HPLC法同時(shí)測(cè)定雙載藥復(fù)合物中伊立替康和姜黃素的載藥量

趙 柔,王 姍,崔婷婷,王圓圓,韓曉燕,張 毅

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 300193)

伊立替康(Irinotecan, ICA)為半合成喜樹(shù)堿衍生物,是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑,通過(guò)體內(nèi)的羧酸酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物SN38,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤活性。在酸性環(huán)境中,ICA以內(nèi)酯環(huán)形式存在,抗腫瘤作用較強(qiáng)[1]。ICA的抗癌譜較廣,對(duì)肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等均有一定療效。姜黃素(curcumin,CUR)是從姜科姜黃屬(Curcumal)植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提取的一種多酚類化合物。CUR幾乎不溶于水,不穩(wěn)定,易降解,在體內(nèi)吸收差。研究顯示,CUR對(duì)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等[2]均有抑制作用。多種抗腫瘤藥物聯(lián)用是減少藥物毒副作用、克服藥物耐藥性、發(fā)揮藥物協(xié)同作用、提高藥物抗腫瘤效果的最有效方法之一。伊立替康與姜黃素聯(lián)用時(shí),通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)通路或進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而大大提高其抗腫瘤活性[3-4]。

金屬有機(jī)框架(metal organic frameworks,MOFs)是由金屬離子或團(tuán)簇與有機(jī)配體通過(guò)配位鍵自組裝形成的具有多孔晶體的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化材料[5]。MOFs材料因孔隙率高、比表面積大及表面易功能化等特點(diǎn)成為微納米制劑的新型藥物載體之一。MOFs作為藥物載體遞送藥物,具有緩控釋性、靶向性等優(yōu)點(diǎn)[6-8],可以提高藥物的生物利用度。其中MIL-100(Fe)具有較好的生物相容性和安全性,能通過(guò)輔助誘導(dǎo)鐵死亡等方式直接發(fā)揮抗腫瘤功效[9-10],在藥物遞送領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

在此,作者以ICA和CUR為模型藥物,以MIL-100(Fe)為藥物載體,采用浸漬吸附法制備雙載藥復(fù)合物ICA/CUR@MIL-100(Fe),建立同時(shí)測(cè)定ICA/CUR@MIL-100(Fe)中ICA、CUR載藥量的HPLC法,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,擬為ICA/CUR@MIL-100(Fe)的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

MIL-100(Fe),自制;甲醇(色譜純)、三氯甲烷,天津渤化化學(xué)試劑有限公司;伊立替康,天津易生源生物技術(shù)有限公司;姜黃素,北京百靈威科技有限公司;乙腈(色譜純)、乙醇,天津康科德科技有限公司;十二烷基硫酸鈉、磷酸氫二鈉,天津大茂化學(xué)試劑廠;去離子水,Smart2 Pure Pro智能超純水系統(tǒng)。

RCT B S025型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,德國(guó)IKA;ME104E型電子天平、高效液相色譜儀,日本島津公司;H1650型臺(tái)式高速離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;5424R型高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf;IVOS-30A型真空干燥箱,施都凱儀器設(shè)備有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱,天津中環(huán)電爐股份有限公司;XO-5200DTS型超聲波清洗機(jī),南京先歐儀器制造有限公司;Varian 640型傅立葉變換紅外光譜儀,南昌捷島科學(xué)儀器有限公司;Horiba型粒徑電位儀,日本Horiba公司。

1.2 ICA/CUR@MIL-100(Fe)的制備

精密稱取5 mg經(jīng)150 ℃ 活化3 h的MIL-100 (Fe),在避光條件下加入5 mL ICA和CUR的4%甲醇-氯仿混合溶液(濃度均為4 mg·mL-1),置于磁力攪拌器上,室溫?cái)嚢?6 h,12 000 r·min-1離心10 min,收集上清液和沉淀,上清液即為供試溶液,沉淀即為雙載藥復(fù)合物ICA/CUR@MIL-100(Fe)。

不加ICA和CUR,同法操作,收集上清液和沉淀,上清液即為空白對(duì)照溶液,沉淀即為MIL-100(Fe)。

1.3 溶液的制備

對(duì)照儲(chǔ)備液的制備:精密稱取ICA、CUR對(duì)照品適量,分別置于10 mL棕色容量瓶中,加入乙腈,分別制成1.01 mg·mL-1的ICA對(duì)照儲(chǔ)備液、1.022 mg·mL-1的CUR對(duì)照儲(chǔ)備液。

