紫錐菊提取物聯(lián)合柳氮磺吡啶對濕熱泄瀉大鼠Th17/Treg免疫失衡的影響

池幸子,李耀星,王慧婷,嚴(yán)銘恩,楊詩靖,楊泊文,孫 晗,郭世寧,2, 石達(dá)友,2,武 力,2,劉 翠,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642;2.廣東省獸用中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心,廣州 510642)

濕熱泄瀉證在中獸醫(yī)臨床中較為常見,其證型主要為濕熱侵犯腸道,臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、肛門焦灼、黏液膿性血便或暴發(fā)性腹瀉及黃糜爛臭散便,舌苔黃膩等[1-2]。在畜牧業(yè)中,夏秋季動物的過度使役,畜禽流動性增加,常使其應(yīng)激導(dǎo)致濕熱泄瀉,帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。根據(jù)中醫(yī)理論,紫錐菊味辛、苦,性涼,具有疏散風(fēng)熱,清熱解毒的功效,在治療濕熱泄瀉方面具有副作用小、療效高、成本低及綜合效應(yīng)好等優(yōu)勢[4-5]。

Th17細(xì)胞是一種存在于腸黏膜中的CD4+細(xì)胞亞群,以產(chǎn)生IL-6、IL-17、IL-23等細(xì)胞因子為主要特征,與誘導(dǎo)機(jī)體炎癥,激活B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體等密切相關(guān)[6]。Treg細(xì)胞亞群是免疫反應(yīng)和炎癥疾病的重要調(diào)節(jié)因子,通過TGF-β、IL-10、IL-15等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng),促進(jìn)腸道T細(xì)胞的活化。機(jī)體正常情況下,Th17/Treg水平保持相對平衡,而病理狀態(tài)下相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)生變化會使得兩者平衡被打破從而引發(fā)疾病的產(chǎn)生[7]。Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),改變了人們對免疫調(diào)節(jié)、免疫病理及宿主防御的認(rèn)識,加深了人們對炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識[8-10]。研究表明,機(jī)體免疫反應(yīng)的失衡,尤其是Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的分化異常,在濕熱泄瀉的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用[11-13]。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞是腸道免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素,有多種細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控,因而Th17/Treg平衡對腸道健康而言尤為重要[14-15]。

前期研究表明,每日使用3 g·kg-1紫錐菊提取物能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫,有效改善大鼠濕熱泄瀉癥狀[16]。柳氮磺吡啶為一種磺胺類抗菌藥,主要成分是5-氨基水楊酸,是臨床上治療潰瘍性結(jié)腸炎的常用藥,其在濕熱型腸炎中也有較好的療效[17]。本研究采用紫錐菊提取物聯(lián)合柳氮磺吡啶治療大鼠濕熱泄瀉,探討中西藥物聯(lián)合對濕熱泄瀉大鼠Th17/Treg平衡的影響與療效,為紫錐菊提取物防治濕熱泄瀉疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

葡萄糖,購自天津市大茂化學(xué)試劑廠;豬油,購自頓蒿特食品有限公司;營養(yǎng)瓊脂,購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;各種動物外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒,購自北京索萊寶科技有限公司;CD4 Monoclonal Antibody (OX35) FITC、IL-17A Monoclonal Antibody (eBio17B7) PE、FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s) PE、CD25 Monoclonal Antibody (OX39) APC、eBioscienceTM細(xì)胞刺激混合物(加蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑)(500×)、eBioscienceTM細(xì)胞內(nèi)固定與透化緩沖液、eBioscienceTMFoxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent,購自英濰捷基上海貿(mào)易有限公司;紅細(xì)胞裂解液,購自上海仁捷生物科技有限公司;TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23 ELISA 試劑盒,購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

離心機(jī)(湖南湘儀,L420)、酶標(biāo)儀(Thermo,357-701660)、流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特,CYTOFLEX)。

1.2 藥物與菌種

紫錐菊提取物,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)實驗室與廣州華農(nóng)高科生物科技有限公司研制,廣州華農(nóng)高科生物科技有限公司中試生產(chǎn),批號:20191201,含單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的總量不少于2.0%,100 g·袋-1。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(O78)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 實驗動物與分組

