煙粉虱卵黃原蛋白通過影響自噬反應(yīng)調(diào)控共生細(xì)菌Rickettsia的豐度

孫 想, 劉炳奇, 陳展博, 李 歡, 李楚翹, 洪繼生, 欒軍波

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 沈陽 110866)

共生菌在節(jié)肢動物中普遍存在,根據(jù)共生菌與昆蟲共生關(guān)系的緊密程度,可將昆蟲體內(nèi)的共生菌分為專性共生菌(obligate symbionts)和兼性共生菌(facultative symbionts)兩種類型(Feldhaar, 2011; Douglas, 2015)。專性共生菌通常分布于特化的體細(xì)胞——含菌細(xì)胞內(nèi),為宿主昆蟲生長繁殖提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)(Moranetal., 2008; Douglasetal., 2015);兼性共生菌在宿主體內(nèi)的分布呈多樣化,可存在于含菌細(xì)胞、卵巢、中腸、血淋巴和唾液腺等多個組織中(Douglasetal., 2015; Shanetal., 2019)。雖然次生共生菌不是宿主昆蟲生長繁殖所必需的,但對宿主昆蟲的適應(yīng)性至關(guān)重要(Oliveretal., 2010; Douglas, 2016)。例如,豌豆修尾蚜Megouracrassicauda缺失次生共生菌Regiella后無法在苜蓿上繁殖(Tsuchidaetal., 2011);豌豆蚜Acyrthosiphonpisum次生共生菌Rickettsiella有助于宿主昆蟲躲避天敵的捕食(Oliveretal., 2010);煙粉虱Bemisiatabaci次生共生菌Rickettsia能夠提高宿主昆蟲適合度、增強(qiáng)煙粉虱對病原菌和溫度的抵抗能力(Bruminetal., 2011; Himleretal., 2011; Hendryetal., 2014)。多數(shù)共生菌需要在宿主昆蟲體細(xì)胞或器官中增殖后,借助宿主昆蟲的生殖過程來促進(jìn)自身的垂直傳播(Russelletal., 2019; Perlmutter and Bordenstein, 2020; Fukatsu, 2021)。目前對胞內(nèi)共生菌功能的研究較為廣泛,但對于宿主昆蟲調(diào)控共生菌增殖的分子機(jī)制知之甚少。

卵黃原蛋白(vitellogenin, Vg)作為一個多功能的糖磷脂復(fù)合蛋白,既是昆蟲生殖的關(guān)鍵蛋白(Raikhel and Dhadialla, 1992; Sappington and Raikhel, 1998; Tufail and Takeda, 2008),也是識別宿主昆蟲體內(nèi)的微生物的關(guān)鍵蛋白(Lietal., 2009; Salmelaetal., 2015),在昆蟲繁殖發(fā)育和共生菌遺傳過程中具有重要功能(Sunetal., 2023)。此外,昆蟲細(xì)胞自噬作為一種細(xì)胞免疫機(jī)制,是細(xì)胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器以及感染細(xì)胞的細(xì)菌和病毒經(jīng)溶酶體自我降解的過程(He and Klionsky, 2009)。例如,雷帕霉素飼喂煙粉虱誘導(dǎo)自噬,導(dǎo)致煙粉虱體內(nèi)番茄黃曲葉病毒的外殼蛋白和基因組DNA降解(Wangetal., 2016)。當(dāng)自噬發(fā)生后,自噬蛋白參與調(diào)控自噬體形成和成熟的不同階段(He and Klionsky, 2009)。自噬蛋白Atg8是自噬體形成后唯一保留在自噬體膜上的蛋白質(zhì),因此在許多研究中將Atg8作為自噬發(fā)生的標(biāo)記之一(Voroninetal., 2012; 謝昆等, 2013; Klionskyetal., 2014)。研究發(fā)現(xiàn),自噬參與調(diào)控果蠅Drosophila和米象Sitophilusoryzae共生菌的增殖(Voroninetal., 2012; Vigneronetal., 2014)。沉默煙粉虱Atg8抑制自噬能夠提高煙粉虱的中東小亞細(xì)亞MEAM1隱種含菌細(xì)胞內(nèi)Portiera滴度(Wangetal., 2022)。Vg和自噬通路在昆蟲-共生菌共生關(guān)系維持中均具有重要作用,然而Vg是否通過自噬通路調(diào)控共生菌增殖尚無研究。