混合對(duì)照儲(chǔ)備液的制備:精密稱取ICA、CUR對(duì)照品適量,置于10 mL棕色容量瓶中,加入乙腈,制成含1.01 mg·mL-1ICA、1.022 mg·mL-1CUR的混合對(duì)照儲(chǔ)備液。

1.4 ICA/CUR@MIL-100(Fe)的載藥量測(cè)定

1.4.1 色譜條件

Agilent C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫25 ℃;流動(dòng)相為乙腈-水溶液(含8%冰醋酸、0.08 mol·L-1十二烷基硫酸鈉、0.002 mol·L-1磷酸氫二鈉)(48∶52,體積比,下同);流速1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)376 nm;進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2 載藥量的計(jì)算

按1.2方法平行制備3份雙載藥復(fù)合物ICA/CUR@MIL-100(Fe),分別精密移取200 μL載藥上清液和載藥原液(未加載體的藥物溶液)于10 mL容量瓶中,加流動(dòng)相至刻度,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣,記錄峰面積,按下式計(jì)算載藥量:

式中:m0為加入的藥物質(zhì)量,mg;m1為載藥后上清液中游離的藥物質(zhì)量,mg;m為MIL-100(Fe)的加入質(zhì)量,mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 ICA/CUR@MIL-100(Fe)的表征

2.1.1 紅外光譜分析

采用KBr壓片法,在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)分別對(duì)ICA、CUR、MIL-100(Fe)和ICA/CUR@MIL-100(Fe)進(jìn)行掃描,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 ICA、CUR、MIL-100(Fe)和ICA/CUR@MIL-100(Fe)的紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of ICA,CUR,MIL-100(Fe),and ICA/CUR@MIL-100(Fe)

由圖1可知,對(duì)于MIL-100(Fe)的紅外光譜曲線,486 cm-1、619 cm-1處分別為Fe-O和Fe-O-Fe的伸縮振動(dòng)峰;941 cm-1處為Fe-O的四邊形和八邊形幾何結(jié)構(gòu)的伸縮和彎曲振動(dòng)峰;1 454 cm-1、1 379 cm-1、760 cm-1、712 cm-1處的中強(qiáng)吸收峰為MIL-100(Fe)的特征峰;1 633 cm-1處為C=O振動(dòng)峰;1 108 cm-1處為苯環(huán)中羧酸根的C-H彎曲振動(dòng)峰;3 425 cm-1處為水分子的典型伸縮振動(dòng)峰,與文獻(xiàn)[11]報(bào)道相似。對(duì)于ICA/CUR@MIL-100(Fe)的紅外光譜曲線,MIL-100(Fe)的特征峰基本完全保留,而ICA的C=O伸縮振動(dòng)峰(1 718 cm-1處)紅移到1 686 cm-1處,這是由于,ICA與MIL-100(Fe)中苯環(huán)的共軛作用使π電子的離域增大,減小了C=O鍵的鍵級(jí);另外,可以明顯看到1 510 cm-1處ICA和CUR的C=C骨架振動(dòng)峰及1 278 cm-1處CUR的酮基振動(dòng)峰,證明ICA和CUR成功負(fù)載于MIL-100(Fe)中。

2.1.2 Zeta電位分析

取稀釋適當(dāng)倍數(shù)后的MIL-100(Fe)和ICA/CUR@MIL-100(Fe)分散液適量,用粒徑電位儀分別測(cè)定MIL-100(Fe)和ICA/CUR@MIL-100(Fe)的Zeta電位,平行測(cè)定3次,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 MIL-100(Fe)和ICA/CUR@MIL-100(Fe)的Zeta電位Fig.2 Zeta potentials of MIL-100(Fe) and ICA/CUR@MIL-100(Fe)

由圖2可知,MIL-100(Fe)、ICA/CUR@MIL-100(Fe)的Zeta電位分別為(-47.1±3.5) mV、(-36.6±2.0) mV,載藥前后的Zeta電位相差較大,進(jìn)一步證明ICA和CUR成功負(fù)載于MIL-100(Fe)中。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專屬性

取空白對(duì)照溶液和供試溶液,按1.4.1色譜條件進(jìn)樣分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 空白對(duì)照溶液和供試溶液的HPLC圖譜Fig.3 HPLC spectra of blank control solution and test solution

由圖3可知,MIL-100(Fe)對(duì)ICA、CUR出峰沒(méi)有干擾,ICA和CUR的保留時(shí)間分別為4.53 min和6.34 min,分離度較好,達(dá)到1.5以上,專屬性強(qiáng)。

