食物中添加葡萄糖對斑翅果蠅發(fā)育與腸道細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

高歡歡, 趙 猛, 劉 利, 龍詩穎, 張安盛, 周仙紅, 莊乾營,*

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 濟南 250100; 2.山東省葡萄研究院, 濟南 250100;3. 滕州市植保檢疫站, 滕州 277599)

斑翅果蠅Drosophilasuzukii隸屬雙翅目(Diptera)果蠅科(Drosophilidae)果蠅屬Drosophila,分布廣泛,偏好于取食剛剛成熟的新鮮水果(Goodhueetal., 2011; Milanetal., 2012)。寄主多達60余種,如櫻桃、草莓、藍莓、黑莓、葡萄及油桃等,可造成大量減產(chǎn),嚴重時甚至絕收,2013年被列入檢驗檢疫名單,成為全球關(guān)注的重要害蟲之一。與斑翅果蠅生態(tài)位不同的是,黑腹果蠅Drosophilamelanogaster以成熟后期的腐爛水果為食,屬于腐生型果蠅。腐爛水果中的微生物性蛋白質(zhì)含量豐富(Becheretal., 2012),可為腐生性果蠅提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)。但新鮮水果中糖類和其他碳水化合物較多,蛋白質(zhì)和氨基酸則相對缺乏,斑翅果蠅需要降解新鮮水果中大量的糖類物質(zhì),以滿足自身的營養(yǎng)需求。斑翅果蠅對于糖含量高的水果具有較強的適應(yīng)性,而腐爛水果發(fā)酵后乙醇和乙酸含量較高,斑翅果蠅對其耐受性遠低于黑腹果蠅(高歡歡等, 2018; Gaoetal., 2018)。在新鮮的櫻桃、草莓、葡萄、蘋果和番茄 5 種寄主水果中,斑翅果蠅在含糖量高且果皮硬度低的櫻桃和草莓上產(chǎn)卵量最高(駱亞琴等, 2015)。斑翅果蠅對同種水果不同品種的產(chǎn)卵選擇性也與寄主中糖類物質(zhì)正相關(guān)(Liuetal., 2019; 高歡歡等, 2020)。因此,斑翅果蠅自身一定存在相應(yīng)的代謝機制以適應(yīng)高糖低蛋白的生態(tài)位,其適生性機制將成為其成災(zāi)機制研究中的關(guān)鍵問題之一。

昆蟲腸道中的共生菌可參與寄主的能量與代謝的平衡,為宿主昆蟲的生長發(fā)育和繁殖提供所需要的營養(yǎng)成分,彌補昆蟲自身代謝的缺陷(Douglas, 2009)。例如,黑腹果蠅腸道內(nèi)較為穩(wěn)定的微生物包括釀酒酵母Saccharomycescerevisiae(DSM1333)、植物乳桿菌Lactobacillusplantarum(DSM-20174)和醋酸菌Acetobactermalorum,在飼料中添加這些腸道微生物可顯著提高其產(chǎn)卵量、取食量以及體重(Qiaoetal., 2019)。腸道內(nèi)的醋酸菌Acetobacterpomorum可以通過胰島素/胰島素樣生長因子信號通路(insulin/IGF-1 signaling pathway, IIS)提高黑腹果蠅體內(nèi)乙醇脫氫酶的活性,以適應(yīng)酒精含量升高的腐爛水果(Shinetal., 2011)。已有研究證明,腸道菌可參與寄主昆蟲的糖類代謝,例如,Rhynchophorusferrugineus腸道中的克雷伯氏菌Klebsiellasp.、沙雷氏桿菌Serratiasp.、腸桿菌Enterobactersp.和檸檬酸桿菌Citrobactersp.均能調(diào)控糖苷水解酶基因的表達,從而降解植物中的纖維素、蔗糖和淀粉等多糖類物質(zhì),調(diào)節(jié)寄主體內(nèi)蛋白和葡萄糖的代謝 (Jiaet

al., 2013; Muhammadetal., 2017; Habinezaetal., 2019)。黑腹果蠅腸道內(nèi)的共生菌可參與寄主體內(nèi)的維生素合成以及脂類物質(zhì)、糖原、葡萄糖、蔗糖等物質(zhì)的代謝(Ridleyetal., 2012; Newell and Douglas, 2014; Douglas, 2017)。去除腸道菌的黑腹果蠅表現(xiàn)出壽命延長、體內(nèi)葡萄糖和甘油三酯含量升高的現(xiàn)象,但重新定殖腸道微生物后,其糖代謝恢復(fù)到了正常果蠅的水平(Newell and Douglas, 2014; Huang and Douglas, 2015; Liuetal., 2021)。