在煙粉虱MEAM1隱種蟲體分布著兩類共生菌,其中共生菌Portiera和Hamiltonella分布于含菌細(xì)胞,共生菌Rickettsia分布在含菌細(xì)胞外的其他細(xì)胞(Wangetal., 2020; Baoetal., 2021)。之前的研究表明,抑制Vg表達(dá)導(dǎo)致共生菌Rickettsia和Portiera的豐度顯著下降(Bruminetal., 2020; Sunetal., 2023);并且煙粉虱共生菌Rickettsia和Portiera豐度的變化與自噬有關(guān)(Shanetal., 2021; Wangetal., 2022)。前人研究發(fā)現(xiàn),給羽化3 d內(nèi)的煙粉虱飼喂10 μmol/L雷帕霉素誘導(dǎo)自噬后第5天時,煙粉虱雌成蟲和卵子內(nèi)Rickettsia豐度均顯著降低(Shanetal., 2021)。BtVg和Rickettsia存在直接互作(Bruminetal., 2020),并且在煙粉虱卵子發(fā)生過程中,Rickettsia在卵巢內(nèi)的分布呈動態(tài)變化(Shanetal., 2021)。然而,BtVg是否能夠通過誘導(dǎo)煙粉虱自噬影響共生菌的豐度尚不明確。本研究通過采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)研究了BtVg和自噬對煙粉虱共生菌Rickettsia豐度的影響,明確BtVg能夠保護(hù)Rickettsia免受自噬的降解。研究結(jié)果有助于增進(jìn)對煙粉虱-Rickettsia互作機(jī)制的認(rèn)識,為闡明煙粉虱調(diào)控共生菌增殖的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙粉虱MEAM1隱種由浙江大學(xué)劉樹生教授惠贈,在人工氣候室內(nèi)以“石遠(yuǎn)321”棉花Gossypiumhirsutum為寄主植物維持種群用于實驗。飼養(yǎng)條件:溫度(26±2) ℃,相對濕度60%～80%,光周期14L∶10D?！笆h(yuǎn)321”棉花的種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所陸宴輝研究員惠贈。實驗所用的棉花苗的種植方法為:將顏色均一且顆粒飽滿的棉花種子用10%甲醛水溶液浸泡1 h后,清水沖洗棉花種子2～3次,清水浸泡過夜,種植于營養(yǎng)土(泥炭∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1, m/m)中,每3～4 d澆灌一次肥料(Miracle-Gro),待長出6～8片真葉后,用于接種煙粉虱MEAM1隱種。BtVg蛋白抗體由浙江大學(xué)葉恭銀和王曉偉教授惠贈。表達(dá)GFP的質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)田宏剛老師惠贈。

1.2 dsRNAs合成和顯微注射

通過顯微注射dsBtVg抑制BtVg的表達(dá)?；跓煼凼璏EAM1隱種BtVg(GenBank登錄號: GU332720.1)和GFP(GenBank登錄號: MN623123)序列設(shè)計合成dsBtVg和dsGFP的引物(表1),引物由上海生工生物公司合成。采用PrimerSTAR Max DNA Polymerase擴(kuò)增dsBtVg和dsGFP的目的片段。使用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒合成dsBtVg和dsGFP。利用本實驗室建立的成熟顯微注射技術(shù)體系(Baoetal., 2021; 欒軍波和閆金陽, 2021; Renetal., 2021),將羽化1 d內(nèi)的煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲預(yù)先置于冰上,每頭顯微注射10 nL濃度為1.0 μg/μL的dsBtVg和dsGFP(對照)。注射dsRNAs后,將煙粉虱轉(zhuǎn)移至含棉花葉片的培養(yǎng)皿中,并在培養(yǎng)皿底部放一層1.5%的瓊脂培養(yǎng)基,于光照培養(yǎng)箱[溫度(26±2) ℃,相對濕度60%～80%,光周期14L∶10D]內(nèi)飼養(yǎng)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

顯微注射dsRNAs后,將煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲轉(zhuǎn)移至含棉花葉片的瓊脂培養(yǎng)皿中,在顯微注射3 d時統(tǒng)計死亡率,每個處理設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù),每個生物學(xué)重復(fù)有30頭個體。取顯微注射dsRNAs后3 d時的煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲,采用Trizol法提取總RNA,采用Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(翌圣生物)合成cDNA,利用qRT-PCR檢測煙粉虱BtVg和自噬相關(guān)基因BtAtg8的表達(dá)量,引物序列見表1。qRT-PCR擴(kuò)增體系: cDNA模板2 μL, TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL, ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 40個循環(huán);熔解曲線,95 ℃ 10 s, 65 ℃ 5 s。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù),每個生物學(xué)重復(fù)有10頭個體。煙粉虱BtVg和BtAtg8的表達(dá)量檢測分別以煙粉虱Btactin和BtRPL13為內(nèi)參基因。

