磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗RA-33、抗CCP 抗體及類風(fēng)濕因子的臨床應(yīng)用評(píng)估①

荀春華 江代紅 瞿 ?。ㄖ貞c市巴南區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400055）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜明顯增厚并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成以及由此造成的多個(gè)關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞，最終導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)節(jié)畸形，早期診斷是獲得最佳治療效果的關(guān)鍵因素［1-2］。生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對(duì)RA 的早期診斷和篩查具有重要作用。目前臨床上使用的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要為類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（anticyclic citrullinated protein/peptide antibodies，anti-CCP），兩者作為實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)被納入美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)/歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟（ACR/EULAR）RA 分類標(biāo)準(zhǔn)［3-4］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)RF 亞型的檢測(cè)對(duì)RA 的診斷和鑒別具有一定應(yīng)用價(jià)值［5］?？筊A33（anti-RA33）抗體是1996年以來(lái)被認(rèn)為對(duì)RA診斷特異度高的自身抗體，但近幾年才應(yīng)用于臨床［6］。臨床上檢測(cè)這些自身抗體主要采用ELISA 法，也有用化學(xué)發(fā)光法和免疫比濁法［7-9］。而基于磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法是近十余年來(lái)新興的檢測(cè)方法，具有靈敏度高、重復(fù)性好、快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)［10-13］。重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院引進(jìn)了國(guó)產(chǎn)化學(xué)發(fā)光儀，采用配套試劑可同時(shí)對(duì)anti-RA33、anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG 五項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，本文擬采用回顧性分析lis 系統(tǒng)中的檢測(cè)數(shù)據(jù)，結(jié)合臨床診斷，以此評(píng)估磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)RA 相關(guān)自身抗體的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：1 個(gè)月以上未使用免疫抑制劑治療，臨床診斷為RA（均符合2010年歐洲風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂標(biāo)準(zhǔn)）［3］。共納入105 例 RA 患者［平均年齡（57±12）歲，女79 例，男26 例］及年齡和性別匹配的疾病對(duì)照組71 例［平均年齡（56±13）歲，女55，男16 例］，其中骨關(guān)節(jié)炎34 例、臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)痛20例、結(jié)締組織病17例。本研究獲得重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［（2020）倫審（002）號(hào)］。

1.2 方法 anti-RA33、anti-CCP、RF、RF-IgG、RFIgM 均采用商品化的亞輝龍化學(xué)發(fā)光儀（型號(hào)：iFlash3000）及配套試劑（批號(hào)20211101）檢測(cè)，檢測(cè)原理均為吖啶酯標(biāo)記的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法，最終檢測(cè)產(chǎn)物為抗原-抗體-吖啶酯標(biāo)記的二抗復(fù)合物，所有操作均按照說(shuō)明書進(jìn)行，分別以anti-RA33<16 AU/ml、anti-CCP<5.0 U/ml、RF<16 AU/ml、RF-IgG<16 AU/ml、RF-IgM<15 U/ml判斷為陰性。

計(jì)算各指標(biāo)的靈敏度（sensitivity，Se）、特異度（specificity，Sp）、約登指數(shù)（Youden index，YDI）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（positive predict value，PPV）、陰性預(yù)測(cè)值（negative predict value，NPV）、陽(yáng)性似然比（+LR）和陰性似然比（-LR），評(píng)價(jià)各指標(biāo)對(duì)RA的診斷價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行，各指標(biāo)均不服從正態(tài)分布，偏態(tài)分布的資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（QR）］表示，兩組比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，采用Spearman 相關(guān)分析檢測(cè)變量間的相關(guān)性，受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析各檢測(cè)指標(biāo)對(duì)RA 的診斷價(jià)值，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組各指標(biāo)檢測(cè)水平比較 RA 組血清anti-CCP、RF、RF-IgG、RF-IgM 水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而anti-RA33 在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表1）。

表1 非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析兩組各指標(biāo)血清水平差異［median（QR）］Tab.1 Nonparametric Mann-Whitney U test was used to analyze difference in serum levels between two groups ［median（QR）］

2.2 各指標(biāo)的臨床評(píng)價(jià) 各自身抗體中，對(duì)RA 診斷的約登指數(shù)、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值最高的是anti-CCP，anti-RA33 對(duì)RA 診斷的靈敏度最低但特異度最高，RF-IgG 對(duì)RA 診斷的靈敏度最高，約登指數(shù)第2，但特異度最低（表2）。

表2 5種自身抗體對(duì)RA診斷指標(biāo)的評(píng)價(jià)Tab.2 Evaluation on five kinds of autoantibodies as diagnostic indexes of RA

2.3 ROC 曲線分析 ROC 曲線分析結(jié)果顯示anti-RA33、anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG 曲線下面積分（AUC）別為0.520、0.870、0.816、0.848、0.853，95%置信區(qū)間分別為0.434～0.607、0.815～0.925、0.752～0.879、0.790～0.906、0.796～0.911，除 了RA33P=0.649 外，其余P均=0.000，提示抗CCP 抗體、RF、RF-IgM、RF-IgG 對(duì)RA 診斷具有重要價(jià)值（圖1）。