斑翅果蠅腸道共生菌對其生長發(fā)育同樣具有重要的促進作用,去除腸道微生物后,斑翅果蠅的卵孵化率、幼蟲體重、化蛹率及3齡幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量均明顯下降(高歡歡等, 2020)。Bing等(2018)和Lin等(2021)對野外及人工飼料飼養(yǎng)的斑翅果蠅腸道微生物多樣性分別進行了研究,說明斑翅果蠅在取食草莓及藍莓等新鮮水果時需要腸道微生物才可以生存,但斑翅果蠅的腸道微生物是否調(diào)控寄主的糖代謝并沒有相關(guān)的報道。因此本研究通過在食物中添加糖類物質(zhì),對斑翅果蠅的腸道細菌進行多樣性分析,旨在尋找與糖類代謝相關(guān)的細菌類群,為研究斑翅果蠅適應(yīng)高糖低蛋白環(huán)境的代謝機制提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 斑翅果蠅

斑翅果蠅實驗室種群飼養(yǎng)于溫度(25±0.5) ℃、相對濕度70%±0.5%和光周期16L∶8D的人工氣候室中。飼喂以香蕉、蘋果、玉米粉、葡萄糖和酵母為主要成分的常規(guī)飼料(飼料配方見表1,以蒸餾水定容)。此為斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系。

表1 本研究使用的斑翅果蠅人工飼料配方Table 1 Formulation of artificial diets of Drosophila suzukii used in this study

參考高歡歡等(2020)的方法,斑翅果蠅產(chǎn)卵后,收集6-8 h內(nèi)的卵,無菌水清洗卵表面后,用3.0%次氯酸鈉消毒1 min,70%乙醇消毒2次,1 min/次,含0.1% Triton X-100的磷酸緩沖液(pH 7)清洗1次,用無菌水再次清洗后,將卵轉(zhuǎn)移到滅菌后的果蠅人工飼料上,放置于無菌的果蠅管(直徑2.4 cm,高9.5 cm)中,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),建立無菌斑翅果蠅品系。

收集無菌斑翅果蠅體系的卵、幼蟲、蛹和成蟲各30 mg分別研磨,分別稀釋10和100倍后,取200 μL在NA培養(yǎng)基品平板上涂板,在相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,觀察無菌落生長便可判斷無菌果蠅品系創(chuàng)建成功。

1.2 果蠅的存活率測定

將葡萄糖添加至人工飼料中,濃度設(shè)置為5%和10%,以未添加葡萄糖的人工飼料為對照(表1)。高壓滅菌后在超凈工作臺中分別轉(zhuǎn)移至無菌果蠅管(直徑2.4 cm,高9.5 cm)中備用。分別從斑翅果蠅無菌品系和常規(guī)飼養(yǎng)品系中挑取斑翅果蠅6-8 h的卵50粒,放入不同葡萄糖濃度的果蠅管中,每管放1粒卵。分別統(tǒng)計各處理中3齡幼蟲的數(shù)量及羽化成為成蟲的數(shù)量。每個處理重復(fù)3次。

1.3 果蠅體內(nèi)葡萄糖含量測定

在不同濃度葡萄糖處理的斑翅果蠅無菌品系和常規(guī)飼養(yǎng)品系中,各挑取大約1.0 g 3齡幼蟲和羽化后4-5 d的成蟲,在冰上研磨,根據(jù)葡萄糖含量測定試劑盒(A154-1-1,南京建成生物工程研究所)的說明書進行操作,加入相應(yīng)體積的提取液,經(jīng)過離心、加入反應(yīng)液、溫浴等步驟后用酶標(biāo)儀(EMax Plus, Molecular Devices, 上海)進行測定,波長分別為505 nm,每個樣品測定3次作為技術(shù)重復(fù),取其平均值為每個生物學(xué)重復(fù)的值,根據(jù)試劑盒中的公式計算物質(zhì)含量。每個斑翅果蠅品系設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.4 腸道細菌多樣性分析