1.3 沉默BtVg后煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲Rickettsia豐度的測定

取1.2節(jié)顯微注射dsRNAs后3 d時的煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲單頭提取總DNA,基于共生菌Rickettsia的基因gltA(GenBank登錄號: U59729)序列設(shè)計引物(表1),利用qPCR檢測共生菌Rickettsia的gltA的表達(dá)量,測定Rickettsia的豐度。以煙粉虱β-actin為內(nèi)參基因,qPCR擴(kuò)增體系: DNA模板2 μL, iTaq Universal SYBR Green Supermix 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL, 添加無酶水至20 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 40個循環(huán);熔解曲線: 95 ℃ 10 s, 65 ℃ 5 s。每個處理有10個生物學(xué)重復(fù)。

1.4 沉默BtVg后BtVg, Rickettsia和BtAtg8定位的免疫熒光標(biāo)記觀察

取1.2節(jié)顯微注射RNAs后3 d時煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲,于PBS緩沖液中解剖卵巢和中腸,4%的多聚甲醛固定和0.2% Triton X-100滲透后,用Vg抗體(Guoetal., 2012)、Atg8抗體(Wangetal., 2022)和Rickettsia熒光探針(TCCACG TCGCCGTCTTGC-Cy5)(Gottliebetal., 2006)孵育卵巢管(Ⅱ-Ⅲ級),使用Rickettsia熒光探針孵育中腸,隨后室溫避光條件下用相對應(yīng)的二抗[(Vg-Anti-Mouse IgG (H+L) Alexa-Fluor 594; Atg8-Anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa-Fluor 488)]孵育2 h并用DAPI染細(xì)胞核30 min,用激光共聚焦顯微鏡觀察BtVg和BtAtg8的表達(dá)和定位,以及Rickettsia的豐度。每個處理有3個生物學(xué)重復(fù)。

1.5 雷帕霉素處理后Rickettsia豐度和煙粉虱卵巢管內(nèi)Atg8定位的檢測

收集100頭羽化2 d內(nèi)煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲至飼喂管中,處理組飼喂含10 μmol/L雷帕霉素(用DMSO溶解)的人工飼料(25%蔗糖溶液),對照組飼喂含DMSO的25%蔗糖溶液的人工飼料(Wangetal., 2022),每隔2 d更換一次人工飼料,雷帕霉素處理后5 d時收集個體,于PBS緩沖液中解剖卵巢,固定、滲透后,用BtAtg8抗體孵育卵巢管,激光共聚焦顯微鏡觀察BtAtg8在卵巢管中的表達(dá)和定位,具體方法同1.4節(jié),每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。此外,取雷帕霉素飼喂處理后3和5 d時的個體解剖卵巢提取總DNA,通過qPCR檢測煙粉虱共生菌RickettsiagltA的表達(dá)量,測定Rickettsia豐度,每處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù),每生物學(xué)重復(fù)解剖10頭個體,具體方法同1.3節(jié)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用獨立樣本t檢驗方法對BtVg和BtAtg8的表達(dá)量、Rickettsia的豐度、煙粉虱雌成蟲死亡率和BtAtg8的熒光值進(jìn)行差異顯著性比較。百分比數(shù)據(jù)在分析前轉(zhuǎn)換為反正弦平方根。ImageJ軟件用于熒光值分析。采用STATISTICA v6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。GraphPad軟件用于作圖。

2 結(jié)果

2.1 沉默BtVg后對Rickettsia豐度和煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲死亡率的影響

與注射dsGFP的對照組相比,注射dsBtVg后3 d時BtVg的相對表達(dá)量顯著降低(P=0.0025)(圖1: A),表明BtVg表達(dá)被抑制;Rickettsia的gltA表達(dá)量顯著降低(P=0.00124)(圖1: B),表明Rickettsia豐度顯著降低;同時,煙粉虱雌成蟲死亡率顯著升高 (P=0.011)(圖1: C)。

圖1 顯微注射煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲dsRNAs后3 d時BtVg (A) 和Rickettsia的gltA(B)表達(dá)量以及雌成蟲死亡率(C)Fig. 1 Relative expression levels of BtVg (A) and gltA of Rickettsia (B), and mortality rates of female adults (C) at 3 d after microinjection of dsRNAs into the female adult of Bemisia tabaci MEAM1dsGFP: 對照Control. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;星號表示兩組間差異顯著(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)(t檢驗)。Data in the figure are mean±SE. Asterisks indicate significant difference between two groups (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)(t-test). 下圖同。The same for the following figures.