2.2.2 線性關(guān)系

在避光條件下,分別精密吸取0.05 mL、0.1 mL、0.3 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL混合對(duì)照儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中,用流動(dòng)相定容至刻度,得系列濃度(ICA:5.05、10.10、30.30、60.60、80.80、101.00,μg·mL-1;CUR:5.11、10.22、30.66、61.32、81.76、102.20,μg·mL-1)的混合對(duì)照溶液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣,記錄峰面積。以進(jìn)樣量(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ICA標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y1=23107x1+11542,R2=0.9999,在5.05～101.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;CUR標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y2=28467x2+16145,R2=0.9999,在5.11～102.20 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度

在避光條件下,精密吸取經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后的混合對(duì)照儲(chǔ)備液,連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄峰面積。結(jié)果顯示,ICA峰面積的RSD值為0.39%,CUR峰面積的RSD值為1.41%,均小于2%,說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性

在避光條件下,精密吸取6份相同條件下制備的供試溶液于10 mL容量瓶中,用流動(dòng)相定容至10 mL,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣,記錄峰面積。結(jié)果顯示,ICA峰面積的RSD值為0.58%,CUR峰面積的RSD值為1.28%,均小于2%,說(shuō)明該方法的重復(fù)性較好。

2.2.5 穩(wěn)定性

在避光條件下,取同一份供試溶液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,分別于0 h、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、12 h 進(jìn)樣,記錄峰面積。結(jié)果顯示,ICA峰面積的RSD值為0.96%,CUR峰面積的RSD值為1.92%,均小于2%,說(shuō)明供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.6 加標(biāo)回收率

在避光條件下,在3份等體積的已知濃度的供試溶液中分別加入濃度為80%、100%和120%的ICA和CUR混合對(duì)照儲(chǔ)備液,用流動(dòng)相定容至10 mL,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣,記錄峰面積,平行測(cè)定3次,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加標(biāo)回收率結(jié)果

由表1可知,ICA、CUR的平均加標(biāo)回收率分別為100.06%±0.81%、101.07%±1.59%,RSD值分別為0.81%、1.57%,均小于2%,表明該方法的準(zhǔn)確度較高。

2.3 載藥量的測(cè)定(表2)

表2 ICA/CUR@MIL-100(Fe)的載藥量

由表2可知,ICA、CUR的平均載藥量分別為12.33%±0.66%、26.97%±1.59%。

2.4 討論

2.4.1 流動(dòng)相的選擇

以乙腈-水溶液(含4%冰醋酸、0.08 mol·L-1十二烷基硫酸鈉、0.002 mol·L-1磷酸氫二鈉)(50∶50)為流動(dòng)相時(shí),ICA色譜峰峰形良好,但CUR色譜峰拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重。發(fā)現(xiàn),通過(guò)改變冰醋酸含量及乙腈比例可以改善CUR的拖尾現(xiàn)象,當(dāng)以乙腈-水溶液(含8%冰醋酸、0.08 mol·L-1十二烷基硫酸鈉、0.002 mol·L-1磷酸氫二鈉)(48∶52)為流動(dòng)相時(shí),ICA和CUR峰型均較好,且ICA和CUR色譜峰的對(duì)稱因子、理論塔板數(shù)及分離度均達(dá)到要求。故選擇流動(dòng)相為乙腈-水溶液(含8%冰醋酸、0.08 mol·L-1十二烷基硫酸鈉、0.002 mol·L-1磷酸氫二鈉)(48∶52)。

2.4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在200～600 nm范圍內(nèi)分別對(duì)ICA對(duì)照溶液和CUR對(duì)照溶液進(jìn)行紫外可見(jiàn)掃描,結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知,ICA對(duì)照溶液在220 nm、256 nm處有最大紫外吸收,CUR在420 nm處有最大紫外吸收,且ICA和CUR的紫外可見(jiàn)吸收光譜在376 nm處存在重疊。為在同一波長(zhǎng)下能同時(shí)測(cè)定ICA和CUR含量,選擇376 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3 結(jié)論

以ICA和CUR為模型藥物,以MIL-100(Fe)為藥物載體,采用浸漬吸附法制備了雙載藥復(fù)合物ICA/CUR@MIL-100(Fe),建立了同時(shí)測(cè)定ICA/CUR@MIL-100(Fe)中ICA、CUR載藥量的HPLC法。結(jié)果表明,在確定的色譜條件下,ICA和CUR的色譜峰分離度達(dá)到1.5以上,分離效果較好,且MIL-100(Fe)對(duì)ICA和CUR的測(cè)定無(wú)干擾,該方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率的RSD值均小于2%,符合制劑含量測(cè)定要求。ICA和CUR的平均載藥量分別為12.33%±0.66%、26.97%±1.59%。該研究為新型藥物制劑的研究奠定了基礎(chǔ)。