1.4.1腸道樣品收集和解剖:收集不同濃度葡萄糖處理常規(guī)飼養(yǎng)品系的成蟲(羽化后4-5 d),雌雄分開后在冰上冷卻麻醉。用70%酒精消毒90 s后,無菌水清洗兩次,每次1 min。利用體視顯微鏡(SZX2-ILLB, Olympus, Hatagaya, 日本)在PBS緩沖液(0.2 mol/L, pH 7.2)中解剖斑翅果蠅,取出腸道后放入1.5 mL無菌離心管中,液氮速凍保存于-80 ℃?zhèn)溆?每個處理解剖500頭左右的斑翅果蠅成蟲的腸道作為樣本,雌雄分開,分別設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.4.2DNA抽提、PCR擴增和PacBio三代測序:將上述腸道樣品按照昆蟲NDA提取試劑盒(OMEGA, 美國)說明書提取DNA,并根據(jù)MoBio PowerSoil Kit試劑盒的說明書進行純化。將純化后的高質(zhì)量DNA用無菌水稀釋至1 ng/μL后,對16S rDNA的全長序列進行三代擴增子測序。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,對目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

利用SMRTbellTMTemplate Prep Kit (PacBio)構(gòu)建SMRT Bell文庫,并通過Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100 System檢測文庫質(zhì)量和插入片段大小,隨后用PacBio平臺進行測序。用cutadapt軟件(Version 1.2.1, https:∥pypi.org/project/cutadapt/1.2.1/)、PEAR軟件(Version 0.9.6, https:∥cme.h-its.org/exelixis/web/software/pear/)和PRINSEQ軟件(Version 0.20.4, http:∥prinseq.sourceforge.net/)剔除接頭序列、引物序列、嵌合體和低質(zhì)量序列后,獲得高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)。原始讀段(raw reads)上傳至國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心(National Microbiology Data Center, NMDC)數(shù)據(jù)庫(CRA008396)。

1.4.3α多樣性和β多樣性分析:根據(jù)可操作分類單元(operational taxonomic unit, OUT)豐富度,使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Shannon-Wiener, Simpson, Chao 1和Ace指數(shù)用于分析各處理腸道細菌種群多樣性和豐度。同時,基于weighted_unifrac 距離算法采用Vegan 2.5-3軟件對不同樣品的細菌群落進行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)。

1.4.4OUT聚類、菌群分類注釋及功能預(yù)測:利用Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001,http:∥drive5.com/uparse/)對所有樣品的全部有效讀段(clean reads)進行聚類,默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。用Mothur方法與SILVA(http:∥www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對OTUs代表序列進行物種注釋(設(shè)定閾值為0.8～1.0)。分別在不同分類階元統(tǒng)計各樣本的腸道細菌群落組成。同時,將各樣本中的OTUs代表序列利用微生物群落功能注釋-FAPROTAX數(shù)據(jù)庫進行功能預(yù)測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

不同濃度葡萄糖糖處理下斑翅果蠅幼蟲存活率、羽化率、體內(nèi)葡萄糖含量、腸道菌群Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao 1指數(shù)和Ace指數(shù)以及優(yōu)勢菌種相對豐度的差異均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey氏多重比較的方法進行分析,軟件為SPSS 20.0。

2 結(jié)果

2.1 不同營養(yǎng)條件下斑翅果蠅的存活率

根據(jù)方差分析結(jié)果得知,葡萄糖濃度對無菌斑翅果蠅品系的幼蟲存活率和成蟲羽化率并沒有顯著影響(P>0.05)(圖1: A, B)。對于常規(guī)飼養(yǎng)品系而言,與對照組相比,5%和10%葡萄糖處理組斑翅果蠅的幼蟲存活率分別顯著提高了60.44%和87.87%(P<0.05)(圖1: A),5%葡萄糖處理組成蟲羽化率顯著提高了123.79%(P=0.021),而10%葡萄糖處理并沒有對成蟲羽化率產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)(圖1: B)。由此說明無菌斑翅果蠅成蟲無法利用葡萄糖,而斑翅果蠅共生菌可促進斑翅果蠅對高糖食物的利用,從而滿足其生長發(fā)育的需求(圖1)。