2.2 沉默BtVg后對Rickettsia在煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲卵巢管和中腸內(nèi)分布的影響

激光共聚焦顯微鏡觀察表明,與注射dsGFP的對照組相比,注射dsBtVg后3 d時煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲Ⅱ-Ⅲ級卵巢管的卵原區(qū)(tropharium)和初級卵母細(xì)胞區(qū)(vitellarium)內(nèi)BtVg的表達(dá)受到抑制,同時Rickettsia的豐度顯著減少,表明BtVg能夠影響Rickettsia在Ⅱ-Ⅲ級卵巢管內(nèi)的定位(圖2: A, B, D, E)。另外,激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),與注射dsGFP的對照組相比,注射dsBtVg后3 d時煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲中腸內(nèi)Rickettsia的豐度減少。與中腸內(nèi)Rickettsia豐度下降程度相比,Ⅱ-Ⅲ級卵巢管內(nèi)Rickettsia豐度下降更顯著(圖2: C, F)。

2.3 沉默BtVg后對BtAtg8在煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲中表達(dá)和在卵巢管中定位的影響

根據(jù)2.1和2.2節(jié)的結(jié)果可知,抑制BtVg表達(dá)導(dǎo)致煙粉虱雌成蟲Rickettsia豐度顯著降低,卵巢內(nèi)Rickettsia的分布減少。為了明確抑制BtVg表達(dá)對Rickettsia豐度和分布的影響是否與自噬有關(guān),qRT-PCR檢測BtAtg8的表達(dá)量和BtAtg8的在卵巢管內(nèi)的定位。結(jié)果表明,與注射dsGFP的對照組相比,注射dsBtVg后3 d時BtAtg8的表達(dá)量顯著提高2.31倍(P=0.0116)(圖3: A),BtAtg8在卵巢中的表達(dá)明顯受到激活(圖3: B)。綜上表明,沉默BtVg誘導(dǎo)煙粉虱自噬。

圖3 顯微注射煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲dsRNAs后3 d時BtAtg8的相對表達(dá)量(A)和BtAtg8(綠色)在卵巢管中的定位(B, C)Fig. 3 Relative expression level of BtAtg8 (A) and localization of BtAtg8 (green) in ovarioles (B, C) at 3 d after microinjection of dsRNAs into the female adult of Bemisia tabaci MEAM1

2.4 雷帕霉素處理煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲誘導(dǎo)自噬后對卵巢管中BtAtg8的表達(dá)和定位以及Rickettsia豐度的影響

與對照(DMSO)相比,飼喂雷帕霉素5 d時,BtAtg8在卵巢管內(nèi)的表達(dá)明顯上調(diào)(圖4: A, B),BtAtg8在煙粉虱卵巢管內(nèi)熒光值顯著升高(P=0.0013)(圖4: C), 表明BtAtg8表達(dá)量升高, 自噬被激活;飼喂雷帕霉素3和5 d時煙粉虱卵巢內(nèi)Rickettsia的gltA表達(dá)量分別顯著降低50%(P=0.0008)和26%(P=0.038)(圖4: D),表明Rickettsia豐度顯著降低。這些結(jié)果提示卵巢Rickettsia豐度降低可能與自噬被激活相關(guān)。

圖4 飼喂煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲含雷帕霉素(10 μmol/L)人工飼料5 d時卵巢管中BtAtg8的定位(綠色)(A, B)和熒光強(qiáng)度(C)以及飼喂3和5 d時Rickettsia的gltA在卵巢內(nèi)的相對表達(dá)量(D)Fig. 4 Localization (green) (A, B) and fluorescence intensity (C) of BtAtg8 in ovarioles at 5 d and relative expression level of gltA of Rickettsia (D) in ovaries at 3 and 5 d after feeding of the female adult of Bemisia tabaciMEAM1 with the artificial diet containing rapamycin (10 μmol/L)DMSO: 二甲基亞砜對照Dimethyl sulfoxide (control); Rapamycin: 雷帕霉素.