SPF級Wistar大鼠40只購自廣州南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理中心,體重180～220 g,雌雄各半,動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(粵)2019-0136。40只Wistar大鼠隨機(jī)均分為5組:空白組、模型組、紫錐菊提取物組、柳氮磺吡啶組及中西結(jié)合組,雌雄各半?？瞻捉M大鼠給予正常飲水,單日灌胃同劑量生理鹽水,處于溫度(22±2)℃,濕度 50%±5%環(huán)境中;其余各組大鼠于單日灌胃20 mL·kg-1豬油并給予充足飼料,于雙日禁食,且自由飲用30%葡萄糖水,所有大鼠置于高溫高濕環(huán)境中,維持室內(nèi)溫度33 ℃±2 ℃,濕度90%±5%,每日持續(xù)8 h,共10 d。10 d后,除空白組外,其余各組大鼠均腹腔注射劑量為2 mL·kg-1產(chǎn)毒性大腸桿菌菌液(1.8×109CFU·mL-1),間隔24 h后再次注射1 mL·kg-1劑量大腸桿菌菌液,自然適應(yīng)1 d,空白組大鼠腹腔注射等量生理鹽水[16]。造模后,紫錐菊提取物組每日分別灌胃紫錐菊提取物1 g·kg-1,柳氮磺吡啶組每日灌胃柳氮磺吡啶0.1 g·kg-1,中西結(jié)合組每日灌胃1 g·kg-1紫錐菊提取物+0.1 g·kg-1柳氮磺吡啶,空白組與模型組大鼠給予等量生理鹽水,持續(xù)6 d。

1.4 臨床體征觀察

觀察大鼠臨床體征,記錄體重、飲水量與采食量。根據(jù)臨床癥狀評分表量化各組大鼠的濕熱泄瀉臨床癥狀變化程度。評分參考王濤[18]的標(biāo)準(zhǔn)并加以優(yōu)化,見表1。

1.5 組織病理學(xué)檢查

取各組大鼠結(jié)腸用10%中性甲醛溶液固定,沖洗樣本中的甲醛后使用乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋并切片(4 μm),進(jìn)行HE染色,封片,光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠結(jié)腸組織學(xué)差異。

1.6 各組大鼠主要血清因子含量檢測

各組大鼠進(jìn)行腹主動脈采血,采全血4 mL靜置2～3 h,室溫下3 500 r·min-1離心10 min,取上清備用。運用ELISA法檢測各組大鼠血清中TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23的含量。

1.7 各組大鼠PBMCs中Th17/Treg細(xì)胞比例測定

1.7.1 制備PBMCs懸液 大鼠腹主動脈采血5 mL,使用PBS將血液按1∶1比例稀釋于15 mL離心管中。另取兩個15 mL離心管,分別加入5 mL淋巴細(xì)胞分離液,將稀釋好的血液樣本用1 mL移液槍貼壁緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液管中,盡量保持液面分層。1 000×g離心20 min后,吸取白膜層細(xì)胞到15 mL潔凈的離心管中,10 mL PBS或細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層細(xì)胞。500×g離心5 min,棄上清。向管中加入1 mL紅細(xì)胞裂解液,輕輕吹打混勻,靜置1～2 min。500×g離心5 min,棄上清。向管中加入5 mL PBS,輕柔混勻重懸沉淀,離心2～3 min,棄上清,加入500 μL PBS重懸。取5個5 mL棕色管,每管50 μL細(xì)胞懸液,分別為Treg 組中CD4單染管、CD25單染管、Foxp3單染管、陰性對照管,復(fù)染管準(zhǔn)備染色。余250 μL 裝入3 mL培養(yǎng)皿中,添加2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液并添加4 μL細(xì)胞刺激劑置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。

1.7.2 PBMCs計數(shù) 細(xì)胞密度計算公式為:原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)/4 mL =細(xì)胞平均數(shù)×105,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106。