圖1 不同濃度葡萄糖處理下斑翅果蠅無菌品系和常規(guī)飼養(yǎng)品系幼蟲存活率(A)和成蟲羽化率(B)Fig. 1 Larval survival rates (A) and adult eclosion rates (B) of microbiota-free and conventionally reared adults of Drosophila suzukii exposed to different concentrations of glucoseCK: 未添加葡萄糖的人工飼料Artificial diet without adding glucose; Ax: 斑翅果蠅無菌品系Microbiota-free D. suzukii; Con: 斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系Conventionally reared D. suzukii. 圖2同。The same for Fig. 2. 柱上不同字母表示同一品系不同處理間經(jīng)單因素方差分析以及Tukey氏多重比較差異顯著(P<0.05)。Different letters above bars indicate significant difference among different treatments for the same strain by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison test (P<0.05). 下圖同。The same for the following figures.

2.2 不同營養(yǎng)條件下斑翅果蠅成蟲體內(nèi)的葡萄糖含量

隨著葡萄糖濃度的增加,斑翅果蠅無菌品系(Ax)和常規(guī)飼養(yǎng)品系(Con)成蟲體內(nèi)的葡萄糖含量均顯著增加(Ax:P<0.0001; Con:P<0.0001)。在對照條件(取食未添加葡萄糖的飼料)下,無菌品系和常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲體內(nèi)葡萄糖的含量分別僅為(3.40±0.37)和(3.80±0.30)mmol/L。5%和10%葡萄糖處理組中,與無菌品系相比,常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲體內(nèi)中的葡萄糖含量分別降低了39.16%和33.43%,證明無腸道共生菌的斑翅果蠅確實無法利用葡萄糖,其體內(nèi)葡萄糖含量處于較高的水平,而腸道共生菌可促進斑翅果蠅體內(nèi)葡萄糖的利用(圖2)。

圖2 不同濃度葡萄糖處理下斑翅果蠅無菌品系(Ax)和常規(guī)飼養(yǎng)品系(Con)成蟲體內(nèi)葡萄糖含量Fig. 2 Glucose contents in microbiota-free (Ax) and conventionally reared (Con) adults of Drosophila suzukii exposed to different concentrations of glucose

2.3 序列拼接與OTU聚類

通過對不同濃度葡萄糖處理的斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲腸道細菌16S rDNA進行PacBio三代測序,發(fā)現(xiàn)不同葡萄糖濃度、不同性別的斑翅果蠅成蟲腸道菌群測序所得的條帶數(shù)和有效讀段平均長度都有所差異(表2)。其中5%葡萄糖處理組斑翅果蠅雌成蟲(G1f)樣品得到的有效讀段最多(27 435條),10%葡萄糖處理組斑翅果蠅雄成蟲(G2m)樣品的有效讀段最少(22 280條)。 18個樣品通過測序平均得到 30 550 對原始讀段, 經(jīng)拼接、 過濾后平均共產(chǎn)生26 015條有效讀段,有效讀段所占比例為84.84%。有效讀段的平均長度并隨著葡萄糖濃度的增加而增加,其范圍為1 415～1 431 bp,但雌成蟲和雄成蟲間并沒有明顯差別。每個樣品分別獲得的OTU數(shù)量如表2所示,對比不同濃度葡萄糖處理下的斑翅果蠅來看,10%葡萄糖處理下的斑翅果蠅雄成蟲(G2m)獲得的OTU數(shù)量最多。

表2 不同濃度葡萄糖處理下的斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲腸道細菌16S rDNA高通量測序基本信息Table 2 Basic information of high-throughput sequencing of 16S rDNA in the gut of conventionally rearedDrosophila suzukii adults exposed to different concentrations of glucose

