，提取條件確定為C18添加量250 mg、PSA添加量120 mg、pH為7.5，按以上選定條件按1.3.6中的方法進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表7，得出合成著色劑回收率為（97.7±1.25）%，與預(yù)測(cè)模型結(jié)果相比較，回收率接近，表明該優(yōu)化結(jié)果可靠，用于飲料中合成著色劑提取具有可行性。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論

文章采用響應(yīng)面法，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，最終確定C18添加量、PSA添加量和pH三個(gè)影響因素用于茶飲料中5種合成著色劑的提取，建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的顯著性。通過軟件擬合結(jié)合實(shí)際，確定最佳提取條件為：C18添加量238 mg、PSA添加量132 mg、pH為7.63。結(jié)合實(shí)際情況，提取條件確定為C18添加量250 mg、PSA添加量120 mg、pH為7.5。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，證明該模型擬合情況良好，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化茶飲料中5種合成著色劑提取工藝切實(shí)可行。同時(shí)，該方法操作便捷、高效，且使用試劑少，回收率高。為日常茶飲料市場(chǎng)監(jiān)管提供了一種快速簡(jiǎn)便的方法。