1.7.3 PBMCs中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例測定 1.5 mL的EP管中加入50 μL細(xì)胞懸液。先加入50 μL的PBSA調(diào)整體積至100 μL。然后復(fù)合管加入CD4抗體0.5 μL、CD25 抗體0.625 μL,CD4管加入CD4抗體0.5 μL,CD25管加入CD25 抗體0.625 μL,輕輕地脈沖渦旋混勻,4 ℃避光孵育30 min。加入1 ml的PBS洗滌細(xì)胞,4 ℃下400～600×g離心5 min,棄上清,加PBS 100 μL重懸。Foxp3管與復(fù)合管加入1 mL Foxp3 固定/破膜工作溶液并脈沖渦旋。4 ℃避光孵育30 min。每管加入2 mL破膜液,在室溫下400～600×g離心樣品5 min棄上清。用破膜液重懸沉淀至100 μL。不洗滌,加入Foxp3抗體5 μL,輕輕地脈沖渦旋混勻,室溫孵育30 min以上,避光。在EP管加入2 mL的破膜液,在室溫下400～600×g離心樣品5 min,棄上清。用PBS重懸后,流式細(xì)胞儀檢測Treg細(xì)胞數(shù)量測定。

孵育結(jié)束后,收集培養(yǎng)液,600×g離心5 min棄上清。加入PBS 1 mL重懸,600×g離心5 min,棄上清,加入200 μL PBS重懸。分裝成4個5 mL的棕色管,為CD4單染管、IL-17單染管、陰性對照管、復(fù)合管。各管分別加入50 μL PBS調(diào)整體積至100 μL。向復(fù)合管加入CD4抗體0.5 μL,CD4管中加入CD4抗體0.5 μL,脈沖渦旋混勻,4 ℃ 避光孵育30 min。加入PBS 1 mL洗滌細(xì)胞,400～600×g離心5 min,棄上清。重復(fù)洗滌。加入100 μL PBS重懸。IL-17管與復(fù)合管加入添加100 μL IC固定液來固定細(xì)胞,之后脈沖渦旋混合。室溫避光孵育30 min。加入2 mL破膜液,在室溫下600×g離心5 min。棄上清。用破膜液重懸沉淀至100 μL破膜液中,加入IL-17抗體0.625 μL,脈沖渦旋混勻,室溫避光孵育30 min。加入2 mL的破膜液,400～600×g離心5 min,棄上清用PBS重懸后,流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞數(shù)量測定。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的臨床體征

第12天造模結(jié)束時,與空白組相比,模型組大鼠臨床癥狀評分顯著升高(P<0.05),第13～18天時評分逐漸降低但始終顯著高于空白組(P<0.05)。各治療組在第13～18天治療過程中評分逐漸降低,但與模型組無顯著差異(P>0.05),第18天時中西結(jié)合組與柳氮磺吡啶組差異不顯著(P>0.05,圖1A)。

第12天造模結(jié)束時,與空白組相比,模型組大鼠體重顯著降低(P<0.05)。第13～18天各治療組體重緩慢增長且低于空白組。與模型組相比,第18天時紫錐菊提取物組與柳氮磺吡啶組大鼠體重與模型組無顯著差異(P>0.05,圖1B)。

第12天造模結(jié)束時,模型組大鼠飲水量與空白組無顯著差異(P>0.05),第13～18天各組飲水量逐步恢復(fù)至正常水平(圖1C)。

第12天造模結(jié)束時,模型組大鼠采食量顯著低于空白組(P<0.05)。第15天各治療組采食量上升,在第18天時逐步恢復(fù)至正常水平(圖1D)。

2.2 各組大鼠結(jié)腸病理學(xué)變化

如圖2所示,與空白組相比,模型組大鼠結(jié)腸發(fā)現(xiàn)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(圖2,如箭頭所示),在各治療組中,柳氮磺吡啶組大鼠結(jié)腸見炎性細(xì)胞浸潤、出血及脫落的腸絨毛(圖2,如箭頭所示),而紫錐菊提取物組和中西結(jié)合組大鼠結(jié)腸均未見明顯異常。

A.空白組;B.模型組;C.紫錐菊提取物組;D.柳氮磺吡啶組;E.中西結(jié)合組A. Control group; B. Model group; C. Echinacea purpurea extract group; D. Sulfasalazine group; E. Integrated traditional Chinese and Western medicine group圖2 各組大鼠結(jié)腸病理學(xué)變化結(jié)腸病理學(xué)變化(HE染色,100×)Fig.2 Pathological changes of colon in rats of each group (HE staining, 100×)