2.4 不同濃度葡萄糖處理下斑翅果蠅成蟲腸道細菌α多樣性及β多樣性

斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲腸道細菌的α多樣性分析結(jié)果(圖3)表明:雌雄成蟲腸道菌群的Shannon-Wiener指數(shù)在5%葡萄糖處理組與對照組之間并沒有顯著差異(P>0.05),在10%葡萄糖處理組中則顯著增加(雄:P=0.018; 雌:P=0.001)。與對照組相比,5% 葡萄糖處理組雄成蟲腸道菌群的Simpson指數(shù)顯著降低(P<0.05),但雌成蟲腸道菌群的Simpson指數(shù)沒有顯著變化(P>0.05),10%葡萄糖處理組雌雄成蟲Simpson指數(shù)均顯著提高(雄:P=0.028;雌:P=0.002)。斑翅果蠅雌成蟲和雄成蟲腸道菌群的Chao 1指數(shù)(雄:P=0.500; 雌:P=0.105)和雄成蟲的Ace指數(shù)(P=0.324)并沒有受到葡萄糖的顯著影響,10%葡萄糖處理組中雌成蟲的Ace指數(shù)顯著提高(P=0.024)。由此可見,食物中添加葡萄糖可更多地影響斑翅果蠅雄成蟲腸道菌群的多樣性。

圖3 不同濃度葡萄糖處理下斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲腸道細菌的α多樣性Fig. 3 Alpha diversity of gut bacteria in conventionally reared Drosophila suzukii adults exposed to different concentrations of glucoseA: Shannon-Wiener指數(shù)Shannon-Wiener index; B; Simpson指數(shù)Simpson index; C: Chao 1指數(shù)Chao 1 index; D: Ace指數(shù)Ace index.

為了更直觀地對不同處理的斑翅果蠅腸道細菌差異進行聚類分析,我們采用了PCoA分析(圖4)。結(jié)果表明,葡萄糖的添加以及性別均可明顯影響斑翅果蠅腸道細菌多樣性,不同處理條件下的雌雄成蟲腸道細菌間存在重疊。

圖4 不同濃度葡萄糖處理下斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲腸道細菌的主坐標(biāo)分析(PCoA)圖Fig. 4 Principal co-ordinates analysis (PCoA) plot of gut bacteria in conventionally reared Drosophila suzukii adults exposed to different concentrations of glucose樣本名稱同表2。下圖同。The sample name was the same as in Table 2. The same for the following figures.

2.5 不同濃度葡萄糖處理下斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系腸道細菌的核心菌群

通過OTU聚類分析,將斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系不同比較組中的腸道細菌以屬為分類階元制作韋恩圖(圖5: A),并對核心菌群進行注釋分析(圖5: B),發(fā)現(xiàn)不同濃度葡萄糖處理組所有樣品的核心菌群為24個OTU,主要為隸屬于醋桿菌科的葡萄桿菌屬Gluconobacter(10個)、醋桿菌屬Acetobacter(5個)、Commensalibacter(1個)和2個隸屬于醋桿菌科的未知菌屬,共占據(jù)75%;其次為隸屬于腸桿菌科的摩根氏菌屬Morganella(1個)和普羅維登斯菌屬Providencia(1個),隸屬于鏈球菌科的和腸球菌屬Enterococcus(1個)、乳球菌屬Lactococcus(1個)和明串珠菌屬Leuconostoc(1個),以及隸屬于α變形菌綱(Alphaproteobacteria)的未知菌屬(1個)等。

圖5 斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲不同比較組中腸道細菌的韋恩圖(A)及核心可操作分類單元(OTU)數(shù)量(B)Fig. 5 Venn diagram (A) and core operational taxonomic unit (OTU) number (B) of gut bacteria in conventionally reared Drosophila suzukii adults in different comparison groups

2.6 不同濃度葡萄糖處理下斑翅果蠅成蟲腸道細菌群落組成

斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系腸道樣本在門、科、屬和種4個分類階元水平上的細菌群落組成情況如圖6所示。在門分類階元水平,斑翅果蠅腸道細菌主要有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、 藍細菌門 (Cyanobacteria) 及擬桿菌門 (Bacteroidetes)等。對照組和 5%葡萄糖處理組的斑翅果蠅雌雄成蟲腸道優(yōu)勢菌群均是變形菌門,其相對豐度均在90%以上;10%葡萄糖處理組中厚壁菌門所占的比例有所上升(雌: 11.53%; 雄:10.96%),但仍以變形菌門為優(yōu)勢菌群(圖6: A)。