圖1 ROC曲線分析Fig.1 ROC curve analysis

2.4 相關(guān)性分析 RA 組中，Spearman 相關(guān)分析顯示（表3），anti-RA33 與anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）。Anti-CCP 與RF、RF-IgM、RF-IgG呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性（P<0.05），RF與RF-IgM、RF-IgG 高度相關(guān)（P<0.05），RF-IgM 與RF-IgG 相關(guān)性顯著（P<0.05）。由此可見(jiàn)，anti-RA33 與其余4 項(xiàng)指標(biāo)（Anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG）無(wú)顯著相關(guān)性，而這4項(xiàng)指標(biāo)在RA中的血清水平高度相關(guān)。

表3 Spearman檢驗(yàn)分析RA組各指標(biāo)相關(guān)性Tab.3 Correlation analysis of each index in RA group by Spearman test

3 討論

HASSFELD 等［14-15］采用免疫印跡法首次報(bào)道在RA患者中檢測(cè)出抗RA-33（anti-RA33）抗體，該抗體與分子量33 kD 的核酸蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此被命名為anti-RA33 抗體，且在RA 早期診斷指標(biāo)中，抗RA33 特異度最高，陽(yáng)性率不高，大多在40%以下。Anti-CCP 抗體是臨床上應(yīng)用最多的診斷RA 的自身抗體，該抗體具有較高的靈敏度和特異度［2-4］；RF 是由于感染因子引起體內(nèi)產(chǎn)生的以變性IgG 為抗原的特異抗體，主要存在于RA 患者血清中，IgM-RF、IgG-RF、IgA-RF 的定量檢測(cè)對(duì)于提高RA 早期確診率、降低漏診率、評(píng)估疾病活動(dòng)度均有重要意義［16］。

早期自身抗體的檢測(cè)大多采用免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，近十年來(lái)，隨著化學(xué)發(fā)光法在臨床的普及，越來(lái)越多的項(xiàng)目采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，基于磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光儀已經(jīng)遍布中國(guó)大大小小的醫(yī)院，本實(shí)驗(yàn)采用的方法原理為直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)的兩步間接免疫測(cè)試法。

通過(guò)檢測(cè)受試者血清 anti-CCP、anti-RA33、RF、RF-IgG、RF-IgM，除anti-RA33 外，所測(cè)指標(biāo)在RA 組均明顯高于疾病對(duì)照組；本研究中anti-CCP 的靈敏度和特異度分別為70.48%和95.77%，與其他研究結(jié)果相符［2，7，9］。本研究所測(cè)指標(biāo)中anti-CCP 對(duì)RA的約登指數(shù)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值以及AUC 均大于其他指標(biāo)，說(shuō)明 anti-CCP 在RA 診斷中確有較高價(jià)值。

采用ELISA 檢測(cè)沙特阿拉伯人血清anti-RA33抗體，診斷RA 的靈敏度為7.32%、特異度為95.12%，anti-RA33 自身抗體似乎不是確診RA 患者的重要免疫診斷標(biāo)志物，在其他系統(tǒng)性結(jié)締組織疾病中存在一定的陽(yáng)性率［17-18］。進(jìn)一步研究顯示anti-RA33 抗體在165 例俄羅斯RA 患者中檢測(cè)出24 例（14.5%）、58 例SPA 患者中檢測(cè)出6 例（10.3%）、65 例SSc 患者中檢測(cè)出11 例（16.9%）、50 例SLE 患者中檢測(cè)出4例（8.0%），提示其并非RA患者特有的標(biāo)志物，因此，對(duì)于其是否為RA 診斷的特異性標(biāo)志物尚存在一定的爭(zhēng)議［19］。本研究也證明anti-RA33出現(xiàn)的陽(yáng)性率僅為8.57%，且在RA 組anti-RA33 血清水平并不高于疾病對(duì)照組，相關(guān)分析顯示anti-RA33 血清水平與anti-CCP、RF、RF-IgG、RF-IgM 均無(wú)顯著相關(guān)性，anti-CCP、RF、RF-IgG、RF-IgM 檢測(cè)水平相互高度相關(guān)；ROC 曲線分析顯示anti-RA33的AUC 僅為0.52，anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG 的AUC 均大于0.8，提示anti-RA33 對(duì)RA 的診斷價(jià)值不大，anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG 對(duì)RA 診斷具有重要價(jià)值。

綜上所述，ani-RA33 診斷RA 靈敏度過(guò)低，作為初篩實(shí)驗(yàn)容易漏診；anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG對(duì)RA 具有重要診斷價(jià)值，可用于RA 疾病初篩檢測(cè)。Anti-CCP 仍然是5 種自身抗體診斷準(zhǔn)確性最高的自身抗體，可用于RA 的初篩和確診。本研究采用的方法是基于吖啶酯磁微粒化學(xué)發(fā)光法，所檢測(cè)RA 相關(guān)抗體符合臨床診斷和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，值得推廣和應(yīng)用。