2.3 各組大鼠血清炎性因子水平變化

各組大鼠血清炎性細(xì)胞因子水平變化如圖3,與空白組相比,模型組大鼠血清中IL-17、IL-23水平顯著升高(P<0.05),血清中TGF-β、IL-10水平顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,紫錐菊提取物組與中西結(jié)合組大鼠血清中IL-17、IL-23水平顯著降低(P<0.05),血清中TGF-β水平顯著升高(P<0.05),血清IL-10水平無顯著差異(P>0.05)。

柱上字母不同表明各組間差異顯著(P<0.05)?！癮”表示最大值,“b”、“c”、“d”依次遞減 Different letters on the bar indicate significant differences among groups (P<0.05).“a” indicates the maximum value, and “b”, “c” and “d” decrease gradually圖3 各組大鼠血清炎性細(xì)胞因子水平的變化Fig.3 Changes of serum inflammatory cytokines of rats in each group

2.4 各組大鼠PBMCs中Th17/Treg細(xì)胞比例變化

如表2所示,與空白組相比,模型組大鼠PBMCs中Th17細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05),PBMCs中Treg細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),Th17/Treg比例顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,紫錐菊提取物組與中西結(jié)合組大鼠PBMCs中Th17細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),PBMCs中Treg細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05),Th17/Treg比例顯著降低(P<0.05)。

表2 大鼠PBMCs中Th17/Treg細(xì)胞比例(n=6)Table 2 Th17/Treg cell ratio in rat PBMCs (n=6)

3 討 論

濕熱泄瀉證由濕熱壅滯,損傷脾胃,運化失常所致,目前該模型的建立多采用模擬高溫高濕環(huán)境制造“外濕”,同時飲食肥甘之物損傷脾胃制造“內(nèi)濕”。但也有研究表明僅高溫高濕環(huán)境不足以建立動物大腸濕熱證,腹腔注射大腸桿菌,配合飲食及環(huán)境復(fù)合法更能成功建立符合中獸醫(yī)學(xué)臨床特點的濕熱泄瀉模型[19]。本試驗總結(jié)前人經(jīng)驗,采用“內(nèi)外濕熱+大腸桿菌”方法,通過提高外界溫濕度營造易感疾病環(huán)境,同時內(nèi)服葡萄糖水與豬油導(dǎo)致機(jī)體熱蘊(yùn)濕阻,以此建立了穩(wěn)定的濕熱泄瀉大鼠模型。

紫錐菊為菊科多年生草本植物,其活性成分有多糖、烷烴及咖啡酸衍生物等[20]?，F(xiàn)代研究主要集中于紫錐菊對免疫系統(tǒng)的影響,如免疫刺激或免疫調(diào)節(jié)作用[21-23]?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究紫錐菊增強(qiáng)免疫功能的作用機(jī)制預(yù)測紫錐菊活性成分可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、免疫細(xì)胞、炎癥因子等增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[24]。前期研究也證實了紫錐菊提取物能提高機(jī)體免疫從而有效改善大鼠濕熱泄瀉癥狀[16]。本試驗成功建立濕熱泄瀉大鼠模型后,采用紫錐菊提取物聯(lián)合柳氮磺吡啶治療濕熱泄瀉模型大鼠,通過觀察治療過程中大鼠的臨床體征,發(fā)現(xiàn)中西結(jié)合組大鼠的臨床癥狀評分要低于紫錐菊提取物組與柳氮磺吡啶組,說明中西結(jié)合組在緩解濕熱泄瀉大鼠的萎靡不振、腹瀉不止方面優(yōu)于單獨給予紫錐菊提取物或柳氮磺吡啶。本試驗結(jié)果顯示,紫錐菊提取物組、柳氮磺吡啶組及中西結(jié)合組的飲水量與采食量均低于模型組,提示由于藥物的灌胃影響了大鼠的飲食欲,從而進(jìn)一步導(dǎo)致各治療組大鼠的體重要低于模型組。結(jié)腸病理切片的結(jié)果顯示,治療后柳氮磺吡啶組大鼠結(jié)腸仍有炎性細(xì)胞浸潤、出血及脫落的腸絨毛等損傷,而紫錐菊提取物組與中西結(jié)合組的大鼠結(jié)腸未見明顯異常。