在科分類階元水平,斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲腸道細菌主要有醋桿菌科(Acetobacteraceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)等。對照組和5%葡萄糖組的斑翅果蠅雌雄成蟲腸道優(yōu)勢菌群均是醋桿菌科,其中5%葡萄糖處理組雌蟲腸道中腸桿菌科細菌相對豐度達到11.09%,也成為了其優(yōu)勢菌群;10%葡萄糖處理組成蟲的優(yōu)勢菌群是醋桿菌科 (雌: 63.94%;雄: 53.95%) 和腸桿菌科(雌: 16.34%; 雄: 29.78%)(圖6: B)。

在屬分類階元水平,斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲腸道細菌主要有葡萄桿菌屬Gluconobacter、乳球菌屬Lactococcus、摩根氏菌屬Morganella、醋桿菌屬Acetobacter、普羅維登斯菌屬Providencia、金黃桿菌屬Chryseobacterium和明串珠菌屬Leuconostoc等(圖6: C)。對照組斑翅果蠅的腸道優(yōu)勢菌群主要為葡萄桿菌屬、醋桿菌屬和金黃桿菌屬,在雌雄成蟲腸道中的總相對豐度分別為95.47%和94.36%,其中葡萄桿菌屬的相對豐度均超過80%;隨著葡萄糖濃度的增加,葡萄桿菌屬在雌雄成蟲腸道中的相對豐度不斷下降,且在雄成蟲中的相對豐度低于雌成蟲中的,而優(yōu)勢菌群的種數(shù)明顯增加;5%葡萄糖處理組雄蟲腸道中的醋桿菌屬相對豐度增加至28.38%,成為僅次于葡萄桿菌屬(62.61%)的優(yōu)勢菌群;10%葡萄糖處理組成蟲腸道中的優(yōu)勢菌群為葡萄桿菌屬、摩根氏菌屬、醋桿菌屬、普羅維登斯菌屬和明串珠菌屬,其中雄成蟲腸道中的摩根氏菌屬相對豐度達到21.44%。

在種分類階元水平,斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲腸道細菌的優(yōu)勢菌種為乳酸乳球菌Lactococcuslactis、弗氏葡萄桿菌Gluconobacterfrateurii、醋桿菌A.thailandicus,A.malorum和A.persici、以及產(chǎn)堿普羅維斯登菌Providenciaalcalifaciens(圖6: D)。對照組的優(yōu)勢種為弗氏葡萄桿菌,在雌雄成蟲腸道中的相對豐度分別為31.57%和39.33%,5%葡萄糖處理組雄成蟲腸道中弗氏葡萄桿菌和醋桿菌相對豐度均較高,分別為26.62%和25.32%,但雌成蟲中沒有較為明顯的優(yōu)勢種,10%葡萄糖處理組的優(yōu)勢種為弗氏葡萄桿菌、醋桿菌和產(chǎn)堿普羅維斯登菌。

通過Tukey氏多重比較的方法對不同處理間前4種優(yōu)勢種的相對豐度進行差異顯著性分析,如圖7所示。隨著葡萄糖濃度的增加,斑翅果蠅成蟲腸道中乳酸乳球菌的相對豐度顯著增加(雄:P=0.01;雌:P=0.037),且在雌成蟲中的相對豐度明顯高于在雄成蟲中的(圖7:A)。除了5%葡萄糖處理組雄成蟲外,弗氏葡萄桿菌在其他處理斑翅果蠅腸道中的相對豐度均較高,添加5%葡萄糖顯著降低了該菌的相對豐度(雄:P<0.001; 雌:P=0.002)(圖7: B);雄成蟲腸道中A.thailandicus的相對豐度并未受到葡萄糖濃度的影響,但在雌成蟲中,與未添加葡萄糖人工飼料飼喂的對照相比,添加5%的葡萄糖顯著增加了醋桿菌A.thailandicus的相對豐度(P<0.0001)(圖7: C); 葡萄糖的添加顯著增加了產(chǎn)堿普羅維斯登菌在雄成蟲腸道中的相對豐度(P=0.042),但只有添加10%的葡萄糖可增加雌成蟲中該菌的相對豐度(P=0.049)(圖7: D)。

圖7 不同濃度葡萄糖處理下前4種腸道細菌在斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲腸道內(nèi)的相對豐度Fig. 7 Relative abundance of top 4 bacterial species in the gut of conventionally reared Drosophila suzukii adults exposed to different concentrations of glucoseA: 乳酸乳球菌Lactococcus lactis; B: 弗氏葡萄桿菌Gluconobacter frateurii; C: 醋桿菌Acetobacter thailandicus; D: 產(chǎn)堿普羅維斯登菌Providencia alcalifaciens.