3 討論

Rickettsia能夠影響宿主昆蟲適合度(Oliveretal., 2003; Sakuraietal., 2005; Giorginietal., 2010; Majerus and Majerus, 2010; Himleretal., 2011)。本研究發(fā)現(xiàn),沉默BtVg導(dǎo)致煙粉虱Rickettsia豐度降低(圖1: B),煙粉虱雌成蟲的死亡率升高(圖1: C),進(jìn)一步表明Rickettsia可能影響煙粉虱雌蟲存活率。共生菌在宿主昆蟲種群世代間穩(wěn)定地垂直傳播,是協(xié)助宿主昆蟲種群世代適應(yīng)自然環(huán)境的基礎(chǔ)(安鵬等, 2019)。因此,Rickettsia能夠在宿主世代間穩(wěn)定地垂直傳播可能是影響煙粉虱MEAM1隱種雌成蟲存活率的前提。已有研究表明,Rickettsia在煙粉虱體內(nèi)通過兩條途徑侵染卵巢管實現(xiàn)垂直傳播:一是通過內(nèi)吞作用侵入卵巢管的卵原區(qū)后,通過營養(yǎng)索進(jìn)入初級卵母細(xì)胞區(qū);二是通過粘附在含菌細(xì)胞外進(jìn)入初級卵母細(xì)胞(Shanetal., 2021)。本研究發(fā)現(xiàn),沉默BtVg導(dǎo)致煙粉虱雌蟲整蟲Rickettsia豐度降低(圖1: B),卵巢管內(nèi)Rickettsia的分布減少(圖2)。煙粉虱BtVg能夠與Rickettsia互作(Bruminetal., 2020),并且BtVg在含菌細(xì)胞和卵巢管(卵原區(qū)和初級卵母細(xì)胞區(qū))內(nèi)高表達(dá)(Shanetal., 2021; Sunetal., 2023)。此外,果蠅Drosophila共生細(xì)菌Spiroplasma與Vg相互作用,借助VgR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用入卵垂直傳播(Herrenetal., 2013)。推測煙粉虱Rickettsia可能通過與BtVg互作,借助BtVgR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用經(jīng)卵巢傳播。然而,抑制BtVg表達(dá)是否導(dǎo)致Rickettsia入卵受阻還需進(jìn)一步探究。本研究發(fā)現(xiàn),Rickettsia進(jìn)入煙粉虱卵巢管(Ⅱ級)后,抑制BtVg表達(dá)能夠誘導(dǎo)煙粉虱卵巢(Ⅱ級)自噬(圖3),飼喂雷帕霉素激活卵巢管(Ⅱ級)自噬導(dǎo)致卵巢Rickettsia豐度降低(圖4)。這些結(jié)果提示,BtVg可能通過自噬反應(yīng)調(diào)控入卵后的Rickettsia豐度。

共生菌在宿主昆蟲體內(nèi)垂直傳播的過程中,既要突破宿主各組織器官的物理屏障,還需要躲避宿主的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)(Fukatsu, 2021)。一方面,宿主昆蟲為了維持與共生菌之間的共生關(guān)系,需要降低其對共生菌的免疫能力。例如,褐飛虱Nilaparvatalugens為了維持其與類酵母共生菌之間的共生關(guān)系,通過降低雌蟲的免疫相關(guān)基因defensin的表達(dá)量以減弱雌蟲對類酵母共生菌的免疫能力(Baoetal., 2013)。自噬是宿主細(xì)胞抵御胞內(nèi)微生物的重要途徑(Amanoetal., 2006; Joetal., 2013; Paulusetal., 2015)。前期研究發(fā)現(xiàn),BtVg定位于煙粉虱雌成蟲攜帶Portiera的含菌細(xì)胞和攜帶Rickettsia的卵巢(Shanetal., 2021; Sunetal., 2023)。抑制煙粉虱BtVg的表達(dá)后,含菌細(xì)胞內(nèi)Portiera滴度降低(Sunetal., 2023),卵巢內(nèi)Rickettsia的分布減少(圖2)。本研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),沉默BtVg誘導(dǎo)煙粉虱卵巢自噬(圖3),進(jìn)而降低Rickettsia豐度(圖4)。另外一方面,共生菌能夠通過調(diào)節(jié)宿主昆蟲細(xì)胞的自噬反應(yīng)躲避宿主昆蟲免疫反應(yīng)(Chevalieretal., 2012; Voroninetal., 2012)。與攜帶Rickettsia的煙粉虱相比,缺失Rickettsia導(dǎo)致煙粉虱BtVg的表達(dá)水平下調(diào)(Kliotetal., 2019)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制BtVg表達(dá)能夠誘導(dǎo)煙粉虱自噬(圖3),表明BtVg可能通過調(diào)控自噬反應(yīng)的強(qiáng)度維持煙粉虱-Rickettsia共生關(guān)系。