一般認(rèn)為應(yīng)激導(dǎo)致腹瀉是多方面作用的結(jié)果,現(xiàn)在越來越多的研究表明,濕熱泄瀉中內(nèi)外濕邪導(dǎo)致機(jī)體聯(lián)合應(yīng)激與病原微生物感染,使得病患體內(nèi)免疫細(xì)胞發(fā)生變化,表明一系列病程與免疫功能紊亂密切相關(guān)[25-26]。機(jī)體感受濕熱外邪,或因飲食釀濕生熱,升降失常,下注大腸,將導(dǎo)致機(jī)體PBMCs中Th17/Treg比例下調(diào),加劇炎癥反應(yīng),抑制機(jī)體免疫功能,因此,Th17/Treg 免疫失衡可作為濕熱泄瀉的潛在標(biāo)志物。本試驗檢測了大鼠PBMCs的Th17/Treg比例及相關(guān)血清炎性因子水平,從而探究中西藥物結(jié)合的療效及對Th17/Treg軸的影響。結(jié)果顯示,采用“內(nèi)外濕熱+大腸桿菌”對大鼠造模后,模型組大鼠PBMCs中Th17細(xì)胞比例顯著升高,PBMCs中Treg細(xì)胞比例顯著降低,Th17/Treg比例顯著升高。采用紫錐菊提取物或其與柳氮磺吡啶聯(lián)合治療后,均可顯著降低大鼠PBMCs中Th17細(xì)胞比例,從而使紊亂的Th17/Treg比例恢復(fù)平衡,且中西結(jié)合組的效果優(yōu)于紫錐菊提取物組與柳氮磺吡啶組。CD4+細(xì)胞亞群中的Th17細(xì)胞主要存在于腸黏膜中,可分泌IL-6、IL-17、IL-22、IL-23等細(xì)胞因子,IL-6上調(diào)會影響IL-23R的含量變化,從而誘導(dǎo)機(jī)體炎癥[27-28]。TGF-β誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞抑制自身免疫,但在IL-6作用下,TGF-β可促進(jìn)幼稚T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞,分泌炎癥因子IL-17以促進(jìn)自身免疫和炎癥的發(fā)生[29-30]。本試驗結(jié)果顯示中西結(jié)合組降低炎性因子IL-17、IL-23與升高血清TGF-β的作用優(yōu)于紫錐菊提取物組與柳氮磺吡啶組,具有良好的抗炎效果。另外,Treg細(xì)胞可分泌 IL-10、TGF-β以抑制其他輔助型T細(xì)胞的功能,主要通過Foxp3發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[31]。Treg細(xì)胞還可通過其他機(jī)制發(fā)揮抑制自身免疫性疾病的功能,Treg細(xì)胞通過控制腸道T細(xì)胞的活化,調(diào)節(jié)小鼠的腸道免疫反應(yīng)[32]。有研究表明,IL-6依賴STAT3信號通路途徑,對Th17細(xì)胞的增殖分化有促進(jìn)作用;另外,STAT3也可通過關(guān)鍵基因維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(retinoid acid-related orphan receptor gammat,RORγt)的表達(dá)增加調(diào)控Th17細(xì)胞的增殖分化[33]。當(dāng)IL-6缺乏時,通過TGF-β與IL-21的協(xié)同,也能誘導(dǎo)Th17細(xì)胞增殖[34]。大鼠濕熱泄瀉如何導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生以及Th17/Treg失衡的機(jī)制機(jī)理尚需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

紫錐菊提取物聯(lián)合柳氮磺吡啶給藥可明顯改善濕熱泄瀉大鼠的結(jié)腸損傷、減少炎性細(xì)胞浸潤,顯著降低濕熱泄瀉大鼠血清中IL-17、IL-23水平,升高血清中TGF-β水平,且效果優(yōu)于紫錐菊提取物組、柳氮磺吡啶組,并且在改善血清炎性因子水平的同時調(diào)節(jié)了Th17/Treg比例,從而對濕熱泄瀉大鼠起到治療效果。