2.7 腸道共生菌功能預(yù)測

在未添加葡萄糖的人工飼料飼喂的對照組雌成蟲和雄成蟲腸道菌群中,可注釋為化學(xué)異養(yǎng)作用和好氧-化學(xué)異養(yǎng)作用的OUTs總相對豐度分別為92.29%和95.50%,在人工飼料中添加5%葡萄糖后,可注釋為化學(xué)異養(yǎng)作用和好氧-化學(xué)異養(yǎng)作用的OUTs總相對豐度在雌成蟲中為92.75%,但在雄成蟲中下降為79.45%,注釋為發(fā)酵作用的OTUs的相對豐度在雌成蟲和雄成蟲中分別增加至2.08%和3.54%,同時在雄成蟲中尿素分解作用以及人類疾病和動物疾病相關(guān)的OTUs相對豐度也有所增加(圖8)。添加10%葡萄糖后,化學(xué)異養(yǎng)作用和好氧-化學(xué)異養(yǎng)作用相關(guān)的菌群數(shù)量繼續(xù)降低,在雌成蟲和雄成蟲中分別占比56.70%和52.52%,而硝酸還原作用相關(guān)的菌群數(shù)量增加,在雌雄成蟲腸道菌群中的比例分別增加至9.25%和2.44%,尿素分解作用相關(guān)的菌群在雌雄成蟲腸道菌群中所占比例分別增加至19.91%和9.21%,發(fā)酵作用相關(guān)的菌群在雌雄成蟲腸道菌群中所占比例分別增加至18.71%和8.51%(圖8)。說明,斑翅果蠅腸道菌群可能通過發(fā)酵作用、硝酸還原作用和尿素分解作用參與宿主的糖代謝。

圖8 不同濃度葡萄糖處理下斑翅果蠅常規(guī)飼養(yǎng)品系成蟲腸道細菌功能分析Fig. 8 Functional analysis of gut bacteria of conventionally reared Drosophila suzukii adults exposed to different concentrations of glucose

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),添加適量的葡萄糖可提高斑翅果蠅的幼蟲存活率和成蟲羽化率,促進野生果蠅的生長,但去除腸道微生物的斑翅果蠅無法利用葡萄糖作為自身的碳源(圖1)。Bing等(2018)也證明斑翅果蠅在取食草莓、藍莓等新鮮水果時需要腸道微生物才可以生存,由此可見,腸道微生物對于果蠅的糖類代謝起到不可或缺的作用,而斑翅果蠅在糖類含量高而蛋白含量低的新鮮水果中,必然需要腸道微生物的輔助代謝作用。為了尋找與斑翅果蠅糖代謝相關(guān)的腸道菌群,我們通過設(shè)定不同的營養(yǎng)條件,對其腸道微生物多樣性進行分析,發(fā)現(xiàn)斑翅果蠅的核心菌群主要為醋桿菌科的葡萄桿菌屬、醋桿菌屬和腸桿菌科的摩根氏菌屬和普羅維登斯菌屬(圖5),這與前人的研究結(jié)果一致。Chandler等(2011)分析了14個果蠅物種的腸道微生物多樣性,發(fā)現(xiàn)相對豐度較高的為腸桿菌科、醋桿菌科、乳桿菌科、腸球菌科。斑翅果蠅主要以醋桿菌科和腸桿菌科為其優(yōu)勢菌群(Martinez-Saudoetal., 2018),其中醋桿菌科中的醋酸菌屬和葡萄桿菌屬為斑翅果蠅和黑腹果蠅的核心菌群(Martinez-Saudoetal., 2017; Adairetal., 2018; Linetal., 2021)。

昆蟲腸道微生物多樣性與生長環(huán)境、營養(yǎng)條件、宿主發(fā)育階段均密切相關(guān)(Colmanetal., 2012; Yunetal., 2014)。在取食高糖食物的昆蟲腸道中通常以醋酸桿菌科細菌為主,主要包括葡萄桿菌屬和醋桿菌屬(Chouaiaetal., 2014),食物種類的不同會影響其多樣性(Vacchinietal., 2016)。本研究中,斑翅果蠅取食葡萄糖后,醋桿菌屬、普羅維登斯菌屬和摩根氏菌屬的相對豐度明顯增加(圖6和7)。目前已有多項研究證明了黑腹果蠅腸道菌群在糖原、葡萄糖和海藻糖等能量物質(zhì)代謝中的作用(Douglasetal., 2017)。蜜蜂腸道中的副干酪乳桿菌Lactobacillusparacasei可以利用果糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、半乳糖和乳糖等作為碳源(Zhangetal., 2021)。腸道微生物可促進黑腹果蠅對葡萄糖和甘油三酯的代謝,特別是醋桿菌科的細菌,可調(diào)節(jié)果蠅體內(nèi)的胰島素信號,以足夠高的速率降解糖類物質(zhì)從而減少脂質(zhì)儲存(Shinetal., 2011; Chastonetal., 2013; Huang and Douglas, 2015)。蘋果醋酸桿菌A.malorum和A.orientalis均能促進黑腹果蠅幼蟲的生長發(fā)育(李玉娟等, 2017; 王露等, 2021),我們的結(jié)果中,A.thailandicus,A.malorum和A.persici是斑翅果蠅腸道中3種相對豐度最高的醋酸菌,并且A.thailandicus的相對豐度在添加葡萄糖后顯著增加(圖6),因此該菌很有可能參與了斑翅果蠅的糖類代謝,其代謝機制需要通過創(chuàng)建無菌品系和回補腸道菌的方式進行進一步研究。也有一類腸道細菌直接降解植物中的多糖類物質(zhì),如蜜蜂體內(nèi)的腸道菌群雙歧桿菌Bifidobacterium和吉列菌Gilliamella可以將花粉中的半纖維素和果膠轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸(Zhengetal., 2017)。雖然黑腹果蠅腸道細菌也可將部分多糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為短碳鏈脂肪酸,但這并不是果蠅獲得能量的主要來源(Fischer, 2017; Kimetal., 2018)。另外我們還發(fā)現(xiàn),腸桿菌科的普羅維登斯菌屬和摩根氏菌屬的相對豐度也會隨著葡萄糖的添加而顯著增加(圖6),這兩種菌可能也與斑翅果蠅的糖類代謝密切相關(guān)。

另外,腸道微生物也可以參與宿主蛋白質(zhì)或者氨基酸的代謝,如黑腹果蠅的腸道菌群可以通過合成某些必需氨基酸或者通過把含氮廢物回收為氨基酸的方式來提高果蠅生長發(fā)育所需的蛋白質(zhì)營養(yǎng)(Yamadaetal., 2015)。腸道菌群中的各種細菌和酵母促進果蠅的蛋白質(zhì)營養(yǎng),尤其是雌性果蠅,這種相互作用有助于延長果蠅的壽命(Storellietal., 2011; Wongetal., 2014; Yamadaetal., 2015)。本研究對斑翅果蠅腸道菌群進行了功能預(yù)測,發(fā)現(xiàn)取食葡萄糖后的斑翅果蠅腸道細菌可更多地注釋到發(fā)酵作用、硝酸還原作用和尿素分解等功能中(圖8)。Bing等(2018)證明斑翅果蠅的腸道微生物[如乳酸菌屬Lactobacillus、乳球菌屬、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)]可為斑翅果蠅提供生長發(fā)育所需要的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。由此可見,本研究中在添加葡萄糖后,相對豐度有所增加的乳球菌屬細菌對于斑翅果蠅體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝具有重要的作用,但具體代謝機制仍需要進一步的研究和驗證。

斑翅果蠅作為全球重要的果樹害蟲之一,其對高糖低蛋白營養(yǎng)條件的適生性較強是其危害性極大的重要原因之一。因此,可在腸道微生物與宿主共生的角度,以本研究中所預(yù)測的與糖類代謝相關(guān)的腸道細菌為研究對象,對其在宿主代謝中的功能進行進一步的研究和驗證,以期為研究斑翅果蠅的適生性機制,并尋找新的防治靶點提供重要的理論依據(jù)。